生物技術(shù)與食品安全和品質(zhì)控制課件

1、第七章 生物技術(shù)與食品安全 和品質(zhì)控制 第一節(jié) 生物傳感器及其在食品檢測(cè)分析中的應(yīng)用 由固定化的具有分子識(shí)別功能的生物材料、換能器和信號(hào)處理放大裝置組成的分析工具或系統(tǒng)。（一）生物傳感器的基本組成和分類 1.生物傳感器的基本組成 生物識(shí)別元件：生物傳感器中固定化的酶、微生物細(xì)胞、抗原抗體和組織切片等具有分子識(shí)別能力的生物敏感材料。 換能器：能將在生物敏感材料上進(jìn)行的生化反應(yīng)產(chǎn)生的各種信息轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的裝置。 信號(hào)處理裝置：負(fù)責(zé)信號(hào)的分析處理和放大輸出。一、生物傳感器的基本概念 2.生物傳感器的分類 根據(jù)生物敏感材料可分為酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、免疫傳感器、?xì)胞傳感器、組織傳感器和DNA傳感器。

2、 根據(jù)換能器的不同，可分為電化學(xué)傳感器、介體生物傳感器、測(cè)光型生物傳感器、測(cè)熱型生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器和壓電晶體生物傳感器等。 以上兩種分類會(huì)相互交叉，例如，酶?jìng)鞲衅鞲鶕?jù)換能器的不同又可分為酶電極、酶熱敏傳感器和酶光極等。 具體到某一種傳感器的命名，一般是采用“功能+結(jié)構(gòu)特征”的方法，例如，葡萄糖氧化酶光纖傳感器等。 （二）生物傳感器的工作原理 通過(guò)生物的分子識(shí)別作用，生物傳感器中的生物敏感材料和生物樣品中的待測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合，并進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生離子、質(zhì)子和質(zhì)量變化等信號(hào)，信號(hào)的大小在一定條件下和樣品中被測(cè)物質(zhì)的量存在一定的關(guān)系，這些信號(hào)經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，電信號(hào)再經(jīng)信號(hào)分析處理

3、系統(tǒng)處理后輸出，反映出樣品中被測(cè)物質(zhì)的量。 1.分子識(shí)別（molecular recognition） 生物傳感器中的分子識(shí)別:指生物敏感材料中生物分子能選擇性地和待測(cè)樣品中的待測(cè)成分進(jìn)行特異性（選擇性）結(jié)合的性質(zhì)。生物敏感材料包括酶、抗原（體）等免疫物質(zhì)、微生物細(xì)胞、組織切片和DNA等。 酶的分子識(shí)別:指酶分子只能和特定的底物分子進(jìn)行結(jié)合，而不能和其他分子結(jié)合的特性。酶分子的識(shí)別能力主要是由酶的活性中心決定，其決定了以酶為生物敏感材料的生物傳感器的分子識(shí)別能力。 免疫傳感器的分子識(shí)別：由傳感器上的生物敏感材料抗原或抗體物質(zhì)的分子識(shí)別能力決定，抗原和抗體象酶和底物一樣也能發(fā)生特異性（選擇性）結(jié)

4、合。 DNA傳感器的分子識(shí)別：由DNA分子中堿基對(duì)的互補(bǔ)結(jié)合特性決定。 2.生化反應(yīng)中量的變化和信號(hào)的轉(zhuǎn)換 （1）熱焓的變化及其轉(zhuǎn)換 （2）光效應(yīng)及其轉(zhuǎn)換 （3）顏色的變化及其轉(zhuǎn)化 （4）阻抗的變化及其轉(zhuǎn)換 （5）生化反應(yīng)中其他量的變化及其轉(zhuǎn)化 （6）直接產(chǎn)生電信號(hào) 3.生物放大（biological amplification） （1）酶催化放大 酶是高效專一的催化劑，它可以在很短的時(shí)間內(nèi)催化大量底物的轉(zhuǎn)化，通過(guò)測(cè)定酶所催化反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量可以推測(cè)（判斷）反應(yīng)中比底物減少量或產(chǎn)物增加量少得多的酶量，或與酶相關(guān)聯(lián)的其他物質(zhì)的量，從而實(shí)現(xiàn)生物放大作用。應(yīng)用這一放大原理可以使檢測(cè)方

5、法的靈敏度（最小檢出量）比常規(guī)檢測(cè)方法提高2個(gè)數(shù)量級(jí)。 （2）底物循環(huán)放大 被測(cè)物S1或S2，在酶E1和酶E2之間不斷循環(huán)，每循環(huán)一次，E1和E2都要分別消耗各自的底物C1和C2，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物P1和P2，而循環(huán)過(guò)程中被測(cè)物S1和S2的濃度保持不變，通過(guò)分析C1和C2的消耗量或P1和P2的增加量就可以測(cè)定待測(cè)物S1或S2的量，實(shí)現(xiàn)放大效應(yīng)。循環(huán)的次數(shù)越多酶消耗的底物和產(chǎn)生的產(chǎn)物越多，放大效率也越高（圖）。 （3）酶級(jí)聯(lián)放大 生物體內(nèi)的有些酶（通常為酶原）本身是沒(méi)有活性，在輔酶、另外一種酶或酶的變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑的作用下，酶E1i被激活為酶E1a，E1a激活E2i成E2a，E2a又激活E3i或E

6、3a，由于酶是催化劑可以連續(xù)使用，這樣經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)，一個(gè)分子的輔酶或變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑就能夠產(chǎn)生成千上萬(wàn)分子的E3a，然后E3a催化底物S3產(chǎn)生產(chǎn)物P3，通過(guò)測(cè)定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量就可以靈敏地測(cè)定輔酶或變構(gòu)效應(yīng)物等激活劑的量（圖）。 優(yōu)點(diǎn)：效率極高，對(duì)提高生物傳感器的靈敏度極為有效。 缺點(diǎn)：在生物傳感器中的應(yīng)用條件較為苛刻。 （4）脂質(zhì)體技術(shù) 脂質(zhì)體：由類似于細(xì)胞膜的脂質(zhì)膜構(gòu)成的微球體，在微球體的內(nèi)部包含有被酶、熒光素或電活性物質(zhì)標(biāo)記的抗原或抗體等標(biāo)志物，微球體的外膜上結(jié)合有抗原（抗體），當(dāng)外膜上的抗原（抗體）與待測(cè)的抗體（抗原）發(fā)生反應(yīng)，并和補(bǔ)體結(jié)合時(shí)（或在表面活性劑的作用下），

7、微球體破裂，微球體內(nèi)的標(biāo)志物被釋放。標(biāo)志物的量大且容易測(cè)定，通過(guò)測(cè)定標(biāo)志物的釋放量就可以測(cè)定出待測(cè)抗體（抗原）的量，從而實(shí)現(xiàn)生物放大（圖）。 缺點(diǎn)：目前還存在著微球體內(nèi)的標(biāo)志物容易滲漏和脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差等不足之處。 （四）生物傳感器的特點(diǎn) 1.省時(shí)省力，簡(jiǎn)便快速 2.成本低 3.不需添加試劑 4.靈敏度高 5.體積小 6.易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 7.易于推廣普及 二、生物傳感器中生物敏感材料的固定化和成膜技術(shù)（一）生物材料的固定化技術(shù) 指通過(guò)物理或化學(xué)的方法將酶、微生物細(xì)胞和抗原抗體等生物材料限制在一定的區(qū)間內(nèi)，使生物材料只能在特定的區(qū)間進(jìn)行生化反應(yīng)，而反應(yīng)的底物和產(chǎn)物可以自由擴(kuò)散的技術(shù)。 生物材料

