免疫組織化學染色和凋亡檢測技術概述

1、免疫組織化學染色和凋亡檢測技術概述第一節(jié) 常規(guī)組織學染色技術概述 宏觀 微觀 超微結構 基因水平 組織形態(tài)學研究技術的種類： 一、病理大體組織標本的染色方法 在標本制作中，為了某種特殊目的，突出顯示標本的重要部分，借助組織切片的特殊染色方法對標本進行染色，將病變器官及不同組織成分用染料染成不同的顏色，以便于區(qū)分大體標本的不同成分和病變特點，如： 脂肪組織染色法 目的：主要用于心、肝、腎脂肪變性，動脈粥樣硬化大體標本的染色 試劑：蘇丹或蘇丹 結果：病變處脂肪組織呈橙黃色 早期心肌梗死染色法 目的：顯示早期心肌梗死的區(qū)域 試劑：0.1% NBT(硝基四唑藍) / 0.2 mol / L PBS (

2、pH 7.6) 方法：將2-3 mm 厚新鮮心肌大片放入試劑中，37 C 孵育20 min。 結果：正常心肌呈藍色，早期心肌梗死區(qū)、纖維結締 組織、瘢痕組織呈淺藍色或不顯色。 注意 ：新鮮標本，尸檢心肌不超過6小時。 二、光學顯微鏡下的組織學染色方法常規(guī)HE染色（hematoxylin and eosin staining）組織學特殊染色 1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神經(jīng)纖維的鍍銀染色 3. 其他的特殊染色，包括鈣、鐵、鉛、銅、黑色素和脂褐素、細胞DNA和RNA的染色等 上述的各種染色方法只能在細胞水平上顯示組織結構的形態(tài)改變。三、超微結構的觀察光線波長的限制，光學

3、顯微鏡的分辨率極限為m 有效放大倍數(shù)最高不超過2000倍。電鏡的分辨率最佳可達m，放大倍率最高可達100萬倍。 第二節(jié) 免疫組織化學染色技術 Immunohistochemical technique 該技術主要是用于研究和觀察細胞中的某些結構或分子物質(zhì)和組織細胞間的成分，因此現(xiàn)又稱為免疫細胞化學技術。 根據(jù)標記物的不同，免疫細胞化學技術可分為： 1. 免疫酶細胞化學技術 2. 免疫熒光細胞化學技術 3. 免疫鐵蛋白技術 4. 免疫金-銀細胞化學技術 5. 免疫電子顯微鏡技術一、免疫組織化學染色方法的原理抗原（antigen） 1. 定義：是一類在適合條件下能激發(fā)機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，并能

4、與免疫應答產(chǎn)生的效應物質(zhì)（抗體和效應細胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結合反應的物質(zhì)?？乖哂袃煞N性能： （1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子具有誘導機體產(chǎn)生免疫應答的特性。 （2）反應原性（reactogenicity）指抗原分子與抗體或效應 T 細胞等免疫應答產(chǎn)物發(fā)生特異性反應的特性。2. 抗原的分類 完全抗原、半抗原免疫學分類 胸腺依賴抗原與非依賴抗原 外源性抗原：微生物、花粉等 內(nèi)源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫 瘤相關抗原等臨 床 分 類 同種異型抗原：人類白細胞抗原、 血型抗原 異嗜性抗原：人與其他動物、植物 等之間存在的共同抗原抗體（antibody） 1. 定義：機

5、體受到抗原刺激后，通過體液免疫應答，B淋巴細胞活化、增殖，分化為漿細胞，由漿細胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應的球蛋白，稱為抗體。 大部分抗體電泳后位于區(qū)帶，1972年國際免疫學聯(lián)合會正式將化學結構相同或相似的一類球蛋白分子統(tǒng)一命名為免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。 2. 抗體的種類: 五類，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM 免疫組織化學染色技術中，使用的抗體主要是IgG，個別情況下使用IgG的亞型，多為IgG1。免疫組織化學染色的反應原理及顯色原理 1. 免疫組織化學染色的反應原理 染色反應的最基本原理是抗原抗體的反應。 通過對針對標本中相應抗原的抗體上標記某種發(fā)

6、色劑或酶類，再通過激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標本中抗原抗體反應的部位產(chǎn)生肉眼可觀察到的顏色，以確定所要檢測的抗原是否存在。 通過免疫組織化學染色技術，在光學顯微鏡下即可檢測到所要研究的蛋白分子類物質(zhì)的存在與否。2. 免疫組織化學染色的顯色原理 (1) 基本原理 熒光標記或酶標抗體的染色分為直接法和間接法。其中以酶標抗體法應用最為廣泛。 直接法：是將酶直接標記在第一抗體上，用酶標抗體與切片上待檢測的組織或細胞中抗原反應，再用底物顯色，顯示出所檢測的目的抗原的部位。 間接法：是將酶標記在第二抗體或與第二抗體具有親和性的某種分子上，檢測組織或細胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。 間接法中所用的一抗

7、是針對組織或細胞中某種抗原的特異性抗體，多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體或由小鼠制備的單克隆抗體。 第二抗體是第一抗體的抗體，所以只要不同的第一抗體均來自同一種屬動物，與標記的第二抗體結合就能用來顯示不同特異性抗原的存在。這樣可避免直接法中標記每一種第一抗體的麻煩。 通過某種技術增加第二抗體上標記酶的含量，可提高免疫組織化學染色的敏感度。 IHC技術中，絕大多數(shù)以間接法為常用。（2）顯色的基本程序 1抗孵育切片或細胞涂片 2抗（酶標抗體）孵育切片 發(fā)色劑顯色 （核復染）（3）酶標抗體法的顯色原理及顯色劑 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） HRP + H2O

