結(jié)核病試驗(yàn)室診斷課件

1、結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室涂片鏡檢技術(shù)王 甦 民北京結(jié)核病控制研究所2010年12月結(jié)核病基本情況： （1）結(jié)核病是一個(gè)古老的疾病，至今仍然嚴(yán)重威脅著人類健康。近十幾年來，由于結(jié)核菌的耐藥性、 HIV/TB雙重感染 移民（流動(dòng)人口）問題 使全球結(jié)核病控制工作面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)。全球結(jié)核病告急 據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)目前全球約有：1/3人口（20億）感染結(jié)核菌；2000萬結(jié)核病人；每年有800萬-1000萬新發(fā)病例；每年300萬人死于結(jié)核??；我國(guó)結(jié)核病現(xiàn)狀 我國(guó)的結(jié)核病疫情依然十分嚴(yán)重，是世界上結(jié)核病患病率最高的22個(gè)國(guó)家之一。是耐藥結(jié)核病最多的全球27個(gè)國(guó)家之一。每年新登記的結(jié)核病患者約130萬。我國(guó)結(jié)核病現(xiàn)狀 20

2、00年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào) 查初步結(jié)果顯示：全國(guó)受結(jié)核菌感染人口超過5.6億；全國(guó)現(xiàn)有傳染性肺結(jié)核病人200萬，傳染性肺結(jié)核患病率為157.8/10萬。結(jié)核病死亡率為9.8/10萬，在各種死亡原因中占第11位。結(jié)核菌耐藥率：27.8%，初始耐藥率18.6%，獲得性耐藥率：46.5%。INH:17.6%，SM：17.3%，RFP：16.6%，EMB：1.5%，MDR：10.7%。非結(jié)核分枝桿菌感染：11%我國(guó)結(jié)核病現(xiàn)狀 我國(guó)歷次流調(diào)疫情結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查的重要作用是結(jié)核病臨床診斷和治療的重要依據(jù)是直接發(fā)現(xiàn)病原菌的診斷方法，比影象學(xué)、免疫學(xué)等檢查具有更高的特異性是確定、調(diào)整化療方案的重要依據(jù)是國(guó)

3、家結(jié)核病控制規(guī)劃（NTP）的重要組成部分是發(fā)現(xiàn)傳染源的最主要途徑和手段是考核療效、評(píng)價(jià)防治效果的可靠指標(biāo)分 枝 桿 菌生 物 學(xué) 基 礎(chǔ)概 述結(jié)核分枝桿菌是1882年郭霍（Robert Koch）從肺結(jié)核病人痰標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)。是人類結(jié)核病的主要病原菌。分類結(jié)核分枝桿菌屬原核生物界、厚壁菌門、裂植菌綱、放線菌目、分枝桿菌科的分枝桿菌屬，分枝桿菌屬種類甚多，目前已命名的有200多種，一般可分為緩慢生長(zhǎng)和快速生長(zhǎng)兩大類。概 述分枝桿菌呈分支狀生長(zhǎng)， 營(yíng)養(yǎng)要求比普通細(xì)菌高，是一種生長(zhǎng)緩慢的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。經(jīng)石炭酸復(fù)紅染液著色后，不被鹽酸酒精脫色，故稱此類細(xì)菌為抗酸菌。分枝桿菌分類結(jié)核分枝桿菌結(jié)構(gòu)結(jié)核分枝桿

4、菌組成：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核物質(zhì)細(xì) 胞 壁厚度為1035nm，較一般細(xì)菌的細(xì)胞壁厚。含有大量脂類，具有堅(jiān)韌性和疏水性。功能：保護(hù)細(xì)菌的固有形態(tài)抵抗酸堿物質(zhì)及宿主細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的破壞和 殺傷如果細(xì)胞壁有缺陷，細(xì)菌只能在高滲環(huán)境下生存，則稱此類細(xì)菌為L(zhǎng)型細(xì)菌。細(xì) 胞 膜細(xì)胞壁內(nèi)層圍繞于細(xì)胞質(zhì)外的富于彈性的半透膜。主要成分是脂類（磷脂）和蛋白質(zhì)。功能：細(xì)菌與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換在細(xì)胞內(nèi)一系列代謝活動(dòng)中起重要作用 菌 體 成 分脂類多糖蛋白質(zhì)核酸鹽類 脂 類（1）結(jié)核菌體脂類含量比其他細(xì)菌高，占細(xì)胞壁干重的60，是引起結(jié)核病特征性變化與表現(xiàn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。脂質(zhì)含量與細(xì)菌毒力相關(guān)，毒力強(qiáng)的Mtb含脂最高。

