藥物分析基礎(chǔ)第四章藥物的定量分析和分析方法的驗證

1、第四章 藥物的定量分析和分析方法的驗證 樣品（包括生物樣品）的前處理 定量分析方法及驗證內(nèi)容藥物分析基礎(chǔ) 第一節(jié) 樣品的前處理方法哪些藥品需要前處理何為不經(jīng)有機(jī)破壞處理何為有機(jī)破壞處理生物樣品前處理一、需要前處理的樣品含金屬藥物：富馬酸亞鐵、葡萄糖酸銻鈉、枸櫞酸鉍鉀、葡萄糖酸鋅、酒石酸銻鉀等。含鹵素藥物：泛影酸、三氯叔丁醇、碘番酸、磺溴酞鈉等。生物樣品：血樣、尿液、唾液、頭發(fā)等二、不經(jīng)有機(jī)破壞處理的分析方法直接測定法 適用于金屬原子不直接與碳原子相連的或某些CM鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物經(jīng)氧化還原后測定法（Zn）適合于鹵素結(jié)合于芳環(huán)上的藥物經(jīng)水解后測定法 適合于鹵素與脂肪碳鏈相連的藥物 適用于

2、金屬原子或鹵素與碳原子結(jié)合牢固的有機(jī)金屬藥物。濕法破壞干法破壞三、經(jīng)有機(jī)破壞處理的分析方法高溫?zé)胱品ㄑ跗咳紵?. 濕法破壞 （1）硝酸-高氯酸法 （2）硝酸-硫酸法 （3）硫酸-硫酸鹽法 （4）其它濕法注意：濕法破壞的儀器一般為凱氏燒瓶；試劑應(yīng)不含被測離子或干擾測定的成分；由于礦酸量數(shù)倍于樣品，須做空白實驗校正；操作須在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。2. 高溫?zé)胱品?適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)物以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。 經(jīng)高溫灼燒灰化，使有機(jī)結(jié)構(gòu)分解而待測元素轉(zhuǎn)化為無機(jī)元素3. 氧瓶燃燒法（Oxygen flask combustion method）將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行

3、燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測定適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析儀器裝置鉑金絲硬質(zhì)玻璃燃燒瓶樣品無灰濾紙透明膠紙燃燒、催化 稱樣燃燒分解操作（通O2 1-2 min，燃燒）吸收液水-NaOH（含碘、溴、氯藥物） 例鹽酸胺碘酮、碘苯酯、甲狀腺粉水- H2O2（含硫藥物） 例磺溴酞鈉水（含氟藥物）硝酸溶液（含硒藥物）四、生物樣品分析前處理技術(shù)一般考慮根據(jù)生物樣品種類血-除蛋白質(zhì)尿-綴合物水解唾液-除去粘蛋白根據(jù)測定方法免疫分析靈敏、專屬前處理要求簡單光譜分析靈敏、選擇性差前處理要求高色譜分析準(zhǔn)確、精密，專

4、屬除蛋白質(zhì)根據(jù)藥物理化性質(zhì)酸堿度，溶解性，揮發(fā)性，紫外吸收性質(zhì)等藥物的濃度如ng，ug，mg級測定目的如藥代動力學(xué)、代謝分型等去除蛋白質(zhì)目的：使藥物從結(jié)合狀態(tài)下釋放出來減少提取過程中的乳化 消除干擾，保護(hù)色譜柱 常用去蛋白方法：加入與水相混溶的有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物被釋放出來（甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、丙醇、四氫呋喃）。一般離心速度在10000r/min（用具塞塑料離心管）前處理方法加入中性鹽，如（NH4)2SO4，Na2SO4等，將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。加入強(qiáng)酸（10%三氯乙酸、6%高氯酸等） 在低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)p

5、H時，與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性鹽而沉淀。 加入Zn2+、Cu2+在高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH時，與蛋白質(zhì)陰離子形成不溶性鹽而沉淀。 酶解法 （蛋白水解酶枯草菌溶素） 使組織酶解，釋放出藥物，不會發(fā)生乳化，對與蛋白結(jié)合牢固的藥物可顯著改善回收率。綴合物水解綴合物主要是葡萄糖醛酸苷綴合物、硫酸酯綴合物、谷胱甘肽綴合物等。綴合物極性較大，難被有機(jī)溶劑提取，故需先進(jìn)行水解。常用水解方法有：酸水解：如HCl，作用強(qiáng)、快、專屬性差酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或該兩種酶的混合酶。酶水解慢、專屬、較溫和溶劑解：較溫和前處理方法有機(jī)破壞提取純化液-液提取液-固提取被測組分的濃集衍生化反應(yīng) 液固萃取液液萃取前處