8、2 HRP H2O2 HRP H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O HRP催化的酶促反應第一步是特異的，其余反應是非特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反應的終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如： CN（4-chloro-1-naphthol）為藍色 TMB（tetramethyl- benzidine）為深藍色 AEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）為紅色 DAB（3，3-diamino benzidine）為棕色堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸鹽）為底物，F(xiàn)B/FR (Fast blue/

9、Fast red)為發(fā)色劑，生成藍色 / 紅色不容性沉淀物。 ALP標記的抗體主要用于內(nèi)源性過氧化物酶含量較高的血細胞、淋巴細胞等的ICC染色。 由于組織細胞內(nèi)含有內(nèi)源性ALP，在顯色液中需加入終濃度為2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多數(shù)內(nèi)源性ALP活性可被抑制。葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD ) 以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為-D-葡萄糖67mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯、，37C孵育1小時，生成藍色不溶性沉淀物，該終產(chǎn)物不溶于有機溶劑，切片可經(jīng)脫水、透明后封片，長期保存。 （4）核復染 在顯色后，特別是用DAB顯色后，切片可用蘇木素染料進行核

10、復染，經(jīng)水化后細胞核顯示藍色，與胞質(zhì)中的DAB棕色形成對比。但用AEC顯色后不能用蘇木素做核復染，因為配制蘇木素染料中使用酒精作為介質(zhì)，可使AEC的紅色終產(chǎn)物褪色，且AEC顯色后只能用水溶性封固劑封片。第三節(jié) 免疫組織化學染色步驟（一）ABC或SP法進行石蠟切片染色的主要步驟 1. 組織材料的采??； 2. 組織塊的固定； 3. 組織塊的脫水、透明及石蠟包埋； 4. 石蠟切片的制備； 5. 石蠟切片的脫蠟及水化； 6. 抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性； 7. PBS洗滌切片； 8. 抗原修復或蛋白酶消化切片，修復或暴露抗原； 9. PBS洗滌切片；10.用與二抗來源相同的動物非免疫正常血清（或同時 加

11、入BSA）孵育切片，防止抗體的非特異性吸附；11. 用特異性一抗(單克隆、多克隆)孵育切片；12. PBS（可加入Tween 20#，PBST）洗滌切片；13. 用針對一抗的生物素化的二抗孵育切片；14. 用PBS或PBST洗滌切片；15. 滴加SP試劑或ABC試劑；16. PBS或PBST洗滌切片；17. DAB或AEC顯色；18. 自來水洗滌切片，終止顯色；19. 用蘇木素做核復染；20. 切片脫水、透明，樹膠封片。（二）各染色步驟的具體操作及注意事項1. 組織材料的采取 活檢組織 手術切除標本 尸檢標本 實驗組織或培養(yǎng)細胞 活檢組織：宮頸、鼻咽、口腔、喉、皮膚和內(nèi)窺鏡鉗取的組織 體積小，

12、因活檢鉗直接鉗取，常受壓過度而變性。因此， 活檢鉗的刃口必須銳利，以免組織受壓，活檢時應采取主要的病灶區(qū)。 抗原在組織中的分布不均一，故病灶較大的切除標本應考慮切取主要病灶。病灶與正常組織交界區(qū)及遠距病灶的正常區(qū)。組織標本 尸檢組織 由于取材時一般均已超過死亡后2小時以上，組織有不同程度自溶，其抗原或變性消失或有嚴重的彌散現(xiàn)象。法醫(yī)尸檢一般多在24小時以上，甚至數(shù)月后，檢材受死后變化影響嚴重，而影響染色結果。手術切除的組織較新鮮，取材后應立即固定，以保存組織結構和抗原。實驗動物標本 新鮮，按需要取材；很多情況下是在灌流固定后取材，組織結構和抗原保持良好，非常適用于免疫組織化學染色。取材標本的大

13、小 尸檢組織材料大小以1cm1cm0.2cm 為宜。實驗動物常用大鼠或小鼠，其臟器體積小，有利于取材。一般標本體積不宜過大，防止固定不透，影響抗原的保存，也浪費試劑。 2. 組織塊的固定、水洗（1）固定液：種類較多，常用的有以下2種： 4% 甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法： 10 ml 40% 甲醛 (formalin) + 90ml PBS 使用新鮮甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)，還可形成甲酸，影響染色結果。 4% 多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB

14、 (pH 7.2-7.4)，攪拌、加熱至60 C，同時滴入1N NaOH 至溶液完全透明。冷卻后用1N HCl 調(diào)PH 值至，再用將溶液加至1000ml。 固定時間：一般根據(jù)組織塊大小及性質(zhì)，固定2-24小時。 固定原理：甲醛通過使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。 甲醛與蛋白質(zhì)中的許多氨基酸反應，并能保存脂類和類脂體。 不利作用：甲醛使組織中蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使所檢測的 抗原決定簇被封閉，影響抗原抗體的結合。（2）水洗 沖洗時間與標本的種類、組織塊的大小和固定時 間長短有關。尸檢組織和大動物組織一般沖洗24 小時，小動物組織沖洗210小時。 新鮮標本固定時間短，沖洗時間也相應縮短，固 定時間長