5、脂質(zhì)只要有磷脂、脂肪酸、蠟質(zhì)等成分，多與蛋白質(zhì)、多糖以結(jié)合形式存在。脂 類（2）磷脂：刺激機(jī)體單核細(xì)胞增生，增強(qiáng)菌體成分誘導(dǎo)機(jī)體致敏作用。索狀因子：與Mtb毒力密切相關(guān)。硫脂蠟質(zhì)：占脂質(zhì)總量48，分A、B、C、D。結(jié)核菌酸：促進(jìn)機(jī)體形成結(jié)核結(jié)節(jié)。分支菌酸：為結(jié)核菌菌體的重要成分，與結(jié)核菌的抗酸性有關(guān)。多 糖由阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等組成。多以脂類、蛋白質(zhì)和核酸等結(jié)合形式存在。是免疫反應(yīng)的重要抗原物質(zhì)。蛋 白 質(zhì)Mtb含多種蛋白質(zhì)組分，由不同菌體蛋白及活菌在分泌過程中分泌于細(xì)胞外的多種蛋白組成。結(jié)核菌的主要抗原性物質(zhì)。結(jié)核菌素、PPD為多種蛋白的復(fù)合抗原，可刺激機(jī)體免疫

6、應(yīng)答。核 酸RNA含量比DNA高45倍。RNA分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，DNA存在于細(xì)胞核物質(zhì)中。DNA是遺傳物質(zhì)，將遺傳信息傳給子代，并指導(dǎo)RNA的合成。RNA是蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞成分合成必須的物質(zhì)。結(jié)核分枝桿菌基因組結(jié)核分枝桿菌DNA中約含4000個(gè)基因組。結(jié)核分枝桿菌為2.5109道爾頓, 卡介苗株為2.8109道爾頓結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組全序列共含4.4106堿基對(duì)，平均鳥嘌呤+胞嘧啶含量（GC）為65.6。鹽 類鈣、鉀、鎂、鐵、磷等，約占菌體成分的 6。 營(yíng)養(yǎng)與發(fā)育結(jié)核菌是需氧菌，但在含有比較低氧的環(huán)境下也能生存，比如骨結(jié)核，淋巴結(jié)核。在少量二氧化碳的環(huán)境中生長(zhǎng)的也很好。結(jié)核菌生長(zhǎng)的適宜溫

7、度和人體相近為370C結(jié)核菌生長(zhǎng)所必需的元素有氧、碳、氮、氫、磷、鉀、鎂等。結(jié)核分枝桿菌形態(tài)結(jié)核菌是兼性需氧菌，無鞭毛、莢膜，無運(yùn)動(dòng)能力；形狀：0.3 - 0.61 - 4微米的細(xì)長(zhǎng)桿狀，直或稍彎，鏡下常堆積成團(tuán)、成束、排列雜亂無章，也有呈串珠樣、鏈狀、索狀者。革蘭氏染色陽(yáng)性，萋-尼氏染色鏡下的抗酸桿菌為淡蘭色背景下的紅色或粉紅色細(xì)長(zhǎng)桿菌。熒光染色鏡下的抗酸桿菌在暗色背景下呈黃綠色或橙色熒光?？顾嵝允欠种U菌的重要特征。其化學(xué)基礎(chǔ)是分枝菌屬的細(xì)胞壁脂質(zhì)含量較高，并含有大量分枝菌酸。抗酸性與細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性關(guān)系密切，若菌體自溶（如標(biāo)本保存時(shí)間過長(zhǎng)、溫度過高）、結(jié)核菌的異型相（如：L-型菌、干酪

8、或膿液中的結(jié)核菌）可能失去抗酸性?？?酸 性生 長(zhǎng) 特 性生長(zhǎng)適宜溫度37C，PH6.8-7.2。營(yíng)養(yǎng)要求較高。在常用的羅氏（Lowenstein-Jensen）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皺折，呈顆粒、結(jié)節(jié)或菜花樣，乳白色或米色，不透明。結(jié)核菌生長(zhǎng)緩慢，在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要10多小時(shí)，根據(jù)接種菌量的多少，一般10-30天肉眼可見菌落生長(zhǎng)。 結(jié)核病的診斷 診斷發(fā)展階段：經(jīng)驗(yàn)性、X線影像，細(xì)菌學(xué)診斷、免疫學(xué)（細(xì)胞、體液）診斷、分子生物學(xué)診斷。 控制結(jié)核病的流行，診斷是所有措施中最為關(guān)鍵的一步。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查包括細(xì)菌學(xué)檢查以及近年來在分子生物學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域建立的檢

