第三代基因測序技術(shù)比較與總結(jié)

1、第三代基因測序技術(shù)比較與總結(jié)摘要在第二代測序技術(shù)的協(xié)助下，個人基因組圖譜正在如火如荼地繪制中。在第二代測序技術(shù)的協(xié)助下，個人基因組圖譜正在如火如荼地繪制中。但第二代測序技術(shù)很快就遇上了強勁的對手一一第三代測序技術(shù)，也被稱為“下、下一代 的測序(n ext -n ext- gen eratio n seque ncin g) ”。第三代測序技術(shù)是基于納 米孔(nanopore)的單分子讀取技術(shù)，有著更快的數(shù)據(jù)讀取速度，應(yīng)用潛能也勢必 超越測序。2012年2月5日，基因組科學(xué)家們齊聚美國佛羅里達州的基因組生物和技術(shù)進展會議，來了解哪家公司的第三代測序技術(shù)能實現(xiàn)人類基因組的3分鐘測序或以5000美元

2、的價格出售。盡管科學(xué)家們對公布的數(shù)據(jù)表示謹慎樂觀，但他們 對于此類測序儀的優(yōu)越之處仍心存疑慮。Complete Geno mics在2008年10月，美國加利福尼亞州的 Complete Genomics公司曾宣稱他們 將在2009年以5000美元的價格售賣人類基因組，但當時沒有公布支持數(shù)據(jù)。在 這次會議上，該公司公布了一個人類基因組，據(jù)稱是用9臺儀器在8天內(nèi)完成的。該公司的CEO Clifford Reid 表示，他們將254GB的數(shù)據(jù)拼接成草圖，覆 蓋某個匿名男性基因組的92%每個堿基平均讀取了 91次。與目前應(yīng)用中的高 速測序，即第二代測序類 似，Complete Genomics也產(chǎn)生

3、短的DNA賣長。通過 對每個堿基的多次測序，它的目標是排除悄悄混入的可能錯誤。Reid認為這項技術(shù)非常準確，堿基錯誤的概率低 于0.33%。這與目前的測序儀相當。Complete Gen omics并不出售測序儀，但用自己的測序儀來完成所有的內(nèi)部 工作。這讓某些科學(xué)家質(zhì)疑，但另一些卻深受鼓舞。速度和費用成為Complete Genomics的最大賣點。該公司并沒有透露基因組 測序的確切費用，但據(jù)稱每個基因組的原材料費用低至 1000美元。它的目標是 在上個月推出市場，今年對1000個基因組進行測序，明年測序數(shù)量達到 20000 個。Pacific Bioscie nces在Complete G

4、enomics做報告前的一小時，Pacific Biosciences的首席技術(shù)官Stephen Turner展示了大腸桿菌的完整基因組，并稱每個堿基的平均讀取 了 38次，準確率大于99.9999%。Pacific Biosciences利用了單分子技術(shù)和DNA聚合酶，在反應(yīng)的同時讀取 測序產(chǎn)物。盡管目前儀器的讀取速度僅為 3堿基/秒，但它的目標是在2013年 前實現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。它還有望實現(xiàn)更長的讀長。 Tuner表示大腸桿菌 基因組的平均讀長是586 bp,有些能達到2805 bp。某些科學(xué)家期望長讀長能排 除錯誤，讓他們了解到難以讀取的部分。Pacific Bioscience

5、s 打算在明年正式推向市場。同時,目前的測序技術(shù), 如lllumina、Applied Biosystems 和Roche也正以驚人的速度制造數(shù)據(jù)，在單 次幾天的運行中產(chǎn)生相當于多個人類基因組的數(shù)據(jù)。 速率不斷增長的同時, 費用 也在下降。例 如， lllumina 在會議中表示它在今年年底能實現(xiàn) 10000美元的人 類基因組測序。要實現(xiàn)單分子實時測序，有三個關(guān)鍵的技術(shù)。第一個是熒光標記的脫氧核苷酸。 顯微鏡現(xiàn)在再厲害， 也不可能真的實時看 到“單分子”。 但是它可以實時記錄熒光的強度變化。 當熒光標記的脫氧核苷酸 被摻 入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在 DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形

6、 成化學(xué)鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記 的脫 氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA 鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第二個是納米微孔。因為在顯微鏡實時記錄 DNAg上的熒光的時候，DNA鏈 周圍的眾多的熒光標記的脫氧核苷酸形成了非常強大的熒光背景。 這種強大的熒 光背景使單分子的熒光探測成為不可能。 Pacific Biosciences 公司發(fā)明了一種 直徑只有幾十納米的納米孔zero-mode waveguides (ZMWs)，單分子的DNA聚 合酶被固定在這個孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標記的脫氧核苷酸 有限