15、的標本，沖洗時間也需延長。 沖洗時組織放在廣口瓶中，瓶口用紗布罩好并扎 緊，防止組織塊漏出。用一根適當?shù)哪z管，一端 接自來水，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或將 組織塊放入洗滌筐中，放在水盆內(nèi)沖洗。 對于過小組織或穿刺組織和小動物組織多次換水 浸泡即可。3. 組織塊的脫水、透明、浸蠟和包埋（1）脫水 脫水劑：酒精、丙酮、異丙醇、正丁醇，最常用酒精。 酒精可以與水以任何比例混合，脫水能力強，并可硬化組織。酒精對組織的穿透速度很快，對組織有較明顯的收縮作用。為避免組織過度收縮，應從低濃度開始，然后再依次增加其濃度。在常溫下或4 C下進行，以減少抗原的損失。 70% 80% 90% 95% 100%

16、100% （2）透明 為使石蠟能浸入組織塊，組織經(jīng)脫水后，必須經(jīng)過一種既能與酒精相溶，又能溶解與石蠟相溶。通過溶劑的媒介作用而達到石蠟浸入組織塊的目的。 透明劑：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用 二甲苯。 一般經(jīng)過23次純二甲苯溶液透明，每次10 15分鐘，同時應根據(jù)組織的種類和組織塊大小以及二甲苯的新鮮程度加以調(diào)整，不應機械照搬。（3）浸蠟 組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟。 為使石蠟充分滲入組織中，常需經(jīng)過23次石蠟浸漬。 用于免疫組織化學染色的組織塊浸蠟應使用低熔點蠟，在60 C以下浸透。（4）包埋 浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔化的石蠟到入包埋盒，冷卻后取出，修塊。4.

17、石蠟切片的制作（1）載玻片涂片的制作 防脫片劑：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚賴氨酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明膠。 APES 涂片的制作 原理：APES是一種新型玻片粘附劑，與一般的粘附劑不同，它是通過對玻璃表面起化學修飾作用，改變其表面的化學物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，不易脫落，保留時間較久。 具體操作方法： 將載玻片用酸處理后，用95%酒精浸泡，再用綢布擦干，清除表面的污漬； 將干凈的載玻片放入丙酮內(nèi)5min； 將載玻片用鑷子夾住浸入APES試劑（1ml APES+50ml丙酮）1 2次

18、； 純丙酮內(nèi)洗2次后，37 C過夜，干燥； 用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。 多聚賴氨酸（Poly-L-lysine，PLL） 試劑配制：PLL 0.5g + 蒸餾水 100 ml 也可根據(jù)提供的方法配制?？捎? C或20C 保存?zhèn)溆?，可反復凍存，效果無明顯影響。 涂片前將其稀釋10 50倍，均勻涂在處理后干凈的載玻 片上，37 C下干燥過夜。甲醛-甘油明膠 試劑：40%甲醛 ，明膠，蒸餾水加至100ml。 配制方法：用一部分蒸餾水（約80ml）加熱溶解明 膠，待完全溶化后加入甲醛，最后補充蒸餾水至 100ml，混勻即可。 粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗原熱修復或酶消化后，

19、有時易脫片。（2）制做切片 切片機：旋轉式或滑動式切片機。 切片厚度：5-7m。 展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展 開切片（水浴鍋上加熱平皿）。 撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。 切片干燥： 37 C過夜，干燥。 5石蠟切片的脫臘及水化 脫蠟：將切片放入染色筐中，二甲苯 、 各15分鐘脫臘， 水化：100%酒精、中各10分鐘、95% ALC 5分鐘、90% ALC 5分鐘、80% ALC 5分鐘、70% ALC 5分鐘，蒸餾水浸洗。6清除內(nèi)源性過氧化物酶活性 由于常規(guī)免疫組織化學染色的最后顯色是用辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和DAB (3,

20、 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)，而組織中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，為防止出現(xiàn)假陽性反應和減少背景染色，需要先清除內(nèi)源性過氧化物酶活性。 染 色 框 具體方法：將切片置入甲醇(PBS)-H2O2 液中2030分鐘 試劑：純甲醇 99 ml 30%+H2O2 1ml 充分混勻，使最后濃 度為0.3%，或0.01ml PBS (pH 7.27.4) 99ml + 30% H2O2 1ml7PBS洗滌切片 經(jīng)甲醇H2O2或PBSH2O2 處理后的切片先用蒸餾水洗一次5min，再用PBS洗5min3次。 0.01mol/L PBS (pH7.27.4) 的配

21、制： NaH2PO4 2H2O 0.45 g Na2HPO4 12H2 蒸餾水 加至1000 ml 為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產(chǎn)生非特異性染色，可在PBS中加入Tween 20#，制成含0.1% Tween 20# 的PBS。Tween 20# 為一種除污劑，可清除和封閉組織中的靜電荷。 8抗原修復（antigen retrieval, AR） 某些抗原的免疫組化染色不需要此步驟即可染色，如橫紋肌中的myoglobin (Mb)、actin、myosin、腦組織中的S-100蛋白、GFAP、血型抗原A、B、H、生長激素(growth hormone)、胰島素、波形蛋白(vimentin)、

22、降鈣素(calcitonin)等。但有一部分抗原物質(zhì)或檢測的因子等由于組織經(jīng)甲醛固定后，因蛋白質(zhì)的交聯(lián)，將抗原封閉或發(fā)生變性，因此需要熱修復或蛋白酶消化。 目前機理不清楚，但是以高溫、高壓對常規(guī)固定的石蠟切片進行抗原修復處理經(jīng)驗表明，可以提高抗原抗體陽性檢測率，同時也會出現(xiàn)假陽性。尤其對原來僅表達在冰凍切片上的抗原，經(jīng)抗原修復后大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上。 （1）抗原熱修復 方 法 微波中 96 1020 min 直接加熱法 100 10 min 高壓鍋 / 消毒鍋 120 10 min 其他：水浴鍋 100 10 min2 及真空加熱 10 min 等。 熱修復的介質(zhì) 0.01