9、測(cè)新技術(shù)。細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病確診和治療的主要依據(jù)。檢測(cè)新技術(shù)為可疑結(jié)核病患者的早期診斷與合理治療帶來新的希望。結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷結(jié)核病細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室布局原則1、結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查要有獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室，不得與其他實(shí)驗(yàn)室混用，最好為P3級(jí)實(shí)驗(yàn)室；2、培養(yǎng)基制備、洗刷等相對(duì)潔凈的操作與涂片鏡檢、培養(yǎng)前處理、藥敏試驗(yàn)等污染操作要有獨(dú)立分開的場(chǎng)所，最好分別在專用的房間進(jìn)行；3、基層只從事涂片鏡檢的實(shí)驗(yàn)室只擁有一間獨(dú)立房舍的情況下，相對(duì)潔凈區(qū)（鏡檢區(qū)、登記區(qū)）與污染區(qū)（涂片、染色區(qū)）要有明顯區(qū)分?；鶎隅R實(shí)驗(yàn)室布局范例染色池收集標(biāo)本用的桌子工作臺(tái)采光用窗戶（固定）實(shí)驗(yàn)室門試劑柜顯微鏡記錄用的桌子可以開關(guān)的窗戶廢棄標(biāo)本和

10、污染物的處理廢棄標(biāo)本、痰盒和污染物均須經(jīng)高壓蒸汽滅菌后方能丟棄或清洗；如需焚燒處理，須置于焚燒爐內(nèi)徹底焚化。焚化不徹底或暴露焚燒是危險(xiǎn)的；專業(yè)化處理試驗(yàn)操作工作面應(yīng)以3%石炭酸或其他可靠的消毒液擦拭，再用紫外線滅菌燈照射2小時(shí)主要方法1、痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)2、分枝桿菌分離培養(yǎng)技術(shù)3、分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)4、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)技術(shù)5、分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)痰標(biāo)本采集 (一)容器：采用WHO推薦的國(guó)際通用螺旋蓋痰瓶，或可密封塑料盒、蠟紙盒收集痰標(biāo)本（參考規(guī)格：直徑4 cm，高度2 cm）。容器上應(yīng)清晰標(biāo)注患者姓名、病例號(hào)、檢查項(xiàng)目。 痰標(biāo)本采集 (二)按采集的時(shí)間，可將標(biāo)本分為三類 即時(shí)痰：就診時(shí)

11、深呼吸后咳出的痰液； 晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液； 夜間痰：送痰前一日，患者晚間咳出的痰液； 合格的痰標(biāo)本：應(yīng)是患者深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物。包括干酪痰、粘液痰和血痰。 對(duì)疑似肺結(jié)核病者，臨床醫(yī)護(hù)人員應(yīng)通過解釋，使其充分了解標(biāo)本性狀、質(zhì)量對(duì)相應(yīng)檢查項(xiàng)目的重要性，示范并指導(dǎo)其掌握從肺部深處咳痰的方法；如患者識(shí)字，可提供宣教材料。 痰標(biāo)本采集 (三)如何正確留痰 查痰對(duì)于結(jié)核病的診斷是非常重要的，通過痰檢可以知道您是否痰中帶菌。如果痰中帶有結(jié)核菌說明您患有肺結(jié)核，具有傳染性，應(yīng)該及時(shí)遵醫(yī)囑治療。 送檢痰標(biāo)本的質(zhì)量直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。請(qǐng)您一定按照下列要求和