8、常用的固定化方法包括：夾心法、吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法和微膠囊法等（圖）。 （二）成膜技術(shù) 1.半導(dǎo)體生物傳感器中的成膜技術(shù) （1）紫外線照射法 在一個(gè)芯片的兩個(gè)極上均勻涂上（覆蓋）一層活性固定化酶膜，在其中的一極上蓋上光防護(hù)罩，然后以紫外線照射，由于紫外線的穿透能力很差，因此有光防護(hù)罩一極的酶保留活性，而另一極上的酶在紫外線的照射下失活，酶失活的一極就可作為半導(dǎo)體傳感器中的參比（圖）。 （2）光平板印刷法 在一塊芯片上，首先將酶和光敏聚合物（如聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等）的混合溶液涂布于芯片的兩極，形成一層溶液膜,以光防護(hù)物蓋住芯片，在需要有酶膜一極的部位開(kāi)一個(gè)孔，然后以光照射，一定時(shí)

9、間后，開(kāi)孔一極上的光敏聚合物和酶的混合物溶液膜在光的照射下聚合形成固定化酶膜，另一極則仍然為溶液狀態(tài)。將芯片置于溶劑中以超聲波處理，去除未聚合的聚合物溶液和酶，而光聚合后的固定化酶膜仍保留在一極上（圖）。 （3）噴射法 在計(jì)算機(jī)的控制下，芯片在特定噴嘴和戊二醛蒸汽室間來(lái)回運(yùn)動(dòng)，當(dāng)芯片上需要成膜的部位到達(dá)噴嘴處時(shí)，噴嘴將酶和其他高分子材料（例如牛血清白蛋白）的混合溶液滴注在該部位，然后進(jìn)人戊二醛蒸汽室進(jìn)行適度的交聯(lián)成膜。如此重復(fù)數(shù)次，最后將整個(gè)芯片浸入戊二醛溶液中，進(jìn)一步交聯(lián)。 2.L-B膜技術(shù) 一種能在低溫低壓條件下制備高密度、分子排列方向一致的單分子層或多分子層薄膜的技術(shù)。以這種技術(shù)制成的膜

10、以該技術(shù)的發(fā)明者Langmuir和Blodgett的名字命名，稱為L(zhǎng)-B膜。 基本原理：生物大分子，例如脂質(zhì)分子和某些蛋白質(zhì)分子，在特定的條件下，在潔凈的水表面展開(kāi)后能形成水不溶性的液態(tài)單分子膜，小心壓縮表面使液態(tài)膜逐漸過(guò)渡成為一分子厚度的擬固態(tài)膜（圖）。 優(yōu)點(diǎn)：L-B膜可以很?。〝?shù)納米以下），便于傳感器的微型化而且響應(yīng)時(shí)間短。L-B膜的構(gòu)造和生物體內(nèi)的膜構(gòu)造很相似，有較好的仿生價(jià)值，便于制備可以在體內(nèi)使用的生物傳感器。 三、生物傳感器在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用 （一）農(nóng)藥和抗生素殘留的分析 1.農(nóng)藥殘留的生物傳感器檢測(cè) 目前有機(jī)磷農(nóng)藥中的馬拉松、甲基馬拉松、乙基馬拉松、速效磷、久效磷和百治

11、磷等，以及氨基甲酯類農(nóng)藥中的滴滅威、西維因、滅蟲(chóng)多和殘殺威等農(nóng)藥在食品中殘留量的生物傳感器檢測(cè)都有相應(yīng)的研究報(bào)道。 2019年余孝穎等采用離子敏場(chǎng)效應(yīng)管為基礎(chǔ)傳感器（換能器），將乙酰膽堿酯酶通過(guò)戊二醛共價(jià)交聯(lián)固定于場(chǎng)效應(yīng)管上，制備得到了乙酰膽堿酯酶場(chǎng)效應(yīng)管傳感器，用于分析敵敵畏等有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。 原理：乙酰膽堿酯酶能催化乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，當(dāng)存在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留時(shí)，它們能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，從而使底物的分解減少，膽堿和乙酸的產(chǎn)生減少，其中乙酸的減少量可以通過(guò)離子場(chǎng)效應(yīng)管來(lái)測(cè)定，且在一定條件下，乙酸的減少量和有機(jī)磷農(nóng)藥的量之間存在一定的比例關(guān)系，因此根據(jù)乙酸的減少量就可以計(jì)算出有機(jī)磷

12、農(nóng)藥的殘留。 2.抗生素殘留的分析 青霉素和磺胺是獸藥中常用的抗生素，其殘留會(huì)污染動(dòng)物性食品，從而對(duì)人類的健康造成危害。 Sternesioes等人采用免疫傳感器測(cè)定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量，靈敏度達(dá)到1ngg，傳感器表面經(jīng)NaOH和HCl處理后可以重復(fù)使用。 Avon等用抗體酶共軛物為敏感材料結(jié)合光度分析法檢測(cè)了牛奶中青霉素的含量。 （二）食品添加劑的分析 亞硫酸鹽是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸鹽容易引起哮喘，美國(guó)FDA規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等食品中的含量不得超過(guò)110-6molL。 天冬酰苯丙氨酸甲酯，又稱甜味素，是人工合成的低熱量甜味劑。 煙堿酸屬于B族維生素，可以作為肉類食

13、品的發(fā)色劑，但是人體攝入過(guò)量的煙堿酸會(huì)引起瘙癢和頭痛等中毒癥狀，在日本已禁止使用。 其他食品添加劑，如防腐劑苯甲酸鈉、羥基苯甲酸鈉、過(guò)氧化氫，抗氧化劑抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、兒茶酚、兒茶酚胺，發(fā)色劑亞硝酸，酸味劑磷酸和乳酸等都可以用相應(yīng)的生物傳感器來(lái)檢測(cè)它們?cè)谑称分械暮俊?（三）污染微生物的檢測(cè) 污染食品的微生物可以分為腐敗菌和病原菌。腐敗菌主要是通過(guò)對(duì)食品成分的分解和破壞，同時(shí)產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)從而對(duì)人體造成危害。腐敗菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破壞食品的組成成分外，其菌體本身也能使人致病。 食品中污染微生物的檢測(cè)方法通常是平板計(jì)數(shù)法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，特別是對(duì)于病原菌的檢測(cè)，有

14、時(shí)長(zhǎng)達(dá)l-2周才能出結(jié)果，因此各種快速檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，生物傳感器檢測(cè)方法就是其中的一種。 1.腐敗菌的檢測(cè) 釀酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢桿菌等是常見(jiàn)的食品腐敗菌。 2.病原菌的檢測(cè) 常見(jiàn)的污染食品的病原菌有沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌等。這些病原菌按常規(guī)的檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間很長(zhǎng)，而采用生物傳感器則能迅速地測(cè)定它們的數(shù)量。 用來(lái)測(cè)定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和DNA生物傳感器。 目前，上述病原菌都可以用相應(yīng)的生物傳感器來(lái)測(cè)定。 （四）生物毒素的檢測(cè) 污染食品的生物毒素主要包括細(xì)菌毒素、真菌毒素、藻類毒素以及動(dòng)植物毒素，其中以