23、 mol/L pH 6.0 檸檬酸緩沖液 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液 (pH 112) 0.01 mol/L pH 7.0 PBS 2 % 硫酸鋁 2 % 硝酸鉛 生理鹽水 蒸餾水 溶液的摩爾濃度對修復效果無任何影響，而pH值則影響較大，緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液較常用。 溫度與修復時間的關系： 許多的實驗結果表明：溫度高修復時間短，如Ki-67和P-gp的檢測，利用同一切片，達到相同染色結果需要： 100 20min； 90 30min； 80 50min； 70 20h 操作流程 微波處理：將切片插入25 片塑料架上，在250 ml塑盒內(nèi)加入200 m

24、l緩沖液，將微波高檔加溫緩沖液至90+，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗，PBS洗。 水浴鍋法：一種傳統(tǒng)的抗原修復方法，首先調(diào)節(jié)水溫達 95左右，將切片置入內(nèi)含200ml緩沖液的塑料盒或燒杯內(nèi)，放入水浴鍋，溫度平衡后開始計算時間20 min，取出容器后自然冷卻到室溫。 壓力鍋法：不銹鋼高壓鍋內(nèi)加入一定量的緩沖液，加熱鍋使液體煮沸，將切片加入切片架并置入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，不加閥，開始冒氣計時50 min，關閉氣閥，使之加壓10 min。再將壓力鍋置于流水槽中沖洗10 min，冷卻后取出切片，PBS洗。 最佳修復方法的選擇 選擇最佳的修復方法設計表 檸檬酸 Buffer pH 12 pH 6 pH 1

25、0-11Tris-HCl Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11微波100 10min2 slide 1 slide 2 slide 3壓力鍋120 10min slide 4 slide 5 slide 6微波或水浴90 30min slide 7 slide 8 slide 9 slide 10 作對照，不作任何處理 抗原熱修復應注意的問題 有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反應，但石蠟切片用抗原修復后卻能很好顯示，對某些應表達在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)修復后，絕大部分表達在核內(nèi)。而有些表達在核內(nèi)的抗原經(jīng)修復后會出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，因此，在使用該方法時一定要小心，對結果的判定也要做出

26、客觀的分析，同時在操作過程中還注意以下問題： 熱處理后應自然冷卻切片。 不能煮干修復液。 不要任何抗原的檢測都使用該方法。 一批抗原的檢測其溫度和時間應保持一致。 一般經(jīng)高溫修復后胞漿無明顯的破壞，但對細胞核的影響較大，會出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染現(xiàn)象。 如果在常用的緩沖（修復）液中無法實現(xiàn)抗原修復，得不出好的染色結果，或經(jīng)修復后，抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液或加一些鰲合劑，如EDTA或EGTA等可能取得較好的效果。 （2）蛋白酶消化法 原理：蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決定簇表面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被酶消化打開而引起暴露抗原決定簇的作用，使第一抗體能與抗原部

27、分結合，提高陽性檢測率。 注意事項：用于IHC切片消化的酶有多種，所選擇酶的種類、使用的濃度、pH值、消化時間及溫度等均要視組織固定的不同、所檢測抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，通過預實驗確定。 常用的消化酶類： 胰蛋白酶和蛋白酶K：檢測細胞內(nèi)抗原切片的消化，如 Keratin、CEA、GFAP等。 胃蛋白酶：細胞間質(zhì)抗原檢測切片的消化，如纖連蛋白 (fibronectin)，各型膠原等。 消化時間及溫度：一般消化時間與組織固定的長短呈正比。蛋白酶的消化時間51020min，視切片固定時間的長短而定。（3）酶消化液的配制 除了商業(yè)銷售的成品，可按說明書使用外，還可自行配制。 0.1% 胰蛋白酶

28、 胰蛋白酶 0.1% 氯化鈣 (pH 7.8) 100 ml 配制方法：先配制0.1%的CaCl2，用的NaOH將其pH調(diào)至，然后加入胰蛋白酶，溶解之。用前將胰蛋白酶液過濾，并在水浴中預熱至37，室溫下消化時間530min，多用于細胞內(nèi)抗原的暴露。 0.4 % 胃蛋白酶 胃蛋白酶 400 mg 0.1N HCl 100 ml 多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化， 37下消化時間約30 min。 0.06 % 蛋白酶K 蛋白酶K 0.06 g 0.05mol/L Tris-HCl (PH7.5) 100 ml 用法同上。 在免疫組化染色中，有時經(jīng)過度固定的標本，影響一抗與抗原的結合，用蛋白酶溶

29、液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化時間應根據(jù)不同組織而異。總之，在保持組織形態(tài)不破壞的前提下，宜盡量消化時間延長。以上三種酶消化液，以第一種最為常用。 9. 經(jīng)熱修復抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進行下一步。10. 用與制備二抗相同的動物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附。 組織中非抗原抗體反應出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色。 最常見的原因是蛋白 (第一抗體) 吸附于高電荷的膠原和結締組織成分上。 最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前，用與制備第二抗體相同動物的非免疫血清封閉組織上帶電荷基團，而除去與第一抗體的非特異性結合 (在室溫下進行)。 非免疫血清的稀釋度1:51:20，還可