12、方法留取合格的痰標(biāo)本。每個(gè)痰盒應(yīng)分別留取12口痰，請(qǐng)不要將1口痰分開放到2或3個(gè)痰盒中。正確的咳痰方法： 1、咳嗽前應(yīng)緩慢地深吸氣，吸氣后稍屏氣片刻。 2、軀干略向前傾，兩側(cè)手臂屈曲，平放在兩側(cè)胸壁下部，內(nèi)收并稍加力。 3、咳嗽時(shí)腹肌用力快速收縮，使腹壁內(nèi)陷。一次深吸氣，可連續(xù)咳嗽三聲。 4、停止咳嗽后，收縮腹肌將剩余的氣體盡量呼盡。 5、重復(fù)緩慢吸氣動(dòng)作或平靜呼吸片刻，準(zhǔn)備再次咳嗽的動(dòng)作。* 注意：部分人如果忽然深吸氣容易誘發(fā)咳嗽，您可以嘗試緩慢或分幾次吸氣，爭(zhēng)取肺泡內(nèi)充分充氣，以增加咳嗽的效率。在這一過程中，要注意動(dòng)作的連貫性，一氣呵成。同時(shí)，也可以叩擊前胸，或由家屬協(xié)助叩擊后背胸壁。這樣

13、震動(dòng)支氣管內(nèi)的分泌物，能夠增加咳嗽排痰的力度。 患者留取的痰標(biāo)本，應(yīng)由檢驗(yàn)人員或經(jīng)過培訓(xùn)的專人目視檢查標(biāo)本性狀質(zhì)量(特別是用于初次診斷的痰標(biāo)本)：標(biāo)本量一般在35 ml，標(biāo)本性狀屬于干酪痰、褐色血痰或含少量新鮮血液的血痰、粘液痰者為合格的標(biāo)本；唾液為不合格標(biāo)本。 確定診斷檢查時(shí)痰標(biāo)本不合格者，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)予以進(jìn)一步指導(dǎo)并要求其重新送檢。 進(jìn)行AFB涂片檢查時(shí)應(yīng)在登記本和檢驗(yàn)報(bào)告單上注明標(biāo)本性狀，以供分析結(jié)果時(shí)參考。 痰標(biāo)本采集 (四)痰標(biāo)本采集 (五)注意：由于當(dāng)患者咳嗽、咳痰時(shí)，易產(chǎn)生含有結(jié)核菌的氣溶膠，感染周邊人群的機(jī)率較高，故采集痰標(biāo)本時(shí)應(yīng)在遠(yuǎn)離人群的開放空間進(jìn)行，或在通風(fēng)良好的室內(nèi)進(jìn)行。

14、1、干酪痰：標(biāo)本外觀以黃色(或奶酪色)、膿樣、團(tuán)塊狀的肺部分泌物為主，粘度較粘液痰低，制片時(shí)較易涂抹；涂片染色后鏡檢，可發(fā)現(xiàn)大量膿性炎癥細(xì)胞、肺上皮脫落細(xì)胞。由于此類標(biāo)本是由肺部深處咳出，對(duì)肺結(jié)核的診斷最有價(jià)值，故AFB的檢出率較高。痰標(biāo)本性狀 (一)痰標(biāo)本性狀 (二)2、血痰：此類標(biāo)本是因粘液痰或干酪痰標(biāo)本中混有血液而形成，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲；涂片染色后鏡檢除能夠觀察到粘液痰或干酪痰的細(xì)胞特征外，含新鮮血液的標(biāo)本中可見到被染色的血細(xì)胞。由于含血標(biāo)本易干擾AFB鏡檢的結(jié)果，故在制片時(shí)應(yīng)盡量避免挑取含血標(biāo)本。 3、粘液痰：標(biāo)本外觀以白色、粘稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主，制片

15、時(shí)需仔細(xì)涂抹；涂片染色后鏡檢時(shí)，鏡下可見支氣管內(nèi)膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞(細(xì)胞較長(zhǎng)且形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色均較深，細(xì)胞一端可見著色較淺的纖毛)，伴有少量肺上皮脫落細(xì)胞(多數(shù)形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核較小且著色較細(xì)胞質(zhì)深，核質(zhì)比大于 1:3)、膿性炎癥細(xì)胞(卵圓形、細(xì)胞核占細(xì)胞比例較大且著色較深，核質(zhì)比低于 1:1)、口腔脫落細(xì)胞及口腔寄生菌。此類標(biāo)本的AFB檢出率較唾液高。 痰標(biāo)本性狀 (三)痰標(biāo)本性狀 (四)4、唾液：目視觀察標(biāo)本整體外觀，以透明或半透明水樣、粘度較低的口腔分泌物為主，標(biāo)本中有時(shí)伴有氣泡；涂片染色鏡檢時(shí)，鏡下可見少量口腔上皮脫落細(xì)胞(形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核著色較細(xì)胞質(zhì)深，核質(zhì)比接近或大