15、細(xì)菌毒素和真菌毒素最為常見(jiàn)。 檢測(cè)毒素的方法包括色譜法（氣相色譜、液相色譜、薄層層析等）和生物學(xué)方法等，這些方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)樣品的前處理復(fù)雜繁瑣。以免疫學(xué)方法和生物傳感器檢測(cè)方法為代表的各種快速方法備受歡迎。 1.細(xì)菌毒素的分析 細(xì)菌毒素是由細(xì)菌分泌產(chǎn)生于細(xì)胞外或存在于細(xì)胞內(nèi)的致病性物質(zhì)，有內(nèi)毒素和外毒素之分。 內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分之一的脂多糖，熱穩(wěn)定，抗原性差，不能轉(zhuǎn)化為類毒素，毒性比較弱，毫克水平才能引起動(dòng)物死亡。 外毒素：細(xì)菌（主要是革蘭氏陽(yáng)性菌，也有少數(shù)革蘭氏陰性菌）分泌于胞外的一種蛋白質(zhì)，熱穩(wěn)定性差，抗原性強(qiáng)，能轉(zhuǎn)化成類毒素，毒性很強(qiáng)，微克水平就能引起動(dòng)物死亡。

16、目前研究報(bào)道主要集中在運(yùn)用免疫生物傳感器分析檢測(cè)肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等細(xì)菌外毒素。運(yùn)用生物傳感器能靈敏、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)到它們?cè)诨鹜群湍逃偷仁称分械暮俊?2.真菌毒素的分析 真菌毒素是真菌分泌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。常見(jiàn)的污染食品的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭霉素、雜色曲霉素、T-2毒素、腐馬素、鐮刀菌烯醇類毒素、展青霉素和橘霉素等。 檢測(cè)食品中污染真菌毒素的方法主要有薄層層析法和液相色譜法等。近二十多年來(lái)免疫學(xué)方法在真菌毒素的檢測(cè)中得到了較好的應(yīng)用，以此為基礎(chǔ)的免疫生物傳感器快速檢測(cè)真菌毒素的方法也有研究報(bào)道和應(yīng)用，其中以免疫傳感器用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1和腐馬素B1的研究報(bào)道最多。此外

17、，也有運(yùn)用微生物傳感器和以纖毛蟲(chóng)為生物敏感材料的傳感器檢測(cè)展青霉素、黃曲霉毒素B1和T-2毒素的研究報(bào)道。 3.其他生物毒素的檢測(cè) 也有用于檢測(cè)食品中污染的動(dòng)植物毒素。 （五）食品新鮮度的分析 1.魚(yú)鮮度傳感器 魚(yú)死亡后，魚(yú)肉中ATP（三磷酸腺苷）在ATP酶的作用下分解成ADP（二磷酸腺苷），ADP在磷酸激酶的作用下分解產(chǎn)生AMP（一磷酸腺苷），AMP在AMP脫氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為IMP（肌苷酸），IMP在5-核苷酸酶的作用下分解成HxR（肌苷），HxR在核苷磷酸化酶的作用下分解成Hx（次黃嘌呤），Hx在黃嘌呤氧化酶的作用下分解成尿酸。即： ATPADPAMPIMPHxRHx尿酸 根據(jù)魚(yú)死亡后，

18、魚(yú)肉中ATP分解代謝后各種代謝產(chǎn)物之間的比例關(guān)系，即K值或K1值也能很好地評(píng)判魚(yú)的新鮮度。 K值：指上述ATP代謝產(chǎn)物中，肌苷和次黃嘌呤占ATP代謝產(chǎn)物總量的百分?jǐn)?shù)。即：K（%）=（HxR+Hx）（ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx）100 魚(yú)死亡后ATP、ADP和AMP的代謝非常快，一般在很短的時(shí)間（24h）內(nèi)，它們?cè)隰~(yú)肉中的含量就幾乎為零，而一般在市場(chǎng)上出售的魚(yú)都是死亡24h以后的魚(yú)，K值可簡(jiǎn)化為K1值。即： K1（%）=（HxR+Hx）（IMP+HxR+Hx）100 目前日本等國(guó)已制訂了根據(jù)K值或Kl值判斷魚(yú)新鮮度的標(biāo)準(zhǔn)，也成功研制了測(cè)定K值或K1值的各種生物傳感器。按照日本的

19、標(biāo)準(zhǔn)，K10.2時(shí)，魚(yú)的品質(zhì)極好，Kl=0.2-0.4時(shí)，魚(yú)品質(zhì)較好。 （1）多電極傳感器系統(tǒng)。主要由四根氧電極組成，其中一根作為參照，另外三根電極的表面分別固定有黃嘌呤氧化酶膜，核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，5-核苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶膜，測(cè)定時(shí)將四根電極同時(shí)放入樣品液中，上述三根酶電極產(chǎn)生的電信號(hào)分別反應(yīng)了樣品液中Hx的濃度，（HxR+Hx）的濃度和（IMP+HxR+Hx）的濃度，通過(guò)計(jì)算機(jī)處理很容易計(jì)算出K1的大小。 運(yùn)用該傳感器，只需20-50L樣品液，8min就可以測(cè)定K1值。 （2）多酶電極傳感器系統(tǒng)。首先將5-核苷酸酶、核苷磷酸化酶與黃嘌呤氧化酶固定在一氧電極上，形成

20、多酶電極。測(cè)試時(shí)，樣品液先經(jīng)過(guò)一離子交換柱，使IMP、HxR和Hx分開(kāi)，然后分別流經(jīng)有多酶電極的測(cè)試室，根據(jù)樣品中不同組分流經(jīng)測(cè)試室時(shí)電信號(hào)的響應(yīng)情況，運(yùn)用計(jì)算機(jī)分析計(jì)算出K1值。 除了測(cè)定K1值，也有通過(guò)生物傳感器測(cè)定魚(yú)肉中胺類物質(zhì)的變化來(lái)反應(yīng)魚(yú)新鮮度的研究報(bào)道。另外，采用微生物傳感器測(cè)定魚(yú)鮮度的研究也有報(bào)道。 2.肉鮮度傳感器 和魚(yú)肉一樣，其他肉類也可以通過(guò)生物傳感器來(lái)測(cè)定其鮮度。Kurube等人將單胺氧化酶固定于氧電極上組成了測(cè)定豬肉鮮度的酶?jìng)鞲衅鳎搨鞲衅鞯捻憫?yīng)時(shí)間為4min,檢測(cè)的線性范圍為510-6-1010-6mo1L。Kress等人研制開(kāi)發(fā)出一種測(cè)定肉鮮度的匕首式生物傳感器，測(cè)

21、定時(shí)將傳感器的探頭插入肉表面2-4cm深度，通過(guò)測(cè)定葡萄糖的濃度來(lái)評(píng)價(jià)肉的鮮度。 3.牛乳鮮度傳感器 主要通過(guò)測(cè)定牛乳中的微生物數(shù)量，牛乳的乳酸增加量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量等來(lái)評(píng)價(jià)牛乳的鮮度。 第二節(jié) 免疫學(xué)技術(shù)與食品安全檢測(cè) （一）抗原（antigen） 指進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)能刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，從而引起動(dòng)物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞，并能和抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。 1.抗原的分類和基本屬性 半抗原（hapten）:不能刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體，只能和對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，即只有免疫反應(yīng)性，無(wú)免疫原性的抗原。一、抗原與抗體 完全抗原（complete anti