30、加入BSA (bovine serum albumin) 使稀釋后的非免疫血清中含0.16%的BSA，可取得更佳的染色效果，阻止非特異性背景染色。該方法是減少非特異性背景染色的有效方法。 11用特異性一抗孵育切片 研究組織細胞中的某種抗原是否存在，應用免疫組化染色，就要選用針對這種抗原的特異性抗體?，F(xiàn)在國際上有許多公司生產(chǎn)免疫組化試劑，包括一抗、二抗、顯色劑，并制成了成套的試劑盒，但一般試劑盒中不包括一抗，研究者可根據(jù)一抗的種屬性，選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒。 一抗的種屬來源 一抗可來源于各種種屬的動物，常見是來自家兔、山羊或小鼠，偶見來自馬。一般來自家兔和山羊的一抗都是多克隆的IgG

31、抗體，而來自小鼠的多是單克隆的IgG抗體。根據(jù)實驗動物或標本種屬的不同，選擇針對大鼠、小鼠或人的抗體。 抗體劑型及滴度檢驗 我國現(xiàn)在使用的多數(shù)抗體等試劑是由國外進口，包括一抗和含二抗的試劑盒。 國外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是100-200g/ml，但國內(nèi)各經(jīng)銷商將進口的原裝抗體又進行了分裝，如分成瓶等，也經(jīng)銷1ml/瓶抗體，價格各不相同。 國內(nèi)各經(jīng)銷商又根據(jù)需要將進口抗體進行稀釋，銷售的品種又分為即用型和濃縮型(進口原裝的抗體)兩種。 在免疫組化染色中，使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋，直接在切片上滴加即可。 濃縮型必須在稀釋后才能使用，因為濃縮型抗體濃度高，可引起嚴重的非特異性染色，因此，必須

32、在正式染色前先用切片對不同滴度的抗體染色效果進行評價，選擇濃度強度最好，非特異性反應（背景染色）最低的抗體稀釋度來進行正式染色。 一抗稀釋滴度的評價切片編號 slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5抗體稀釋度 1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800特異性染色 + + + + + + + + + + + + + + +背景染色 + + + + + 一抗體的稀釋 一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同，即 ，為進一步保證減少背景染色，用于稀釋一抗的PBS中也應加入制備二抗的同種動物的非免疫正常血清，有條件的還可加入BSA，兩者的濃度

33、在1 2 5% 即可。 一抗的孵育時間及條件 加入適當稀釋的一抗的切片，可在常溫下或37下保溫盒內(nèi)孵育。經(jīng)過正常二抗同種動物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗滌，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體。孵育時間：30-60分鐘或更長。 如果待檢的抗原量很少，而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色，可增加一抗的稀釋倍數(shù)，將切片放在保濕盒中置于4冰箱內(nèi)過夜孵育，可達到滿意的效果。 保 濕 盒12PBS洗滌切片 將用一抗孵育后的切片用PBST洗滌3次，每次5min，用冷PBS洗滌，可減少非特異性反應。13用針對一抗的生物素化二抗孵育切片 根據(jù)一抗的種屬來源，選擇相應的二抗。如

34、：一抗是家兔抗某種抗原抗體，二抗一般選用山羊抗家兔IgG抗體。二抗分濃縮型和即用型兩種。即用型二抗不需稀釋，直接使用。濃縮型者一般用PBS直接以1: 200400倍稀釋使用，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30 60min。 試劑盒：濃縮型或即用型 SP試劑盒、ABC試劑盒 試劑盒中包含：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑 二抗的同種動物非免疫血清 生物素標記的抗IgG抗體（二抗） SP試劑 ABC試劑（單獨購買）Kits for Immunostaining14PBS洗滌切片5min3次15滴加SP試劑或ABC試劑（1）生物素-抗生物素染色（ABC或SP法）的顯色原理 ABC法的染色原理 很早以前研究者就注意到給動物

35、飼以大量的雞蛋白，會引起明顯的“維生素H 缺乏癥”，也稱為“蛋白質(zhì)傷害”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68kD，屬于糖蛋白，當時命名為卵白素（avidin）。機體中還有一種物質(zhì)叫生物素（biotin），又稱維生素H，是一種小分子的維生素，廣泛分布于動植物組織中，以輔酶的形式參與各種羥化酶反應，分子量為244 D。 卵白素具有4個同生物素（維生素H）親和力極高的結合點。給動物飼以大量的雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量維生素H結合所致。研究者根據(jù)這兩種物質(zhì)的特點，提出了卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)。由于習慣上將維生素H稱為生物素，為便于理解，我國免疫細胞化學作者將卵

36、白素稱為抗生物素或親和素，因此卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為抗生物素-生物素免疫染色法。 生物素的另一特點是它可以和抗體IgG的Fc段結合，不影響IgG的活性。同時，生物素經(jīng)活化后還可同過氧化物酶或ALP等結合，而不影響酶的活性。根據(jù)上述這些抗生物素-生物素的反應原理和特性，1981年許世明設計出了免疫組織化學染色的ABC法（avidin-biotin peroxidase complex method， ABC ），并已制成了商品化的試劑盒。 ABC法免疫組化的試劑盒中除包括制備二抗的同一種屬動物的非免疫血清、生物素標記的二抗外，還包括：A試劑 (抗生物素) 和B試劑 (生物素-過氧化物酶

37、復合物)。在使用前半小時，將兩種試劑按說明書要求相互混合，形成復合物，一般是在5ml 的PBS中加一滴A試劑 (約50l)，混勻后再加一滴B試劑 (約50l)，混勻，半小時后加至經(jīng)過生物素標記的二抗孵育的切片上，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30-60 分鐘。 Biotinylated second antibodyP-OP-OP-OP-OAntigenBiotinAvidinHRPPrimary antibodyIllustration of ABC methodAvidin-biotin-peroxidase complex SABC 法的染色原理及特點 (1) 基本原理 鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)