7、，而且由于A, T，C, G這四種熒光標 記的脫氧核苷酸非常快速地從外面進 入到孔內(nèi)又出去， 它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。 而當某一種熒光標記的 脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色 的熒光會持續(xù)一小段時間，直到 新的化學(xué)鍵形成，熒光基團被 DNA聚合酶切除為止(見圖)。第三個是共聚焦顯微鏡實時地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時 進行記錄。由于我對顯微原理的物理知識匱乏，而 Pacific Biosciences 公司又 沒有非常強調(diào)在這方面的發(fā)明，不做進一步探討。他們還對這一技術(shù)進行進一步的優(yōu)化。第一個是把雙鏈DNA環(huán)化反復(fù)測序。人們可以在雙鏈DNA勺兩頭連上發(fā)夾結(jié) 構(gòu)的D

8、NAadaptor，從而使DNA環(huán)化。而DNA聚合酶就能夠以環(huán)化的DNA乍為模 板滾環(huán)復(fù)制，反復(fù)測一段DNA序列。這種反復(fù)測序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復(fù)制錯 誤， 從而使測序精度非常高。第二個是激發(fā)光中斷測序法。DNA聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強大的激發(fā)光 乍用下酶也是有一定壽命的。如果把激發(fā)光中斷一段時間，在這段時間內(nèi) DNA 聚合酶繼續(xù)復(fù)制DNA當激發(fā)光重新開啟以后，人們就可以測到長 DNA1后面的 序列。第三代測序技術(shù)非常可怕。1它實現(xiàn)了 DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度， 一秒可以測10個堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍。2、它實現(xiàn)了 DNA聚合 酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，

9、也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應(yīng)就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基， 但 是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。 這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常 好的條件。 3、它的精度非常高，達到 99.9999% 。此外，它還有兩個應(yīng)用是二代測序所不具備的第一個是直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r觀測，那么以 RNA 為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。第二個是直接測甲基化的 DNA序列。實際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的 速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不

10、同。 根據(jù)這個不同的時間，可以判斷模板的 C是否甲基化。Pacific Biosciences 公司預(yù)計 2010 年或者 2011年就會推出商業(yè)化的測序 儀器。在不遠的將來， 如果他們能和二代測序一樣集成 100萬個納米微孔， 那 么 一臺儀器 15 分鐘就能夠準確地測出一個人的基因組。以后每個人的基因組測序 成本將變成 100美元，人人都可以消費得起。想想人類基因組計劃耗資 30億美 元，費時十幾年，無數(shù)科學(xué)家參與其中，技術(shù)的革新意義是多么重大啊 !Helicos Biosciences并不是每家測序公司都這么幸運。 Helicos Biosciences 制造的第三代測序 儀就被測序錯誤

11、所困擾。就在會議前幾天， Helicos 透露它的第一名顧客已經(jīng)將 測序儀退還。在這次會議上，該公 司表示它已經(jīng)拼接了線蟲的基因組。但是它 的歷史問題和高昂的儀器費用，即使降低至 99.9999 萬美元，與其他測序儀的 50萬美元左右的價格相比，仍然讓 許多科學(xué)家望而卻步。在會議前的研討會上，來自多倫多安大略癌癥研究所的 John McPherson 說 出了大家的心聲：“ Helicos 是單分子測序的先鋒，但我認為他們還沒有達到預(yù) 定的目標?！钡?Helicos 的首席技術(shù)官 William Efcavitch 卻不認同這種說法， “關(guān)于我們不行的傳聞太夸張了”。許多科學(xué)家希望他是對的，

12、他們期待著 Helicos 與其他公司繼續(xù)競爭， 以更 低的價格獲得更多的數(shù)據(jù)。 一位科學(xué)家表示： “這種競爭是良性的。 無論這些公 司干得多好，我們都期望更多?！被诩{米孔的單分子讀取技術(shù)， 英國牛津納米孔公司成功研發(fā)出第三代基因 測序技術(shù)。 該測序技術(shù)讀取數(shù)據(jù)更快、 有望大大降低測序成本， 改變個人醫(yī)療的 前景。當前，基因測序工作費時且昂貴，測序時，分子必須進行多次復(fù)制 （ 這一步 被稱為擴增 ） ，同時進行熒光示蹤標記，這一過程會帶來錯誤，因此，一個基因 要被測序多次才能得到值得信賴的結(jié)果。 此外，購買和操作測序儀器的費用也不 菲，目前，測定一個完整的基因組需要上萬美元。在納米孔測序技術(shù)