22、gen）：既具有免疫原性又具有免疫反應(yīng)性的抗原。 超級(jí)抗原（superantigen）：有些物質(zhì)，例如某些細(xì)菌毒素，具有非常強(qiáng)的免疫刺激能力，通?？蛇_(dá)到一般抗原刺激能力的2000倍，只需極低的濃度就可以誘發(fā)極大的免疫反應(yīng)。 免疫原性（immunogenicity）:指抗原進(jìn)入體內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞的特性。 免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）:指抗原能和對(duì)應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。 2.抗原決定簇（antigenic determinant） 或稱為抗原表位，是位于抗原物質(zhì)分子表面或者其他部位的具有一定組成和結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)基團(tuán)，能與免疫系統(tǒng)中淋巴

23、細(xì)胞上的受體及相應(yīng)的抗體分子結(jié)合，是免疫原引起機(jī)體特異性免疫應(yīng)答和免疫原與抗體特異性反應(yīng)的基本構(gòu)成單位。 在蛋白質(zhì)抗原中，3-8個(gè)氨基酸殘基可以構(gòu)成一個(gè)抗原決定簇，在多糖抗原中3-6個(gè)呋喃環(huán)可以組成一個(gè)抗原決定簇。 從結(jié)構(gòu)上抗原決定簇可以分成順序決定簇和構(gòu)象決定簇。 順序決定簇（sequential determinant）：又稱為連續(xù)決定簇，氨基酸的排列順序決定著這類決定簇的功能基團(tuán)。 構(gòu)象決定簇（conformational determinant）：又稱為不連續(xù)決定簇，是依賴于蛋白質(zhì)天然空間構(gòu)象的決定簇，這類決定簇通常由不連續(xù)的氨基酸順序片段經(jīng)肽鏈的折疊卷曲而成，一般位于蛋白質(zhì)的表面。

24、研究抗原的決定簇不僅可以揭示抗原與抗體結(jié)合的本質(zhì)，有助于更好地了解免疫學(xué)中的核心問(wèn)題免疫識(shí)別和應(yīng)答的機(jī)制，而且可以人工合成某些抗原決定簇，這對(duì)于研制疫苗和特異性診斷試劑，以及藥物合成和抗病毒感染等方面都有很大的益處。 3.抗原的分類 根據(jù)來(lái)源抗原可分為天然抗原、人工抗原和合成抗原等三類。 天然抗原：是天然的生物、細(xì)胞及天然產(chǎn)物，主要來(lái)自動(dòng)物、植物和微生物，例如血細(xì)胞、細(xì)菌和病毒、蛋白質(zhì)、多糖、脂類和核酸等都可以是天然抗原。 人工抗原：指人工化學(xué)改造后的抗原，例如半抗原經(jīng)化學(xué)改造后就是人工抗原。 合成抗原：指化學(xué)合成的具有抗原性質(zhì)的分子，主要是氨基酸的聚合物。 4.抗原的制備 （1）抗原的準(zhǔn)備。

25、對(duì)微生物細(xì)胞等顆粒狀抗原，只需對(duì)微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后收集菌體即可。對(duì)蛋白質(zhì)、多糖、DNA和脂類等可溶性膠體抗原，應(yīng)根據(jù)其在生物細(xì)胞中的部位進(jìn)行處理。存在于細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)首先應(yīng)破細(xì)胞壁，使它們釋放出來(lái)，然后收集含有這些物質(zhì)的溶液，再采用各種分離、提取和純化方法進(jìn)行分離和提取。對(duì)于分泌于細(xì)胞外的這些高分子物質(zhì)則只需收集胞外液，然后再進(jìn)行分離純化即可。 （2）半抗原的改造。通常是將牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OV）或人工合成的多聚氨基酸等連接在半抗原分子上，增加其相對(duì)分子質(zhì)量，從而使其轉(zhuǎn)化成完全抗原（例子見(jiàn)書(shū)）。 將各種半抗原轉(zhuǎn)化成完全抗原的具體操作方式和注意事項(xiàng)各不相同，但是有一點(diǎn)必須注

26、意，即在操作過(guò)程中應(yīng)盡可能保持半抗原結(jié)構(gòu)的“完整性”，不能過(guò)度破壞其結(jié)構(gòu)，以保持半抗原的“原始性”。 （二）抗體（amtibody, Ab） 1.抗體的定義、分布和分類 由抗原刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)分泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）。 抗體主要存在于動(dòng)物血清中，也存在于動(dòng)物的其他體液和體外分泌液，例如乳汁和細(xì)胞分泌液中。另外，抗體還存在于某些細(xì)胞中。 根據(jù)Ig的理化特性和與抗原結(jié)合方式的不同，Ig可以分為類和亞類。 2.抗體的結(jié)構(gòu) 一個(gè)抗體分子通常包括兩個(gè)完全相同的輕鏈分子（1ight chain）和兩個(gè)完全相同的重鏈（heavy chai

27、n）分子，輕鏈分子大約由210個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為2.3104；重鏈分子大約由450個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為5.0104。這4條鏈在氫鍵和二硫鍵（S-S）作用下連在一起，形成“Y”字形結(jié)構(gòu)。 在“Y”字形的兩個(gè)支角上，重鏈和輕鏈的N端區(qū)域在一起形成抗原的識(shí)別位點(diǎn)。有一段大約110個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域隨抗體結(jié)合特異性的不同而變化，這端區(qū)域叫可變區(qū)。除可變區(qū)外，抗體分子上還有恒定區(qū)。 3.抗體的制備 （1）多克隆抗體的制備 以抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以獲得含有特異性抗體的血清，即抗血清?？寡逯械目贵w是由不同的抗原決定簇刺激不同的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生，這種抗體又稱為多克隆抗體。制備多克隆

28、抗體包括： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇。用于制備多克隆抗體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括哺乳類的鼠、兔、羊、馬、驢、豚、鼠、豬、猴、狗和禽類的雞、鴨、鴿子，以及兩棲類的蛙等，其中最為常用的是鼠、兔和羊等。 在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)首先應(yīng)考慮抗原的來(lái)源和免疫動(dòng)物的親緣關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，兩者的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)則產(chǎn)生的抗體效價(jià)越高，相反則抗體的效價(jià)越差。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡和營(yíng)養(yǎng)狀況與抗體的產(chǎn)生也有密切的關(guān)系，年齡太小易產(chǎn)生免疫耐受；而年齡過(guò)大或營(yíng)養(yǎng)不良則動(dòng)物的免疫能力低下，也不易產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。 選擇好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，在注射抗原前應(yīng)采集少量的動(dòng)物血清（陰性血清）和抗原進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)，選擇不和抗原反應(yīng)的動(dòng)物進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。 抗原的處理。除了前面敘述

29、的抗原的分離提純和半抗原的改造外，對(duì)于可溶性抗原，在注射免疫動(dòng)物之前通常還需和免疫佐劑進(jìn)行混合（顆?？乖话銦o(wú)需和佐劑混合，可以直接注射），以提高抗原的免疫原性等。 佐劑（adjuvant）：是具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，延長(zhǎng)抗原在機(jī)體內(nèi)的半衰期，降低抗原毒副作用，以使機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)抗血清的物質(zhì)。最常用的佐劑是福氏佐劑，它分為完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑。 不完全福氏佐劑：由1-6份的液體石蠟和1份羊毛脂充分混合而成。 完全福氏佐劑：在不完全福氏佐劑的基礎(chǔ)上，于使用前添加滅活的（2-20mgmL）卡介苗混合而成。 動(dòng)物的免疫。動(dòng)物的免疫是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，在免疫過(guò)程中，對(duì)抗原的免疫劑量、注射