38、物中提取的蛋白質(zhì)，分子量60kD，不含糖鏈，等電點 。與親和素（卵白素）相同也有四個生物素結合點，親和力極高。與親和素相比是一種更近于完美的生物素結合蛋白。鏈酶親和素（鏈霉卵白素）同一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈酶卵白素-生物素-酶復合物。這種復合物中至少存在一個尚未被生物素占據(jù)的親和素結合位點，可以和各種生物素標記的抗體結合。這種復合物即是SABC (streptavidin-biotin complex)。 (2) SABC的特點 高敏感性； 低背景； 簡便快速； 結果穩(wěn)定 SP 法的染色原理 基本原理與ABC法相似，但與ABC法稍有不同，是采用生物素標記的第二抗體與鏈霉卵白素連接

39、的過氧化物酶及基質(zhì)素混合液來測定細胞和組織中的抗原。AgAgBiotinStreptavidinEnzyme: HRP or APPrimary antibodyBiotinylated secondary antibodyIllustration of SP methodSP complex EnVison系統(tǒng)染色原理 與ABC法、SP法及SABC法的染色原理均不同，是將二抗與多聚螯合物酶（HRP或AP）通過化學方法連接在一起，形成多聚螯合物，在多聚螯合物上含有大量的酶分子和二抗，因此，比ABC法、SP法和SABC法具有更顯著的放大作用，可高出幾十倍。由于多聚物在人或動物體內(nèi)不存在，因此，無

40、非特異性染色，背景著色極輕。 染色步驟簡便，在一抗反應后，切片經(jīng)PBS洗滌后即可加入EnVison系統(tǒng)試劑，再經(jīng)PBS洗滌后，可進行顯色。AgAgPrimary antibodySecondary antibodyEnzyme, AP or HRPIllustration of EnVision method 16PBS洗滌切片，5 min3。 17DAB顯色或AEC顯色，或堿性磷酸酶標記的NBT顯色。 （1）DAB顯色液配置 DAB 20-50 mg 0.01mol/LPBS (pH 7.2-7.4) 100ml 或0.05mol/L Tris-HCl(pH 7.6) 30% H2O2 20

41、-40l 配置方法：先以少量PBS或Tris-HCl緩沖液溶解DAB，然后再加入余量緩沖液，在顯色前加入30% H2O2。將洗滌后的切片浸入顯色液中51020min，應閉光下反應，并隨時在顯微鏡下觀察結果，隨時終止反應，也可使用商品化的即用型DAB。陽性反應部分為棕色，經(jīng)核復染后，脫水、透明、樹膠封片，但由于有致癌作用，配置時應注意防護。 （2）AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) 顯色液 AEC 20mg 二甲基甲酰胺 0.05 mol/L 醋酸緩沖液 (pH 5.5) 50ml 30% H2O2 5l 配置方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻過濾。

42、臨顯色前加入H2O2, 顯色時間5-20 min，也可使用商品化的AEC顯色。該顯色液作用后，陽性部分為紅色，如以蘇木素或亮綠復染核后，效果更佳，但終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固。（3）堿性磷酸酶（AKP）標記的NBT顯色液 預先配置以下試劑： A 液：5% NBT（Nitro-blue-tetrazolium） 稱取溶于10ml 70% 的DMF，充分混合，保存于4，也可分裝成小份，-20保存，用前復至室溫。 B 液：5% BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate） 稱取，溶于10ml DMF內(nèi)，混勻，4成分裝，保存于-20，用前復至室溫。 顯色

43、液：取A 液 40l，加入到裝有10ml 的緩沖液（，含，5mmol/L MgCl2）管內(nèi)充分混勻，再加入B液40mol，輕輕混勻即可，最好臨用前就配置，但在顯色液中需加入Levamisole（左旋咪唑）在顯微鏡下隨時觀察顯色反應，陽性結果為藍色或紫色沉淀。 上述所提及的各種顯色液目前均有以試劑盒形式出售，只要按說明操作即可，但價格較貴。 18. 自來水洗滌切片、核復染、脫水、透明、 樹膠封片 經(jīng)顯色后，將切片放入自來水中，流水輕沖洗10分鐘，再經(jīng)蒸餾水洗后，放入蘇木素中做核復染（顯色切片）20s-1min，經(jīng)酒精-HCl分化后，在放入自來水中繼續(xù)分化細胞核至滿意為止。 經(jīng)70%、80%、90

44、%、95%、100%、100% 酒精脫水各5min，二甲苯透明后，用樹膠封片。Immunostaining of GFAP and IL-8GFAP, SPGFAP, SPIL-8, ABCIL-8, ABC 400 400 400 200Immunostaining of Fas , Fas L and CaspasesFas, EnVisonFas L, EnVison 400 400 400 400Caspase-3, SABCCaspase-6, SABC 第三節(jié) 免疫組化染色的對照設置 在進行免疫組化染色時，必須證實組織內(nèi)顯示的反應產(chǎn)物，確實是抗原與相應的特異性抗體反應所產(chǎn)生的。由于

45、免疫組織化學染色中影響抗原、抗體和免疫反應的因素很多，因此對免疫組織化學染色結果的評價必須設置對照組才能做出正確的判斷。 常用的對照組有以下幾種： 一、 陽性對照 用已證實含用待測抗原的組織，與待檢標本做同樣處理后，進行免疫組化染色，結果應為陽性，稱為陽性對照。每次實驗都應做陽性對照，通過陽性對照可證明靶抗原有一定活性，染色過程中各個步驟以及所用的試劑都合乎標準，染色方法可靠。特別是當待檢的標本為陰性結果時，陽性對照呈陽性反應，可排除待檢標本假陽性的可能。所以若預期染色結果是陰性時，就必須設陽性對照。 二、陰性對照 用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結果為陰性。陰性對照可證實組織內(nèi)若不含靶抗