16、于 1:2)和口腔內(nèi)寄生菌，有時(shí)可見食物殘?jiān)?由于此類標(biāo)本進(jìn)行AFB檢查時(shí)的檢出率很低，用于對(duì)患者確定診斷時(shí)是不合格的標(biāo)本。抗酸染色原理分枝桿菌等抗酸菌菌體成分含脂類物質(zhì)較多(如：結(jié)核分枝桿菌，細(xì)菌菌體干重的60是脂類成分) ，且細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。分枝桿菌細(xì)胞壁中的分枝菌酸在苯酚的滲透性助染作用下，與首染染料(如復(fù)紅) 結(jié)合牢固，能夠耐受酸性酒精的脫色；因而抗酸菌可以保持首染染料的顏色。與之相反，非抗酸菌和絕大多數(shù)人體細(xì)胞由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和菌體成分的限制，在首染染料染色后，容易被酸性酒精脫色，經(jīng)復(fù)染后成為復(fù)染染料的顏色。細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法操作流程涂痰膜自然干燥復(fù)紅加熱初染5分鐘自然干燥鏡

17、檢流水沖洗美蘭復(fù)染30秒鹽酸酒精脫色流水沖洗流水沖洗細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法顯微鏡檢報(bào)告方式：0條/300視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陰性1-8條/300視野：實(shí)報(bào)菌數(shù)3-9條/100視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（+）1-9條/10視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（2+）1-9條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（3+）10條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（4+）（一）為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴(yán)禁油鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。（二）仔細(xì)觀察300以上的視野。（三）每個(gè)工作日，一名鏡檢人員的玻片閱讀量一般不應(yīng)超過25張。（四）連續(xù)閱讀1012張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。鏡檢讀片痰涂片抗酸菌濃度與陽(yáng)性結(jié)

18、果機(jī)率 檢出菌數(shù) 每毫升標(biāo)本估算菌數(shù) 陽(yáng)性結(jié)果機(jī)率0/100或更多視野 1000 101-2/300視野 5000 - 10000 501-9/100視野 約30000 801-9/10視野 約50000 90（cv）1-9/每視野 約100000 96.2（cv）10或更多/每視野 約500000 99.95（cv）查痰次數(shù)與陽(yáng)性機(jī)率關(guān)系為什么診斷前強(qiáng)調(diào)三涂?jī)膳啵?S 2C） 1 2 3 4 5細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法注意事項(xiàng)：選擇痰標(biāo)本中膿性、干酪樣的部分涂片陽(yáng)性率較高；一張玻片只涂一份標(biāo)本，玻片一次性使用，防止交叉污染；打開痰盒、涂抹痰膜、燒灼接種環(huán)時(shí)容易產(chǎn)生氣溶膠，應(yīng)注意正確操作和自

19、身防護(hù)；石炭酸復(fù)紅初染時(shí)必須加溫。細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法優(yōu)點(diǎn)：是直接發(fā)現(xiàn)原菌的檢查方法，適用于痰、尿、便、體液、組織等幾乎一切標(biāo)本，有重要的臨床診斷價(jià)值。是發(fā)現(xiàn)和確定傳染源的重要途徑，是考核和評(píng)價(jià)療效的重要指標(biāo)，有重要的流行病學(xué)意義；操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，適于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展；快速，數(shù)小時(shí)可報(bào)告結(jié)果。細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法缺點(diǎn)：敏感性低：通常每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽(yáng)性結(jié)果；特異性較低：只能報(bào)告“抗酸菌陽(yáng)性”，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌；鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能辨別死、活菌。 涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng) 室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)本收集、染色液制備、涂片染色程序、顯微鏡鏡檢、顯微鏡的