30、途徑、加強(qiáng)免疫的時(shí)間間隔和加強(qiáng)免疫的次數(shù)等都需要認(rèn)真綜合考慮。 抗原的劑量應(yīng)根據(jù)抗原的免疫原性強(qiáng)弱、動(dòng)物的種類和大小以及抗原的注射途徑等來(lái)決定。對(duì)于同一種抗原，在一定的劑量范圍內(nèi)，抗原的注射量與免疫反應(yīng)的強(qiáng)度成正相關(guān)，抗原量過(guò)大或過(guò)小都易產(chǎn)生免疫耐受。免疫動(dòng)物越大一次注射抗原的量也越多，小鼠一次注射的免疫乳液量為1-2mL，家兔的為2-4mL。 常用的抗原注射途徑包括靜脈、脾臟、淋巴結(jié)、腹腔、肌肉、皮下和皮內(nèi)等，它們對(duì)抗原的收速度為靜脈脾臟淋巴結(jié)腹腔肌肉皮下皮內(nèi)。 腹腔注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、皮下注射和淋巴結(jié)注射適合于任何抗原，這些途徑主要是通過(guò)刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答，初次免疫和加強(qiáng)免疫

31、都可以使用。靜脈注射只適合于可溶性抗原和分散的單細(xì)胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發(fā)的免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。脾臟注射比較適合于微量抗原。 抗血清的采集、純化和特性鑒定。抗體的分離純化方法很多，包括中性鹽沉淀法、凝膠柱層析、離子交換柱層析和親和層析等。 對(duì)收獲后的抗血清或純化后抗體的一些參數(shù)，例如效價(jià)、親和力和交叉反應(yīng)等進(jìn)行分析非常必要。 效價(jià)又稱為滴度（titer）：在一定條件下，抗血清經(jīng)系列稀釋后與定量的抗原反應(yīng)，以能檢測(cè)出抗血清存在的抗血清的最大稀釋倍數(shù)，是表達(dá)抗血清中特異性抗體相對(duì)含量的一個(gè)指標(biāo)。 親和力（affinity）：表示抗原抗體結(jié)合程度的指標(biāo)，親和力的大小可以用抗原抗體反應(yīng)的平衡

32、常數(shù)K來(lái)表示。 抗血清的交叉反應(yīng)：衡量抗體特性的另一個(gè)重要的指標(biāo)。理論上講，抗體只能與產(chǎn)生該抗體的抗原發(fā)生反應(yīng)，這是抗體特異性的表現(xiàn)，但實(shí)際上抗體還可以和其他抗原發(fā)生反應(yīng)，即所謂的交叉反應(yīng)。一方面是由于抗原的不純?cè)斐?，另一方面不同抗原間相同或類似的抗原決定簇也是產(chǎn)生交叉反應(yīng)的原因。 完全沒(méi)有交叉反應(yīng)的抗體是不存在的，但是交叉反應(yīng)太強(qiáng)的抗體沒(méi)有應(yīng)用價(jià)值。 （2）單克隆抗體（monoclonal antibody）的制備 制備原理：免疫致敏后的B淋巴細(xì)胞具有分泌特異性抗體的能力，但是在體外不能長(zhǎng)期存活；而骨髓瘤細(xì)胞可以在體外長(zhǎng)期存活但不能產(chǎn)生抗體；如將兩種細(xì)胞雜交融合后，經(jīng)分離篩選獲得既能在體外長(zhǎng)

33、期存活又能針對(duì)單一抗原決定簇產(chǎn)生特異性抗體的融合子，就可以獲得單克隆抗體。單克隆抗體是通過(guò)B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞雜交獲得，單克隆抗體制備技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)。 單克隆抗體的制備 小鼠骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備。小鼠骨髓瘤細(xì)胞有很多不同的株系，我國(guó)最為常用的是SP20和NS-1。 細(xì)胞的融合和融合者的篩選。通常骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞是在聚乙二醇（PEG）的促進(jìn)下進(jìn)行融合的，也可以采用電融合的方式進(jìn)行融合。 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的檢出和單克隆化。采用酶聯(lián)免疫吸附法和放射免疫分析法等方法將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞檢測(cè)出來(lái)。 單克隆抗體的擴(kuò)大培養(yǎng)。生產(chǎn)大量單克隆抗體的方法目前常用的主要有小鼠腹水制備、大瓶培養(yǎng)和中空

34、纖維反應(yīng)器培養(yǎng)，前者僅適合于實(shí)驗(yàn)室制備單克隆抗體，后兩者適用于工廠化生產(chǎn)大量的單克隆抗體。 單克隆抗體的性質(zhì)的鑒定：獲得單克隆抗體后，和多克隆抗體一樣，也需對(duì)其效價(jià)、親和力和交叉反應(yīng)（特異性）進(jìn)行分析。另外，還需對(duì)免疫球蛋白的類和亞類以及結(jié)合位點(diǎn)等進(jìn)行分析。 （3）生物工程抗體（biological engineering antibody） 應(yīng)用生物工程技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行定向改造獲得的抗體。 抗體的化學(xué)修飾：運(yùn)用雙功能交聯(lián)劑將同位素、酶、毒素和藥物等連接在抗體的Fc片段上，抗體和抗原的特異性結(jié)合發(fā)生在抗體的Fab片段上，交聯(lián)后并不影響抗體與抗原的結(jié)合，交聯(lián)（標(biāo)記）后的抗體可以作為診斷試劑，也可以

35、作為藥物的定向載體，引導(dǎo)藥物或毒素到達(dá)抗原存在部位，使藥物或毒素發(fā)揮更有效的作用，即所謂的“生物導(dǎo)彈”。這樣可以大大減少藥物和毒素等在腫瘤等治療過(guò)程中的毒副作用，提高治療效果。 抗體基因文庫(kù)（antibody recombination library）：將不同重鏈和輕鏈的基因隨機(jī)組合，克隆到適合的表達(dá)載體中，在原核細(xì)胞中表達(dá)不同的抗體，從而形成一個(gè)抗體文庫(kù)，運(yùn)用抗原可以從中篩選到相應(yīng)的抗體基因。 抗體基因的改造（antibody gene modification）：將不同來(lái)源的抗體基因進(jìn)行重組，可以獲得所需要的抗體。 催化性抗體或抗體酶：具有催化活性的抗體。 抗體酶和酶一樣具有底物和立體專

36、一性，在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和競(jìng)爭(zhēng)抑制等方面也和酶相似。二、常用的免疫學(xué)方法（一）免疫學(xué)方法的分類 抗原抗體的特異性結(jié)合可以發(fā)生在生物體內(nèi)也可以發(fā)生在體外，用于食品衛(wèi)生和安全檢測(cè)的免疫學(xué)方法都是抗原抗體的體外反應(yīng)，通常都需要使用含有特異性抗體的血清，這些方法又稱為血清學(xué)反應(yīng)或血清學(xué)方法。 根據(jù)給出的檢測(cè)結(jié)果是定性的還是定量的，免疫學(xué)方法（血清學(xué)方法）可以分為定性免疫學(xué)方法和定量免疫學(xué)方法。 定性免疫學(xué)方法：能給出分析樣品中是否含有某種特定的抗原或抗體，或者特定抗原或抗體的含量是否高于或低于某一數(shù)值。 定量免疫學(xué)方法：能給出樣品中特定的抗原或抗體的準(zhǔn)確數(shù)量。 根據(jù)免疫分析過(guò)程中是否需要將結(jié)合在一起的抗原抗