46、原，就不應染色，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應等因素造成的“假陽性”結果。 三、空白對照 是最常用的對照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結果應為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的內(nèi)源性過氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質(zhì)引起的非特異性顯色。 四、替代對照 用與第一抗體來源的同一動物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的 IgG抗體，對照中用非免疫性的正常兔IgG血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進行對照染色。這可證明待檢切片中陽性結果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細胞內(nèi)待檢抗原的特異性反應的結果。但使用的商品抗體往往不能用同一種動物的

47、免疫前血清做替代對照，也可用未經(jīng)免疫的同種動物血清，即非免疫血清替代一抗。 五、吸收試驗對照 用過量已知相應的純化抗原與第一抗體反應，抗體結合點全部被抗原結合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內(nèi)的抗原反應，故再做免疫組化染色時，結果應為陰性。 六、自身對照 用同一組織切片上與待檢抗原無關的其它結構做對照。陰性反應與陰性結構同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應的特異性對照。但進行科研工作中，單純用這種對照是不科學的。必須增加如空白對照、替代對照等，才能使染色結果得到承認。 在國際上發(fā)表文章，做免疫組化染色的同時，還須有Western blotting做相應蛋白質(zhì)檢測的實驗結果加以證實。

48、 冰凍切片的免疫組織化學染色 冰凍切片的免疫組織化學染色也是常用的技術，但一般情況下不用，因為冰凍切片操作較復雜，不易操作，要求標本必須是深低溫快速冷凍，標本不如石蠟塊易保存等，但優(yōu)點是組織的各種抗原保存好。因此一般情況下，只有在應用石蠟切片進行免疫組化染色，包括經(jīng)過抗原熱修復或蛋白酶消化后，仍不能得到陽性染色結果時，才考慮使用冰凍切片染色。第四節(jié) 雙重免疫組織化學染色 應用免疫組織化學染色方法在同一張組織切片或細胞涂片上同時或先后顯示兩種抗原成分，即為雙重免疫標記。光鏡下通過標記物或其反應生成物的顏色來標記不同的抗原成分，以幫助研究者了解含有這些不同抗原的各類細胞、組織之間的相互關系。 可能

49、遇到的問題是：后一種免疫染色所用的抗體系統(tǒng)可能與前一種染色所用的抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應，從而造成疊加污染，失去雙重染色的準確性和意義。為避免這種交叉反應，研究者建立了一些方法，按其作用原理和方式，可分為洗脫法和非洗脫法。 一、洗脫法 1. 基本原理： 可選用同種動物產(chǎn)生的特異性抗體（如兔抗X和兔抗Y IgG 抗體）為一抗，另一種動物相應的抗體（如生物素標記的羊抗兔IgG抗體）為二抗，用ABC、SP或SABC方法，或應用EnVison方法進行染色，用不同的酶和底物系統(tǒng)呈色。在完成第一種免疫組化染色后，將抗原抗體復合物洗脫，再做第二種染色。 2. 洗脫液： （1）甘氨酸-鹽酸溶液(pH 2.2)：0

50、.1 mol/L鹽酸+0.757%（）甘氨酸溶液95ml（的氯化鈉溶液配制）。用該溶液洗切片2h，一般能夠消除第一種染色的抗體系統(tǒng)與下一種染色的交叉反應，但保留顯色反應所得的顏色。 （2）高錳酸鉀-硫酸洗脫液：1 ml 2.5% KMnO4，1ml 5% H2S04，加140ml蒸餾水混勻。 3. 洗脫法的一般步驟 按常規(guī)做第一種免疫組化染色，可選用HRP為標記物，顯色底物為4-氯萘酚，陽性部位反應產(chǎn)物為藍色。 開始第二種染色前，先將切片經(jīng)蒸餾水洗，再用酸性溶液洗脫。如用的甘氨酸-鹽酸溶液須浸洗2h左右，如用高錳酸鉀-硫酸洗脫液則要5min左右，再將切片移入0.5%的焦亞硫酸鈉（Na2S2O5

51、）水溶液中還原30s，經(jīng)水洗10-20min，蒸餾水洗5min， 按常規(guī)進行下一種免疫組化染色。第二種染色選用DAB為顯色底物，生成物呈棕褐色，與第一種染色中生成的藍色可形成比較鮮明的對比。 二、非洗脫法 （一）直接法 如果采用不同種酶標記在不同的第一抗體上，則只能用順序染色法。即先做第一種染色，用第一種底物與已定位的酶反應呈色，再進行第二種染色。 （二）標記雙抗原法 兩種一抗分別來自不同種動物，二抗分別來自另外兩種不同動物，且標記兩種酶分別作為標記物做雙重染色時，一般第一種染色選用HRP，而在第二種染色中可按需要選擇不同的酶。如選用ALP，還可用不同的底物呈現(xiàn)不同的顏色，如堅固藍呈現(xiàn)的藍色可

52、與DAB的棕色形成良好的對比，堅固紅雖然與DAB的棕色對比相對較差，但也可選用。 （三）活性滅活法 是一種新建立的方法，主要是根據(jù)通過在溶液中加熱滅活第一次染色中的抗原、抗體和酶活性后再進行第二種染色的原理而設計的。用于滅活的溶液介質(zhì)一般是檸檬酸緩沖液（），滅活的溫度一般是96左右。本法的優(yōu)點是用于染色的一抗、二抗可分別來自于同一種動物，方便了抗體的選擇，只是選用不同的顯色酶和底物。但缺點是所要顯示的第二種抗原必須耐熱。Double Immunostaining of Fas and Fas LEnVisonEnVisonEnVisonEnVison 400 400 400 400免疫熒光染色