13、中，DNA分子依靠被稱為核酸外切酶的蛋白質(zhì)以一次一個 堿基的速度通過小孔。這個酶能清楚地區(qū)分出4個DNA堿基編碼：A、C、G T,也可以檢測出該堿基是否被甲基化，一個單孔能在大約 70 天左右測定一個完整 的基因序列。納米孔技術(shù)不需要熒光標記物并且很可能不需要進行擴增，能直接并快速“讀”出DNA同時足夠廉價，使進行大量重復(fù)實驗成為可能。納米孔公司已經(jīng)研發(fā)出包含幾百個納米孔的芯片， 該芯片可以用在一臺機器 上，快速且廉價地給大量 DNA進行排序?；驕y序于上世紀70年代由弗雷德桑格爾發(fā)明，他因此獲得了諾貝爾獎， 第一份人類基因草圖于 2001年繪制成功，花費了 40億美元。納米孔公司總裁戈登桑赫

14、納說，該技術(shù)預(yù)示了基因測序領(lǐng)域的一個跳躍變 化，花費不到 1000美元就可以完成一個基因測序。 借助該技術(shù)， 在未來 5 年內(nèi)， 測序費用將有可能降至 500美元。到那時，基因測序可以成為英國國民健康保險 制度的一部分，民營保險公司也支付得起。該技術(shù)也可以讓醫(yī)生使用DNA來預(yù)測 并且預(yù)防諸如心臟病、糖尿病等疾病，更加有效地開藥。世界著名基因測序公司lllumi na的總裁杰伊弗拉特利稱，10年后，每一 個新生嬰兒都會被“配備”完整的基因排序，費用不超過 5000美元。最早的 Sanger 測序在人類基因組計劃中立下赫赫戰(zhàn)功，但也給基因組測序 貼上了數(shù)億美元的價格標簽，讓人生畏。這兩年發(fā)展迅猛的

15、第二代測序儀 lllumina 的 GenomeAnalyzer、Roche454 的 GS系列以及 ABI 的 SOLiD系統(tǒng)讓人類基因組重測序的費用蹭地降低到 10萬美元以下。現(xiàn)在，能對單個 DNA分 子進行測序的第三代測序儀也 加入到這場比賽中，讓競爭更加激烈。目前，第三代測序主要有三種技術(shù)平臺。 兩種通過摻入并檢測熒光標記的核 苷酸，來實現(xiàn)單分子測序。 Helicos 的遺傳分析系統(tǒng)已上市，而 Pacific Biosciences準備在明年推出單分子實時（SMRT技術(shù)。第三種 Oxford Nanopore 的納米孔 （nanopore） 測序還尚未有推出的時間表， 但有可能是這三種

16、當中最便宜 的。納米孔測序的優(yōu)勢在于它不需要對 DNA進行標 記，也就省去了昂貴的熒光 試劑和CCD照相機。最近， Oxford Nanopore Technologies 的 Hagan Bayley 及他的研究小組正 致力于改善納米孔。根據(jù)他們之前的工作，他們以a-溶血素來設(shè)計納米孔，并將環(huán)式糊精共價結(jié)合在孔的內(nèi)側(cè)（下圖）。當核酸外 切酶消化單鏈DNA后，單個 堿基落入孔中， 它們瞬間與環(huán)式糊精相互作用， 并阻礙了穿過孔中的電流。 每個 堿基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的電流振 幅，因此很容易轉(zhuǎn)化成DNA 序列。每個堿基也有特有的平均停留時間， 它的解離速率常數(shù)是電壓依賴的， +180 mV的電位能確保堿基從孔的另一側(cè)離開。a-溶血素納米孔（剖面圖）以及共價結(jié)合的環(huán)式糊精（淺藍色）瞬間結(jié)合落入 孔中的堿基 （紅色）。以往對甲基胞嘧啶進行測序， 都要先進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化， 而納米孔技術(shù)能 直接讀出這第五種堿基。這對表觀基因組測序的研究人員來說可謂是個好消息。納米孔測序預(yù)計能滿足大部分測序用戶的需求： 99.8%的準確性相當高，且 錯誤很容易通過計算來糾正。 均