37、體復(fù)合物和沒(méi)有結(jié)合的游離的抗原抗體分離開(kāi)來(lái)，免疫學(xué)方法可以分為均相免疫學(xué)方法和非均相免疫學(xué)方法。 均相免疫學(xué)方法：無(wú)須將抗原抗體的復(fù)合物和游離的抗原抗體分開(kāi)，一般在較短的時(shí)間內(nèi)就可以得到分析結(jié)果，操作比較簡(jiǎn)便，但是通常靈敏度較低，一般僅適合于定性分析。 非均相免疫學(xué)方法：需要將抗原抗體復(fù)合物和游離的抗原抗體等物質(zhì)分開(kāi)，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，操作比較復(fù)雜，但是在去除游離抗原抗體的同時(shí)也去除了分析樣品中的一些雜質(zhì)，減少了樣品雜質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的干擾，因此靈敏度和特異性都比較高，適合于定量分析。 根據(jù)免疫反應(yīng)過(guò)程中的現(xiàn)象和特征等，免疫學(xué)方法又包括凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)等。 凝集反應(yīng)：顆粒抗原（例如細(xì)菌、血紅細(xì)胞等）

38、或可溶性抗原（抗體）結(jié)合于不溶性的載體微粒上后與相應(yīng)的抗體（抗原）在適當(dāng)?shù)臈l件下，經(jīng)一定時(shí)間后凝集成肉眼可見(jiàn)的凝聚物。 沉淀反應(yīng)：可溶性抗原（例如蛋白質(zhì)、多糖、類脂或它們的復(fù)合物）與相應(yīng)抗體在適量的電解質(zhì)存在的條件下發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物并出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀，這種可見(jiàn)的沉淀只有在抗原抗體比例適合時(shí)才能形成，在固體（或半固體）載體中這種沉淀表現(xiàn)為沉淀線，在液體中則常表現(xiàn)為絮狀沉淀。 標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)：指抗原（抗體）被酶、同位素和熒光素等標(biāo)記（連接）后與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物量、同位素的放射性強(qiáng)度或熒光素產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來(lái)計(jì)算抗原抗體的結(jié)合量，進(jìn)而計(jì)算出待檢測(cè)物質(zhì)

39、（抗原或抗體）量的方法。 根據(jù)標(biāo)記物的不同，標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)可以分為酶免疫分析（enzyme immunoassay）、放射免疫分析（radioimmunoassay）和熒光免疫分析（fluorescent immunoassay）。（二）酶免疫分析方法（enzyme immunoassay） 與熒光免疫方法和放射免疫方法（RIA）相比，酶免疫方法（EIA）有很多優(yōu)點(diǎn)。目前，前面兩種方法正逐步被酶免疫方法所取代。 1.靈敏度 EIA的靈敏度比RIA的更高，用于EIA的酶的檢測(cè)限值可以達(dá)到0.002101811018mol/100min,個(gè)別報(bào)道甚至可以檢測(cè)出一個(gè)酶分子；125I及其標(biāo)志物最低檢測(cè)

40、限值為51018101018mol/100min。 2.對(duì)人的危害 EIA中酶標(biāo)物對(duì)人體和環(huán)境均無(wú)害，使用不受限制；RIA使用的放射性標(biāo)志物對(duì)人和環(huán)境均可能造成危害，使用將可能受到越來(lái)越嚴(yán)格的限制。 3.檢測(cè)儀器 EIA簡(jiǎn)便，可自動(dòng)化也可以半自動(dòng)化，甚至憑肉眼也可以判讀結(jié)果； RIA檢測(cè)儀器價(jià)格較貴，難以自動(dòng)化，肉眼一般不能判斷結(jié)果。 4.試劑的穩(wěn)定性 在合適的保存溫度和介質(zhì)中，酶標(biāo)試劑即使在稀釋的溶液中也可以保存一年至數(shù)年之久；放射性標(biāo)志物由于受到放射性元素半衰期的限制一般保質(zhì)期較短。 5.多樣性 EIA可以用于制備標(biāo)志物的酶種類很多，酶標(biāo)物的種類多。另外，一種酶標(biāo)物由底物的不同又可以產(chǎn)生多

41、種檢測(cè)信號(hào)； RIA可用于制備標(biāo)志物的放射性元素較少，最常用僅有125I。 6.反應(yīng)體系要求 酶標(biāo)物反應(yīng)時(shí)對(duì)pH值、溫度等要求較嚴(yán)格。另外，酶標(biāo)物需要和底物反應(yīng)一段時(shí)間后才能判讀結(jié)果；放射性標(biāo)志物對(duì)反應(yīng)體系的要求不高，可以即時(shí)判讀結(jié)果。 三種方法最本質(zhì)的區(qū)別是標(biāo)記物的不同，熒光免疫分析以熒光素為標(biāo)記物，放射免疫分析以同位素為標(biāo)記物，酶免疫分析以酶為標(biāo)記物。由于標(biāo)記物的不同，具體的分析操作過(guò)程也有許多不同。 三種方法的基本的原理相同，都是以標(biāo)記物（熒光素、同位素或酶）標(biāo)記抗原或抗體，之后和相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，形成帶有標(biāo)記物的抗原抗體復(fù)合物，測(cè)定復(fù)合物中標(biāo)記物產(chǎn)生的各種信號(hào)，即熒光的強(qiáng)度、放射性

42、強(qiáng)度或酶催化底物產(chǎn)生的產(chǎn)物量，在一定的范圍內(nèi)信號(hào)的強(qiáng)弱反映了抗原抗體復(fù)合物的量，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱可以計(jì)算出和標(biāo)記抗原抗體結(jié)合的待測(cè)物（抗體或抗原）的量。 酶免疫方法至少包括酶標(biāo)記免疫方法、非標(biāo)記酶免疫方法和酶免疫電鏡方法。酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）是目前應(yīng)用得最為普遍的一種酶免疫方法。 2.酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA） （1）原理 以96孔、48孔或40孔的聚丙乙烯塑料微孔板（酶標(biāo)板）為載體，在適當(dāng)?shù)臈l件下使抗原或抗體上包被（吸附）在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上成為包被（固相）抗原或抗體，沒(méi)有被吸附（游離）的抗原或抗體通過(guò)洗滌除去。 然后直接加入酶標(biāo)記抗體或抗原形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物固定在微孔或

43、試管，沒(méi)有吸附的酶標(biāo)記物洗滌去除。 加入酶底物溶液（通常沒(méi)有顏色）于微孔中，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色的產(chǎn)物。在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量（也反應(yīng)了固定化的抗原抗體復(fù)合物的量）和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的含量。 （2）分類 直接法（direct ELISA）:指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原的量（圖）。 間接法（indirect ELISA）:將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成

44、復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以反映一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量（圖）。 夾心法（sandwich ELISA）:先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，再用酶標(biāo)的抗體與之反應(yīng)形成抗體抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物；也可以像間接法一樣應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體抗原抗體復(fù)合物結(jié)合形成抗體抗原抗體酶標(biāo)二抗復(fù)合物（圖），前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。 競(jìng)爭(zhēng)法：在抗原抗體反應(yīng)過(guò)程中有競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象的存在。例子：直接法中的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法 （見(jiàn)書(shū)）。 （3）ELISA的操作過(guò)程 試劑的準(zhǔn)備：主要試劑有抗原抗體、酶標(biāo)抗原或抗體、酶和底物等。酶標(biāo)抗原或抗體是ELISA的