20、保養(yǎng)和維護(hù)、結(jié)果的報(bào)告和登記、痰片的分類保存等應(yīng)按照國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行操作。復(fù)查方式：自查：試驗(yàn)員當(dāng)日對(duì)已查涂片抽樣復(fù)查。互查：由本實(shí)驗(yàn)室其他試驗(yàn)員抽查當(dāng)日10% 涂片。涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)室間質(zhì)控全國(guó)質(zhì)控系統(tǒng)：以參比實(shí)驗(yàn)室工作網(wǎng)為基礎(chǔ)，以逐級(jí)督導(dǎo)為基本模式，以現(xiàn)場(chǎng)和非現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)為主要方式?，F(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)：上級(jí)實(shí)驗(yàn)室人員赴基層實(shí)驗(yàn)室就實(shí)驗(yàn)室布局、安全防護(hù)、污染物處理、涂片染色操作、顯微鏡維護(hù)狀況、日常實(shí)驗(yàn)記錄等進(jìn)行考核和指導(dǎo)，并以盲法、按比例抽取涂片復(fù)查。非現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)：防治人員依據(jù)盲法、按比例的原則抽取涂片交實(shí)驗(yàn)室復(fù)查。一、實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估（一）目的：實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估是相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)條件的調(diào)查

21、總結(jié)和質(zhì)量提高的基本手段之一。建立相關(guān)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)檔案：由被督導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室填寫結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室基本情況登記表，每次現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)時(shí)需重新核實(shí)登記內(nèi)容。調(diào)查相關(guān)實(shí)驗(yàn)室QA措施的制度和執(zhí)行情況；調(diào)查相關(guān)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備狀態(tài)及安全防護(hù)情況；調(diào)查操作人員對(duì)相關(guān)檢查程序的認(rèn)知和掌握程度；調(diào)查相關(guān)實(shí)驗(yàn)室影響AFB檢查質(zhì)量的因素并提出相應(yīng)質(zhì)量提高措施、督導(dǎo)改正。 結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室基本情況登記表單 位 名稱： 實(shí)驗(yàn)室名稱： 主 任 姓名： 電話： 手機(jī)： 單 位 地址： 郵 編： 傳真： E-mail： 1.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員登記 姓名性別年齡學(xué)歷專業(yè)職稱工作年限專(兼)職備注2.上一年實(shí)驗(yàn)室工作量統(tǒng)計(jì)：玻片總張數(shù)陰性玻片數(shù)陽(yáng)性玻片

22、數(shù)玻片陽(yáng)性率現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估調(diào)查程序 1.試劑檢查的問題 指 標(biāo) 試劑名稱試劑名稱試劑名稱現(xiàn)有的染色劑是否都可以使用？最近3個(gè)月是否試劑短缺？使用的試劑是否在有效期內(nèi)？石碳酸復(fù)紅是 否是 否亞甲藍(lán)是 否是 否5%鹽酸乙醇是 否是 否鏡油是 否是 否如有填寫“否”的項(xiàng)目，請(qǐng)簡(jiǎn)要說明原因： 2. 耗材保障指 標(biāo)原料可用性質(zhì)量是否優(yōu)良充分供應(yīng)下列原料是否可以得到？痰盒規(guī)格是否標(biāo)準(zhǔn)？玻片盒是否符合規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)？是否數(shù)量足夠？近3個(gè)月是否供應(yīng)短缺？有否有蒸餾水？水是否保存在無菌瓶子里？ 玻片是 否是 否儲(chǔ)片盒是 否是 否是 否標(biāo)準(zhǔn)痰盒是 否是 否玻片記號(hào)筆是 否是 否是 否 竹（木）簽是 否是 否是 否漏斗是 否是

23、 否濾紙是 否是 否染色架是 否是 否是 否燈或燃器是 否是 否燈用燃料是 否是 否擦鏡紙是 否是 否紅筆是 否供水是 否是 否是 否天平是 否是 否 3、實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)檢查的問題 指 標(biāo)結(jié) 果痰涂片檢查在哪里進(jìn)行？ 在一個(gè)與其他實(shí)驗(yàn)室隔開的地方進(jìn)行；有保證涂片和鏡檢獨(dú)立操作的桌子，有充分的安全通風(fēng)系統(tǒng)是 否實(shí)驗(yàn)室是否通風(fēng)？如果在打開的窗前玻片，技術(shù)員是否知道氣流方向和潛在的危險(xiǎn)？是 否用哪種消毒劑？使用針對(duì)TB的消毒劑是 否近3個(gè)月有消毒劑短缺嗎？消毒劑供應(yīng)充足是 否實(shí)驗(yàn)室多長(zhǎng)時(shí)間消毒一次？工作的地方應(yīng)當(dāng)每天清潔消毒是 否用過的玻片怎樣處理？是否重復(fù)使用？已經(jīng)涂抹過標(biāo)本的玻片不允許重復(fù)使用是