6、理方法第二節(jié) 定量分析方法化學(xué)分析法光譜分析法色譜分析法重量分析法容量分析法紫外分析法UV熒光分析法FIA高效液相色譜HPLC氣相色譜GC方法 應(yīng)用品種數(shù)新增儀器分析法HPLC339282TLC3212GC2319分光光度法183化學(xué)分析法滴定法133重量法51氮測定法51揮發(fā)油測定法30浸出物測定法132總計4563272005年版中國藥典中成藥含量測定方法概況容量分析法（滴定）概念：一定濃度的滴定液由滴定管加到待測藥物溶液中，按化學(xué)計量反應(yīng)完全。根據(jù)滴定液濃度、體積及化學(xué)計量計算被測藥物含量。關(guān)鍵問題：等當(dāng)點(diǎn)的確定。 滴定點(diǎn)指示劑顯示的滴定終點(diǎn) （指示劑的變色點(diǎn)） 等當(dāng)點(diǎn)反應(yīng)的化學(xué)計量點(diǎn)

7、（消耗的滴定液的摩爾數(shù)被測物摩爾數(shù)）特點(diǎn)：操作簡便、快速、實驗條件易實現(xiàn)，但是靈敏度低，通常用于高含量和中含量藥物滴定方式 直接滴定法 剩余滴定法 置換滴定法 含量的計算：定量關(guān)系： aA bB 被測藥物 滴定液化學(xué)計量關(guān)系 nA/ anB/ b WA/ aMAWB/ bMB滴定度：1mL某物質(zhì)的量濃度的滴定液相當(dāng)于被測藥物的重量，中國藥典用mg表示。滴定度的計算：T滴定度(mg/ml) c滴定液濃度(mol/L)M被測物質(zhì)分子量以I2（）計，反應(yīng)摩爾比 11例直接滴定法 含量 100 實際工作中配制的滴定液濃度與藥典中的規(guī)定濃度不一致，須引入滴定液濃度校正因子( f ) F 含量基于滴定度的

8、百分含量計算：若異戊巴比妥鈉的取樣量為0.2052g依法用F=1.010的硝酸銀滴定液(0.1 mol/L)滴定，消耗8.10ml，則異戊巴比妥鈉的含量已知：每1 ml 硝酸銀滴定液（0.1 mo1/L）相當(dāng)于24.83 mg的異戊巴比妥鈉例回滴定法 加入滴定液A 與被測藥物完全反應(yīng)，再以滴定液B 回滴剩余的滴定液 A 滴定液A 與滴定液B 的濃度是相當(dāng)?shù)模鶕?jù)消耗回滴的滴定液體積進(jìn)行計算 本法需進(jìn)行空白試驗校正 含量 100光譜分析法利用物質(zhì)的光譜特性進(jìn)行定量介紹兩種光譜分析方法：紫外可見分光光度法分子的價電子吸收了光的能量，由低能量的基態(tài)躍遷到高能量的激發(fā)態(tài)，在相應(yīng)波長位置出現(xiàn)吸收帶形成的

9、光譜，稱為紫外-可見吸收光譜紫外吸收光譜圖紫外可見分光光度法波長范圍200760nm定量分析基本原理：朗伯-比爾定律 A=ECL特點(diǎn)：靈敏度高(10-410-7 g/mL)； 準(zhǔn)確度高； 儀器便宜；易操作（一）對溶劑的要求 A盡量?。ǘ┛瞻讓φ赵囼?清零（三）測定波長確證 2nm（四）供試液的濃度 吸收度的測定要求含量測定吸收系數(shù)法（不需要對照品） 測定處吸收度，以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算 含量 100鹽酸氯丙嗪含量測定:精密稱取0.2368g，置500ml量瓶中，加鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，加同一溶劑稀釋至刻度，搖勻，在254nm波長

10、處測得吸收度為0.435，按為915計算，求其百分含量。例含量測定對照品比較法:配制供試品溶液和對照品溶液，測定處吸收度 C待測C對照 含量 100要求濃度與吸光度成正比，因此供試品與對照品溶液中的被測成分應(yīng)盡可能一致（實際要求 10%）含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線法（多點(diǎn)對照）繪制對照液濃度吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線（3-5點(diǎn)）擬合回歸方程，求出供試液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算分光光度法 多波長校正計算分光光度法雙波長分光光度法三波長分光光度法導(dǎo)數(shù)光譜法解聯(lián)立方程法熒光分析法熒光 處于第一激發(fā)態(tài)的分子， 躍遷回基態(tài)時發(fā)射的光稱為熒光，其能量小于激發(fā)光，波長長于激發(fā)光； 除去激發(fā)光源，熒光立即熄滅熒光激發(fā)光譜（激發(fā)光譜）熒光發(fā)