45、核心試劑，這些試劑可以自己制備也有現(xiàn)成的試劑（例如酶標(biāo)二抗），可以購(gòu)買(mǎi)。在自己制備酶標(biāo)物時(shí)，除了應(yīng)準(zhǔn)備好純化的抗原和抗體外，還應(yīng)準(zhǔn)備好純化的酶，酶可以自己從動(dòng)植組織或微生物中提取，但過(guò)程復(fù)雜，而且純度和活性通常很難保證，最好從試劑公司購(gòu)買(mǎi)。 酶和抗原或抗體連接方法的基本原理和酶固定化方法的原理相同，常用的方法包括：以戊二醛為交聯(lián)劑的戊二醛法和以過(guò)碘酸鹽為氧化劑的過(guò)碘酸氧化法等。 ELISA中常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、-D-半乳糖苷酶（BG）、脲酶（urease）等，其中HRP和AP應(yīng)用最多。HRP的底物很多，在ELISA中常用是鄰苯二胺與

46、雙氧水和5-氨基水楊酸與雙氧水等。AP常用的底物是對(duì)位硝基酚磷酸酯和酚酞單磷酸酯等。 ELISA的操作過(guò)程：間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定黃曲霉毒素B1（AFB1）。 抗原的包被（antigen coating）。將AFB1與牛血清蛋白（BSA）的連接物AFB1-BSA（也可以是卵清白蛋白的連接物AFBl-OV）溶解于0.1molL pH9.5碳酸鹽緩沖液中，將溶液加入酶標(biāo)板的微孔內(nèi)，通常每孔加200L，4放置過(guò)夜，取出恢復(fù)至室溫，傾去微孔內(nèi)溶液（包被液），以含有0.05%的Tween-20的pH7.0的0.05molL的磷酸鹽緩沖溶液生理鹽水（PBST）滿孔洗滌三次，每次5min，扣干，即得到包被有

47、AFB1-BSA的酶標(biāo)板。在這個(gè)過(guò)程中AFB1-BSA通過(guò)物理吸附包被（黏附）在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上，沒(méi)有包被的抗原洗滌去除。 封阻（blocking）。指酶標(biāo)板被抗原包被后，在微孔中加入一定濃度BSA、OV、明膠或脫脂牛奶等溶液以封阻微孔內(nèi)沒(méi)有被抗原包被的空隙，避免抗體的非特異性吸附于這些空隙，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠度的過(guò)程。常用的封阻劑包括BSA、OV、明膠和脫脂牛奶等，其中以脫脂牛奶較為便宜，而且封阻效果和其他幾種封阻劑沒(méi)有明顯的差別（圖）。 抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)（competitive reaction of antigen and antibody）。在酶標(biāo)板的每個(gè)微孔中加入一定量（

48、例如90L）的適當(dāng)稀釋度的抗體（抗血清），同時(shí)分別加入一定量（例如10L）的不同稀釋倍數(shù)的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，或待測(cè)樣品的抽提液（不同濃度的AFBl標(biāo)準(zhǔn)溶液用于作標(biāo)準(zhǔn)曲線），混勻，37保溫保濕1-2h，包被在酶標(biāo)板上的固定抗原（AFBl-BSA）和添加的AFBl或樣品抽提液中的AFBl等游離抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，HBST洗滌扣干三次，游離的抗原抗體復(fù)合物被洗滌去除。 酶標(biāo)二抗與抗原抗體復(fù)合物的反應(yīng)（reaction 0f second antibodv labeled enzyme and antigen-antibody complex）。將一定量（例如100L）適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)二抗溶液加入各

49、反應(yīng)孔，37保溫保濕1-2h，酶標(biāo)二抗和抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物固定在酶標(biāo)板上，PBST洗滌扣干五次，將游離多余的酶標(biāo)二抗去除。 底物顯色反應(yīng)和吸光值的測(cè)定（color reaction substrate of OD detection）。每孔加反應(yīng)底物100L（40mg鄰苯二胺溶于l00mL pH5.0的0.2mol/L檸檬酸0.1mo1L磷酸氫鈉緩沖溶液，加入150LH2O2,現(xiàn)配現(xiàn)用），37保溫保濕，避光反應(yīng)30min，每孔加50L molL H2SO4終止反應(yīng)。5min后，以酶聯(lián)免疫測(cè)定儀于490nm測(cè)吸光值。 ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線（competitiv

50、e inhibitory curve of ELISA）。以AFBl標(biāo)準(zhǔn)物溶液中的AFBl的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以不同AFB1濃度所對(duì)應(yīng)的吸光值和AFBl濃度為零時(shí)吸光值的比值的百分?jǐn)?shù)（稱為競(jìng)爭(zhēng)抑制率）為縱坐標(biāo)，繪制ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。根據(jù)樣品抽提液的吸光值，利用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算出樣品中AFBl的含量。 （4）ELISA的進(jìn)展 在靈敏度方面，ELISA（包括其他酶免疫方法）的靈敏度依賴于免疫反應(yīng)試劑（主要是抗體）的特異性（specificity）與親和力（affinity）、酶結(jié)合物的比活度（在酶活性一定的情況下主要是酶的結(jié)合量）和酶反應(yīng)產(chǎn)物的可檢測(cè)極限三方面的因素。 近幾年來(lái)，圍繞后兩個(gè)

51、因素開(kāi)展了大量的研究，各種放大系統(tǒng)被引入ELISA中，大大提高了ELISA的靈敏度，拓寬了其檢測(cè)范圍，而且放大系統(tǒng)的引入并沒(méi)有增加ELISA的操作難度，只是在常規(guī)ELISA的基礎(chǔ)上做了一些增添和改進(jìn)，目前這些方法正逐漸成為ELISA的主流方法，代表著ELISA的發(fā)展方向。 生物素親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system, BAS） 通過(guò)提高酶結(jié)合物的比活度，即酶的結(jié)合量來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大，從而提高ELISA靈敏度。 親和素（avidin）是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對(duì)生物素（biotin，是復(fù)合維生素B系統(tǒng)中的一小分子的水溶性因子）有很高的親和力，每個(gè)親和素分子可以和四個(gè)生

52、物素分子結(jié)合，而生物素非常容易和抗體或酶等蛋白質(zhì)結(jié)合，一個(gè)分子的抗體或酶的蛋白質(zhì)可以和多個(gè)生物素分子結(jié)合，并且生物素和蛋白質(zhì)結(jié)合后并不影響它和親和素的親和力。這樣過(guò)BAS可以將大量的酶標(biāo)記物結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上,從而增加檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，提高靈敏度。目前BAS在ELISA中得到了廣泛的應(yīng)用。 由于親和素是pI值較高的糖蛋白，對(duì)以聚苯乙烯為材料的酶標(biāo)板等有較高的非特異性吸附，因此在BAS的ELISA中容易出現(xiàn)一些假陽(yáng)性。最近一種由阿維丁鏈霉菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，具有和親和素相似的性質(zhì)，被稱為鏈親和素（streptavidin），它的pI僅為6.0，其非特異性吸附遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于親和素，近年來(lái)日益受到重視，有取

53、代親和素之勢(shì)。 熒光酶免疫分析（fluorescence enzyme immunoassay） 將熒光底物取代ELISA中的普通底物，熒光底物在酶的催化下產(chǎn)生熒光，通過(guò)測(cè)定熒光的強(qiáng)度來(lái)測(cè)定抗原抗體的反應(yīng)，這樣可以大大地提高ELISA的靈敏度。 目前ELISA中常用的三種酶，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）和-D-半乳糖苷酶（BG）都有相應(yīng)的熒光底物，測(cè)定熒光強(qiáng)度的儀器也得到了很大的改進(jìn)，熒光酶免疫技術(shù)正越來(lái)越被廣泛地采用。 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminessence enzyme immunoassay） 和熒光酶免疫分析一樣，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析也是通過(guò)提高酶反應(yīng)產(chǎn)物