53、及多重染色技術Single and multiple immunofluorescent labeling原理：是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗體或抗原標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。方法：直接法、間接法。 檢測方法 一、直接法 用已知特異性抗體與熒光素結合，制成特異性熒光抗體，直接與細胞或組織中相應抗原結合，在熒光顯微鏡下可見抗原存在部位呈現(xiàn)的特異性熒光。此法特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。 二、間接法 是直接法的重要改進，先用特異性第一抗體抗體與細胞標本反應，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結合

54、的抗體，再用標記熒光的第二抗體與結合在抗原上的抗體結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物。由于結合在抗原抗體復合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性，與直接法相比熒光亮度可增強34倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，適用于多種抗原的標記顯示，是目前最廣泛應用的技術。 間接法染色原理標記不同熒光發(fā)色劑的商品化二抗：1. Alexa Fluor 555，顯示紅色熒光； 吸收光譜峰值：555nm ，激發(fā)光譜峰值：565nm 。2. Alexa Fluor 488，顯示綠色熒光； 吸收光譜峰值：495nm ，激發(fā)光譜峰值： 519 nm 。 3. Alexa Fluor

55、350，顯示藍色熒光。 吸收光譜峰值：346nm ，激發(fā)光譜峰值： 442nm 。4. Hoechst 33258，標記細胞核，或細胞凋亡檢測，藍色。 吸收光譜峰值： 346nm，激發(fā)光譜峰值： 460nm 雙重或三重免疫熒光標記法 Double and triple immunofluorescent labeling目的：1. 雙重染色：同時顯示細胞中的兩種抗原或一種抗原+標記細胞種類；2. 三重染色：同時顯示細胞中的三種抗原或兩種抗原+標記細胞種類。方法：直接法、間接法 直接法：將兩種或三種來自不同種屬，并標記了可發(fā)出不同顏色熒光的抗體（如抗A、抗B、抗C）以適當比例混合，加在標本上孵育

56、后，按直接法洗去未結合的熒光抗體，抗A抗體用發(fā)黃綠色熒光素標記，抗B抗體用發(fā)紅色熒光素標記，抗C抗體用發(fā)藍色熒光素標記明確顯示兩種或三種抗原的定位。 間接法：將兩種或三種來自不同種屬的抗體（如抗A、抗B、抗C的IgG抗體）同時或分別孵育切片后，再選用標記了可發(fā)出不同顏色熒光另外不同種屬的抗IgG抗體孵育切片，進行雙重或三重免疫熒光染色，是目前常用的檢測技術。Double immunostaining of Nrf1 in distinct cell types Co-localization of F4/80 and nAChR7 by double immunofluorescent lab

57、eling during skin wound healing in mice The samples were immunostained with anti-F4/80 (a, green) and anti-nAChRa7 (b, red). Nuclei were counterstained with Hoechst33258 (c, blue). Signals in ac were digitally merged in d. The nAChRa7+/F4/80+ cells presented as yellow signals in the merged image.免疫熒

58、光染色注意事項 免疫熒光染色的基本程序近似于酶免疫組織化學染色，但應注意以下問題：1. 免疫熒光不需要用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。2. 二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。3. 免疫熒光在封片時常使用專用封片劑或甘油（0.01M PBS 1:1）。建議購買抗淬滅的封片液，使切片可以保存更久。4. 熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。5. 免疫熒光染色假陽性可能多，需分別設定陽性和陰性對照。6. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。 第五節(jié)細胞凋亡的檢測技術 一、凋亡細胞的形態(tài)學改變 細胞表面：偽足、微絨毛等消失 細胞體形態(tài)：細胞皺縮

59、、變形，體積變小 細胞核：染色質(zhì)濃縮、早期染色質(zhì)聚集于核膜邊，呈新月形 或環(huán)形，晚期碎裂 細胞器：密集但形態(tài)及結構完整，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴張 細胞膜：完好，晚期包裹細胞器或核碎片，形成凋亡小體 在組織中表現(xiàn)：常常以單個細胞散在發(fā)生 周圍組織反應：凋亡細胞或小體被鄰近巨噬細胞、上皮細胞 吞噬、降解，不發(fā)生炎癥反應 發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細胞死亡，多發(fā)生于器官 萎縮、細胞介導的免疫殺傷機制、小劑量毒素作 用以及多種病理生理狀態(tài) 二、細胞凋亡的形態(tài)學檢測方法（一）凋亡細胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測 1制片 （1）常規(guī)組織學切片，進行脫蠟和水化。 （2）培養(yǎng)細胞可用細胞離心儀制片。由于凋亡細胞在制片

60、中容易破碎，所以應采用低速離心制片（250g，離心5min），并事先將載玻片用1%BSA處理，使細胞易于貼附。離心后涂片，稍經(jīng)空氣中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4下固定15-30min，然后轉入80%乙醇后固定1-2h，保存于-20待用。 2染色方法 可用多種方法進行染色。 （1）可采用常規(guī)的組織學染色方法，如Giemsa染色、HE 染色或Mayer蘇木素染色。 （2）采用熒光染料染色 Hoechst 33258 。 DAPI（4, 6 -diamidino- 2-phenylindole; 4,6- 二脒基-2-苯基吲哚 ）。 DAPI是含有特定AT序列DNA的一種嵌入劑，能像 Hoechst