11、射光譜（熒光光譜）熒光為發(fā)射光，利用熒光的物理特性進(jìn)行定性與定量測定的方法稱為熒光分析法（激發(fā)光譜）（發(fā)射光譜）原理 當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長、所用溶劑及溫度等條件一定時，在較稀濃度范圍內(nèi)藥物的熒光強(qiáng)度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比熒光強(qiáng)度濃度特點(diǎn)：靈敏度較紫外高、選擇性好 (10-1010-12 g/mL)； 取樣少、方法快速； 應(yīng)在低濃度下進(jìn)行； 干擾因素較多，須進(jìn)行空白校正； 能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)較少，可采用熒光 衍生化處理含量測定 對照品比較法由于絕對熒光強(qiáng)度難以測定，需要在每次測定前用一定濃度的對照品溶液校正儀器靈敏度，然后讀取對照品溶液、供試品溶液及各自溶劑的空白讀數(shù)。 C待測C對照由于濃度線性

12、范圍較窄， 應(yīng)在之間色譜分析法是一種分離分析方法 利用各組分在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異得到分離，再逐個進(jìn)行分析介紹兩種色譜分析方法：高效液相色譜法（HPLC）氣相色譜法（GC）色譜過程固定相流動相被分離組分保留時間定性進(jìn)樣點(diǎn)t0死時間tR保留時間tR保留時間峰面積（或峰高）定量色譜的保留行為 類 型 特 點(diǎn)HPLCGC分離效能高（理論板數(shù) n）104105填充柱 103毛細(xì)管柱=106分析速度快幾分鐘幾十分鐘幾分鐘幾十分鐘靈敏度高 （最小檢出量）UVD 10-9g FD 10-13gTCD 10-8gFID 10-13g適用范圍寬80%有機(jī)化合物20%有機(jī)化合物儀器化程度高智能化智能化

13、高效液相色譜法（HPLC）固定相、流動相及檢測器的選擇常用系統(tǒng)固定相（色譜柱）：十八烷基鍵合硅膠C18流動相：甲醇-水、乙腈-水檢測器：紫外吸收檢測器十八烷基及其他化學(xué)鍵合硅膠結(jié)構(gòu)示意圖蒲 公 英 圖分析型色譜柱各種類型色譜柱色譜柱內(nèi)徑：長度：15mm、25mm柱填料粒度：510m燈 室流通池檢測器 紫外檢測器（UVD 最常用）、熒光檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器、二極管陣列檢測器（DVD）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）和質(zhì)譜檢測器（MS）等紫外檢測器外觀圖高效液相色譜法（HPLC）系統(tǒng)適用性試驗用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗和調(diào)整 理論板數(shù)（n） 分離度（R） 重復(fù)性（RSD） 拖尾因子

14、（T） 1）色譜柱的理論板數(shù)（n） n值越大柱效越高，應(yīng)高于規(guī)定的最小理論板數(shù)tR 保留時間Wh/2 半高峰寬 2）分離度（R） R值越大分離效果越好 在規(guī)定的條件下，注入對照液或供試液，記錄色譜圖，按下式計算待測峰（定量峰）與相鄰峰的分離度。除另有規(guī)定外，應(yīng)大于。 3）重復(fù)性 考察測量的精密度 在規(guī)定條件下，取一定量的對照液，連續(xù)進(jìn)樣35次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)不大于。 RSD計算公式 份號12345A20617.2519663.0719543.3020412.4119254.30 例題 取某對照品溶液10l，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各次色譜峰峰面積如下，試判斷色

15、譜系統(tǒng)重復(fù)性是否符合規(guī)定。X=19898.1 RSD=2.9%不符合規(guī)定 4）拖尾因子（T） 考察色譜峰的對稱性 T 值越接近于1.0 色譜峰的對稱性越好，測量的準(zhǔn)確度越高。采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的T是否符合規(guī)定。除另有規(guī)定外，T應(yīng)在之間。W為峰高處的峰寬d1為峰極大至峰前沿之間的距離選擇適宜的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，以待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法稱為內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。 校正因子（f ） 其含義為：內(nèi)標(biāo)物峰面積與其濃度之比（As/Cs）是對照品峰面積與其濃度之比（AR/CR）的多少倍。f =As/CsAR/CR含量測定 內(nèi)標(biāo)加校正因子法：對照+內(nèi)標(biāo)