54、的可檢測(cè)極限來(lái)提高ELISA靈敏度的一種方法。本方法將化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)引入酶免疫分析中，通過(guò)測(cè)定光強(qiáng)來(lái)分析抗原抗體的反應(yīng)。和一般的酶免疫方法（ELISA）相比，測(cè)定光強(qiáng)可以提高靈敏度。 除了上述幾種提高ELISA靈敏度的方法外，通過(guò)酶級(jí)聯(lián)放大和酶抗酶抗體復(fù)合物系統(tǒng)也可以提高ELISA的靈敏度。 （五）其他免疫學(xué)方法 免疫學(xué)方法由于具有特異、靈敏和快速等特點(diǎn)而愈來(lái)愈受到重視，目前主要是從提高檢測(cè)方法的靈敏度、縮短檢測(cè)時(shí)間和實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程的自動(dòng)化等幾個(gè)方面來(lái)改良和開(kāi)發(fā)免疫學(xué)方法。 最近幾年Biocontrol公司和Neogen公司相繼先后推出了沙門(mén)氏菌（Salmonella spp.）、李斯特菌（Li

55、steria spp.）、大腸桿菌O157：H7 （Escherichiacoli O157：H7）、彎曲桿菌（Campylobacter spp.）的快速免疫檢測(cè)試劑條（test strip）；Charm公司等推出了快速檢測(cè)黃曲霉毒素的試劑條。這些檢測(cè)產(chǎn)品的推出大大地縮短了檢測(cè)時(shí)間。 檢測(cè)試劑條雖然形狀各異，但是它們的基本組成和檢測(cè)原理是相同的。它們通常以長(zhǎng)條狀的硝酸纖維素膜為支撐物，被膠體金標(biāo)志的抗體吸附（黏附）于膜的一端，其前方有一樣品孔（槽），在膜的另一端分別有一條對(duì)照帶和反應(yīng)帶（在沒(méi)有反應(yīng)前這兩條帶通常是看不見(jiàn)的）（圖）。使用時(shí)，將一定量（通常100L左右）的樣品提取液或微生物的富集

56、液加入樣品槽中和膠體金標(biāo)志的抗體反應(yīng)，并沿纖維素膜向另一端移動(dòng)擴(kuò)散，與反應(yīng)帶和對(duì)照帶反應(yīng)顯色，比較反應(yīng)帶和對(duì)照帶的顏色深淺就可以判斷出食品樣品中是否含有某種有害物質(zhì)（微生物）或其含量是否超標(biāo)。 在快速檢測(cè)方面，Clover公司推出了快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的乳膠檢測(cè)試劑，2min就可以得出結(jié)果。 在免疫檢測(cè)方法的自動(dòng)化方面，近些年來(lái)出現(xiàn)了很多自動(dòng)化的免疫分析儀器，例如BioMerieux公司推出的VIDAS自動(dòng)化免疫檢測(cè)儀。 工作原理:將熒光酶聯(lián)免疫分析所需的所有試劑預(yù)先分裝在同一試劑條的不同孔內(nèi)，然后由儀器自動(dòng)完成整個(gè)分析檢測(cè)的全過(guò)程，加入樣品后，無(wú)需再進(jìn)行人工操作，60min左

57、右就可以給出結(jié)果。 將抗原抗體的特異性反應(yīng)特性和相應(yīng)的儀器相結(jié)合實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化也是免疫學(xué)方法發(fā)展的趨勢(shì)。 三、免疫技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用 （一）免疫技術(shù)在食品污染細(xì)菌及其毒素檢測(cè)方面的應(yīng)用 很早以前，免疫學(xué)技術(shù)在細(xì)菌的病原性和血清型檢測(cè)與鑒定方面就得到了廣泛的應(yīng)用。在食品安全方面，常見(jiàn)的污染食品病原細(xì)菌，例如，沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、志賀氏菌、肉毒梭菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等，都可以通過(guò)免疫學(xué)方法進(jìn)行分析和檢測(cè)。 病原微生物產(chǎn)生分泌于食品中的毒素，例如，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素、肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒毒素、大腸桿菌腸毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生

58、的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素等，也可以用免疫學(xué)方法來(lái)檢測(cè)和分析。檢測(cè)上述病原菌及其毒素的免疫學(xué)方法包括免疫沉淀法、免疫絮凝法、放射免疫分析方法和酶免疫分析方法等各種免疫學(xué)方法。 （二）食品中污染真菌及其毒素的免疫分析 食品中污染真菌的免疫學(xué)分析方法的研究開(kāi)始于20世紀(jì)80年代中期，但是食品中常見(jiàn)的污染真菌的免疫學(xué)檢測(cè)方法大都被研究過(guò)。 到目前為止，食品中常見(jiàn)的污染真菌，已有地霉屬、根霉屬、青霉屬、曲霉屬、鏈格孢霉屬、毛霉屬、擬莖點(diǎn)青霉屬、分枝霉屬、腐質(zhì)霉屬、散囊菌屬、鐮孢霉屬等10多個(gè)屬被研究過(guò)，并獲得了相應(yīng)的特異性抗原和抗體。 食品中污染真菌毒素免疫檢測(cè)方法的研究開(kāi)始于20世紀(jì)60-70年代，起初用于

59、真菌毒素的免疫學(xué)檢測(cè)方法是放射免疫方法。目前真菌毒素的檢測(cè)方法主要是酶免疫方法，20世紀(jì)80年代中后期已有酶免疫檢測(cè)真菌毒素的商品試劑盒銷(xiāo)售。 食品中常見(jiàn)的污染真菌毒素，例如，黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、串珠鐮刀菌毒素、雜色曲霉素、伏馬素、橘霉素和展青霉素等都有商品試劑盒出售，用以檢測(cè)玉米、稻谷、大米、花生、小麥、大麥、棉子、牛奶、肉類及其制品等中污染的各種真菌毒素。 近幾年來(lái)真菌毒素的快速檢測(cè)方法和試劑也相繼問(wèn)世。 （三）食品中農(nóng)藥殘留的免疫學(xué)方法檢測(cè) 食品中的農(nóng)藥殘留包括除草劑殘留、有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯類等殺蟲(chóng)劑的殘留。目前農(nóng)藥殘留的檢測(cè)手段主要是

60、毛細(xì)管氣相色譜和高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)。 免疫學(xué)方法用于食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)和分析的研究大約開(kāi)始于十多年前。由于具有快速、靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、無(wú)須昂貴的儀器設(shè)備和可以在采樣現(xiàn)場(chǎng)分析等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)今農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的主要發(fā)展方向之一，越來(lái)越受到人們的重視。 （四）食品中抗生素殘留的免疫檢測(cè) 食品中的抗生素殘留主要包括：農(nóng)用抗生素、畜用抗生素。 食品中抗生素殘留的分析檢測(cè)方法主要有薄層層析（TLC）、液相色譜（LC）、氣相色譜（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GCMS）、微生物抑制實(shí)驗(yàn)、微生物受體實(shí)驗(yàn)、免疫學(xué)方法以及這些方法相互結(jié)合在一起的衍生方法。例如，微生物抑制實(shí)驗(yàn)和液相色譜結(jié)合在一起的生物色譜。 免疫