24、 否用過的痰容器怎樣處理？是否重復(fù)使用？痰容器為一次性使用，用過的痰容器應(yīng)銷毀是 否是否有生物危害廢物桶？使用有蓋的生物危害廢物桶是 否是否有實(shí)驗(yàn)室防護(hù)服？在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)穿穿好防護(hù)服是 否離開實(shí)驗(yàn)室前是否應(yīng)該脫掉實(shí)驗(yàn)服？實(shí)驗(yàn)服不能穿出實(shí)驗(yàn)室以外是 否實(shí)驗(yàn)室是否使用手套？手套是否合格？應(yīng)戴符合所從事安全工作要求的防護(hù)手套，是 否試驗(yàn)結(jié)束后是否洗手？遵守正確的洗手程序是 否實(shí)驗(yàn)室是否有上下水?實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)有上下水，并設(shè)獨(dú)立洗手池是 否實(shí)驗(yàn)室是否潔凈有序?干凈整潔，物品擺放有序是 否下班后，是否關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室門窗？是否例行安全檢查？關(guān)閉好門窗，巡視檢查，確保安全后離去是 否實(shí)驗(yàn)室有否通風(fēng)？如果在打開的窗前玻片

25、，技術(shù)員是否知道氣流方向和潛在的危險(xiǎn)？操作人員應(yīng)背對(duì)來風(fēng)方向是 否如有填寫“否”的項(xiàng)目，請(qǐng)簡(jiǎn)要說明原因：所有痰檢室僅一間，且做其它檢驗(yàn)項(xiàng)目；操作時(shí)未戴防護(hù)手套；蔡甸區(qū)無上下水4、顯微鏡 檢查的問題指 標(biāo)結(jié)果是否有顯微鏡？數(shù)量是否充分？至少有一臺(tái)專用于分枝桿菌檢查的顯微鏡，還有另外的顯微鏡備用。 是 否顯微鏡功能是否正常？隨機(jī)鏡檢，通過顯微鏡能觀察到清晰的視野，機(jī)械調(diào)節(jié)性能良好。是 否顯微鏡工作場(chǎng)所合適嗎？場(chǎng)所能夠適當(dāng)變更。是 否是否有充足的光源？具備功能良好的燈泡和電源，或顯微鏡放置在適當(dāng)?shù)墓庠?。?否是否常規(guī)維護(hù)顯微鏡？有油鏡頭,且功能完好整機(jī)干凈清潔，有專人負(fù)責(zé)常規(guī)檢查維護(hù) 是 否如有填寫

26、“否”的項(xiàng)目，請(qǐng)簡(jiǎn)要說明原因：5、用于EQA的玻片保存情況檢查的問題指 標(biāo)結(jié)果所有保存的玻片，是否符合室間質(zhì)量保證計(jì)劃的要求？玻片保存符合室間質(zhì)量保證規(guī)定，所有玻片保存與結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室登記本一致。是 否 所有的玻片是否均保存在玻片盒內(nèi)？玻片盒上是否有標(biāo)記？玻片保存在玻片盒內(nèi)，涂存盒上應(yīng)按室內(nèi)質(zhì)控要求，標(biāo)記實(shí)驗(yàn)序號(hào)和時(shí)間。是 否所有玻片保存之前是否經(jīng)二甲苯處理過？玻片盒內(nèi)玻片有無交叉污染？玻片保存之前必須經(jīng)二甲苯處理，玻片之間無重疊放置。是 否如有填寫“否”的項(xiàng)目，請(qǐng)簡(jiǎn)要說明原因：6、玻片、染色和鏡檢檢查的問題指標(biāo)結(jié)果痰盒上是否有病人標(biāo)記？痰盒上標(biāo)記有病人姓名及痰盒序號(hào)是 否是否使用新的玻片進(jìn)行抗

27、酸桿菌痰涂片？所有的玻片，使用前是否清潔？使用新的玻片進(jìn)行抗酸桿菌痰涂片，玻片使用前要清潔處理是 否玻片上是否有標(biāo)記？玻片按要求標(biāo)記實(shí)驗(yàn)序號(hào)是 否石碳酸復(fù)紅多長(zhǎng)時(shí)間過濾一次？石碳酸復(fù)紅至少每周過濾一次。是 否亞甲基藍(lán)多長(zhǎng)時(shí)間過濾一次？亞甲基藍(lán)至少每月過濾一次，如果玻片上見到沉積物及時(shí)過濾。是 否涂抹一張玻片是否使用一個(gè)新木簽？每張玻片使用一個(gè)新木簽。是 否固定以前，玻片是否在空氣中干燥？固定以前，玻片在空氣中要干燥完全。是 否玻片是否經(jīng)過加熱固定？經(jīng)過火焰35次加熱固定。是 否通常一批染色多少?gòu)埐Ｆ恳慌疃?012張玻片。是 否染色過程是如何進(jìn)行的？用石碳酸復(fù)紅和亞甲基藍(lán)染色要多久？怎么脫色