16、樣品+內(nèi)標(biāo)樣品內(nèi)標(biāo)對照內(nèi)標(biāo)C樣 = f A樣/(A內(nèi)/C內(nèi))校正因子f =(A內(nèi)/ C內(nèi))/(A對/C對)外標(biāo)法：（1）外標(biāo)一點(diǎn)法被測成分與其峰面積成正比關(guān)系要求供試液與對照液濃度相近=A供A對C供對樣品C供=C對A供A對對照外標(biāo)法：（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 繪制濃度峰面積(峰高)標(biāo)準(zhǔn)曲線； 擬合回歸方程并計算擬合常數(shù)； 測定供試品峰面積(峰高)，帶入方程，求出濃度。特點(diǎn)及要求： 外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高， 操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。 對進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析?；驹?各組分在固定相與載氣之間由于分配系數(shù)不同而按不同順序被帶出，分配系數(shù)小的組分先流出，

17、分配系數(shù)大的后流出以氣體為流動相的色譜法氣相色譜法（GC）優(yōu)點(diǎn) 靈敏度高、樣品用量少 分離效能高，分離速度快缺點(diǎn) 受樣品蒸氣壓的限制 不適于難氣化和熱穩(wěn)定的藥物色譜柱、載氣及檢測器的選擇 氣源 進(jìn)樣及氣化系統(tǒng) 色譜柱和柱溫箱 檢測器 熱導(dǎo)檢測器 氫火焰離子化檢測器 電子捕獲檢測器ChP（2005）對氣相色譜儀的一般要求 色譜柱 填充柱或毛細(xì)管柱（空心柱) 固定液 高沸點(diǎn)液體 載氣 氮?dú)?檢測器 氫火焰離子化檢測器（FID） 檢測溫度高于柱溫 一般 250 350系統(tǒng)適用性試驗：同HPLC法含量測定： 手動進(jìn)樣時，進(jìn)樣口溫度高，注射器插入膠墊后針尖部分受熱，以致針尖內(nèi)溶液受熱膨脹，部分溶液會被擠

18、入進(jìn)樣口，使進(jìn)樣量發(fā)生偏差。 以內(nèi)標(biāo)法為主，操作及計算方法同HPLC法第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證一、目的 證明所用的分析方法適合相應(yīng)的檢驗要求 （一）起草新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時 （二）改變生產(chǎn)工藝時 改變制劑處方 修訂原分析方法時二、用途三、需驗證的分析項目 鑒別 檢查：雜質(zhì)定量或限度檢查 含量測定：原料藥或制劑中有效成分及制劑中其他成分（如降解產(chǎn)物、防腐劑等）四、驗證指標(biāo)準(zhǔn)確度 精密度專屬性 檢測限定量限 線性范圍 耐用性重復(fù)性中間精密度重現(xiàn)性（一）準(zhǔn)確度 該法測定結(jié)果與真實值或參考值接近程度 用百分回收率%表示 測定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗法”和“加樣回收試驗法

19、”。 回收率 100數(shù)據(jù)要求 規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評價，如制備三個不同濃度樣品各測三次。 原料藥用已知濃度的對照品測定，或?qū)⒈痉y定結(jié)果與另一已建立準(zhǔn)確度的方法的測定結(jié)果相比。制劑用已知量的被測物混合物測定，或與另一已建立準(zhǔn)確度的方法的測定結(jié)果相比。1. 含量測定方法的準(zhǔn)確度2. 雜質(zhì)定量測定的準(zhǔn)確度 向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測定。如果不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可用本法測定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較。（二）精密度偏差（d）標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）變異系數(shù)（CV）同一均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定，所得結(jié)果之間的接近程度*重復(fù)性 同人、儀器、時間*中間精密度 同室，

20、但不同人、儀器、時間 *重現(xiàn)性 不同地方協(xié)同檢驗（三）專屬性（選擇性） 在有其他成分（雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在時，該分析方法對待測組分準(zhǔn)確而專屬的測定能力 鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法均應(yīng)考察（四）檢測限LOD樣品中待測組分能被檢測出的最低量是限度試驗參數(shù)，無需定量測定。常用%、ppm、ppb表示。儀器分析法檢測限（D）靈敏度（S）噪音 （N）或 把低濃度樣品信號與空白樣品信號進(jìn)行比較，按信噪比（S/N）3:1或2:1時的相應(yīng)濃度或進(jìn)樣量為檢測限非儀器分析法 能觀察到實驗現(xiàn)象的最低濃度為檢測限（五）定量限 LOQ 樣品中被測組分能被定量測定的最低量（應(yīng)達(dá)到一定的準(zhǔn)確度和精密度）常用