28、？石碳酸復(fù)紅熱染5分鐘，染色劑不許在玻片上干燥，鹽酸酒精脫色3分鐘，僅必要時(shí)重復(fù)脫色，不要脫色過度，亞甲基藍(lán)復(fù)染30秒鐘是 否染色試劑做質(zhì)量檢測(cè)嗎？試劑必須用已知陽(yáng)性玻片進(jìn)行檢驗(yàn)，至少每月一次是 否顯微鏡多久用擦鏡紙清理一次?檢查完每張玻片之后，均擦干物鏡是 否報(bào)告一個(gè)陰性結(jié)果要觀察多少個(gè)視野？300視野。是 否報(bào)告一個(gè)陽(yáng)性結(jié)果要觀察多少個(gè)視野？應(yīng)當(dāng)檢查足夠多的視野以提供精確的數(shù)量等級(jí)。菌量少時(shí)至少100個(gè)視野。是 否 玻片鏡檢結(jié)果如何報(bào)告？結(jié)果要按國(guó)家結(jié)核病防治規(guī)劃統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)和報(bào)告。是 否7、現(xiàn)場(chǎng)復(fù)檢 A. 現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)時(shí)督導(dǎo)員至少要隨機(jī)抽查3張陽(yáng)性玻片 實(shí)驗(yàn)序號(hào)自檢結(jié)果督導(dǎo)結(jié)果抗酸桿菌染色背

29、景顏色痰或唾液玻片厚度和大小AFB()玻片質(zhì)量評(píng)估圖例(1)涂抹較厚 (AFB)復(fù)紅染色不充分鏡下表現(xiàn) AFB菌體著色淺；AFB菌體異染顆粒不明顯；較規(guī)范染色菌體細(xì)；AFB()玻片質(zhì)量評(píng)估圖例(2)脫色不充分鏡下表現(xiàn)(1) AFB菌體異染顆粒不明顯復(fù)染背景無法展現(xiàn)背景細(xì)胞復(fù)染后顯色較深(呈棕/黑色) AFB()玻片質(zhì)量評(píng)估圖例(3)脫色不充分鏡下表現(xiàn)(2)菌體顏色不同；易造成非抗酸菌的“抗酸性”；AFB()玻片質(zhì)量評(píng)估圖例(3)脫色不充分鏡下表現(xiàn)(3)血痰中白細(xì)胞核出現(xiàn)“抗酸性”；為避免假陽(yáng)性結(jié)果，建議血痰標(biāo)本必須進(jìn)行重復(fù)脫色！AFB()玻片質(zhì)量評(píng)估圖例(4)脫色時(shí)間過長(zhǎng)鏡下表現(xiàn) AFB顏色呈

30、桔黃色AFB菌體/細(xì)胞與背景界線不明顯復(fù)染著色度下降A(chǔ)FB()玻片質(zhì)量評(píng)估圖例(5)復(fù)染時(shí)間過長(zhǎng)鏡下表現(xiàn) 背景著色較深 AFB菌體顏色被遮蓋AFB()玻片質(zhì)量評(píng)估圖例(6)復(fù)檢樣本量計(jì)算表上一年陰性玻片的總數(shù) 玻片陽(yáng)性率2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%300185 129 101 80 67 59 50 400217 143 108 86 70 61 51 500243 154 114 89 71 62 52 700281 167 121 92 75 65 54 1000318 180 128 96 76 66 55 2000376 197 135 100 79 68 56 5000423 208 141 103 80 69 57 10000441 213 142 104 80 69 5720000450 215 143 104 82 69 57復(fù)檢樣本量計(jì)算表說明： a、玻片陽(yáng)性率：指所有檢測(cè)的玻片中陽(yáng)性玻片的比例（平均陽(yáng)性率）。b、上一年陰性玻片總數(shù)：每年玻片的總數(shù)減去全年陽(yáng)性玻片數(shù)