免疫組化病理診斷-課件

1、免疫組化在病理診斷中的正確應(yīng)用周曉軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院引言免疫組化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病理診斷：在解決疑難病例診斷方面起著重要作用；隨著人們醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)意識(shí)的增強(qiáng)，許多普通的病例也常常需要免疫組化進(jìn)一步證實(shí)；成為病理醫(yī)生常規(guī)工作不可缺少的重要工作；常規(guī)手段；每年12000篇新的文獻(xiàn)（2005年, 人體病理）引言腫瘤病理診斷：HE形態(tài)HE形態(tài) + 特染，電鏡HE形態(tài) + 免疫組化 + 分子病理？免疫組化：新的誤診？更客觀！新的診斷標(biāo)準(zhǔn)！更權(quán)威！成功的病理醫(yī)生臨床知識(shí) + HE形態(tài)知識(shí) + 免疫組化知識(shí)引言免疫組化技術(shù)廣泛應(yīng)用于病理診斷工作得益于免疫組化技術(shù)的進(jìn)步：抗原修復(fù)技術(shù)；更加敏感的檢測(cè)系統(tǒng)或放大系

2、統(tǒng)的建立；更多可用于常規(guī)標(biāo)本的抗體的出現(xiàn)；自動(dòng)免疫染色系統(tǒng)等。引言免疫組化在病理診斷應(yīng)用中存在的一些問(wèn)題也逐漸有所認(rèn)識(shí)。如何正確應(yīng)用免疫組化技術(shù)，避免由于錯(cuò)誤地操作及判斷而導(dǎo)致的誤診。一、免疫組化的應(yīng)用范圍免疫組化染色意味著試劑及人力等方面的支出；但如果正確掌握適用范圍，選擇合適的抗體，可以及時(shí)地明確或避免誤診，或?qū)εR床分期進(jìn)行更為準(zhǔn)確的評(píng)估，有助于選擇更有效的治療方法，因此總體上節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。一、免疫組化的應(yīng)用范圍腫瘤的病理診斷：幫助良惡性病變鑒別；未分化惡性腫瘤（癌或肉瘤）性質(zhì)的判斷；各種圓細(xì)胞、梭形細(xì)胞、多形性腫瘤的鑒別診斷；幫助確定轉(zhuǎn)移性腫瘤的原發(fā)部位等。 CKAE3 T GTTF-1

3、 PSACK20 CK7肺結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞角蛋白在癌中的表達(dá) CK7+ CK7 -CK20+ 女性生殖道黏液癌， 消化道癌 （結(jié)腸） 部分胃癌，部分胰膽道癌 Merkel細(xì)胞癌CK20- 消化道以外的腺癌：肺、 肝癌、腎細(xì)胞癌、前列 乳腺、漿液性及宮內(nèi)膜癌 ， 腺癌、鱗狀細(xì)胞癌 間皮瘤、膀胱、宮頸、胰腺 內(nèi)分泌癌（除甲狀腺） 唾腺來(lái)源的癌(90%)透明細(xì)胞癌的免疫組化鑒別腎透明細(xì)胞癌肝透明細(xì)胞癌腎上腺癌卵巢透明細(xì)胞癌HEPPAR1-+-CD10+-34E-12-+Inhabin-/+-+-Melan-A-+ -EMA+-+pCEA-+-+/-CK19+/-+CK7-+CK8/CK18+-+一、免

4、疫組化的應(yīng)用范圍淋巴造血系統(tǒng)疾病的診斷：鑒別反應(yīng)性增生性疾病與淋巴瘤；各類淋巴瘤分型的重要依據(jù)。在淋巴造血疾病的病理診斷中免疫組化目前幾乎已成為常規(guī)開展的工作項(xiàng)目。 Bcl-2 Bcl-2一、免疫組化的應(yīng)用范圍內(nèi)分泌腫瘤的診斷：不僅可以幫助確定診斷，還可以通過(guò)檢測(cè)腫瘤分泌激素達(dá)到功能分類的目的。在軟組織腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等其他各系統(tǒng)腫瘤的病理診斷中免疫組化也具有重要的作用。 一、免疫組化的應(yīng)用范圍小活檢病理檢查：能明確地顯示癌細(xì)胞的存在（如胃粘膜活檢中的印戒細(xì)胞癌）；腫瘤穿刺活檢時(shí)腫瘤類型的確定。微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶（淋巴結(jié)及骨髓）、甚至不易察覺的病變得以確診。 CgAEMA活檢手術(shù)類癌SCC類

5、癌活檢手術(shù)CK類癌SCCCgA類癌SCCSCCSCCTTF-1類癌Ki67類癌活檢標(biāo)本類癌和小細(xì)胞癌的相對(duì)鑒別 特點(diǎn) 類癌 小細(xì)胞癌腫瘤部位 中央或周圍 中央多見核染色質(zhì) 顆粒狀，有時(shí)粗糙 細(xì)致、均勻血管 薄壁 厚壁、腎小球樣核分裂像 10/10HPF 10/10HPF CgA, Syn 陽(yáng)性強(qiáng) 陽(yáng)性弱Ki-67 低（典型的20%） 高（典型的50%）From AJSP 2005, 29(2):179-187一、免疫組化的應(yīng)用范圍細(xì)針穿刺、細(xì)胞學(xué)診斷主要是定性診斷？免疫組化的應(yīng)用有可能對(duì)部分腫瘤進(jìn)一步地進(jìn)行分類或明確來(lái)源。LCA一、免疫組化的應(yīng)用范圍乳腺癌激素受體（ER、PR）的檢測(cè)在指導(dǎo)臨床

6、治療方面已起到了重要的作用。針對(duì)腫瘤基因產(chǎn)物（C-erbB2, P53, ALK，CD117等）的抗體為基因治療提供重要的參考依據(jù)。細(xì)胞增殖核抗原（Ki-67）等免疫組化染色可為腫瘤的預(yù)后提供依據(jù)。已用于臨床的新型靶向治療藥物美羅華：CD20單克隆抗體，用于治療CD20+的B細(xì)胞淋巴瘤Herceptin：c-erbB-2（neu）單克隆抗體，用于治療c-erbB-2過(guò)度表達(dá)的乳腺癌STI-571（Gleevec，imatinib）：小分子選擇性蛋白酪氨酸激酶抑制劑，用于CML和GIST治療一、免疫組化的應(yīng)用范圍某些感染性疾病的病因診斷，如HBV、HCV、EBV、CMV等病毒的檢測(cè)。但與分子生物

7、學(xué)等技術(shù)相比，免疫組化檢測(cè)病原微生物敏感性常常較差，因此應(yīng)用范圍有限。 HPVHBsAg二、免疫組化的局限性對(duì)于許多非腫瘤性疾病由于常常無(wú)特異的抗原表達(dá)，因此其診斷仍依據(jù)于特異的常規(guī)光鏡及電鏡形態(tài)表現(xiàn)，如腎小球腎炎的診斷，多種感染性疾病、各種代謝性疾病，細(xì)胞內(nèi)/外異常物質(zhì)沉積性疾?。ㄈ绲矸蹣幼冃裕?，肌活檢診斷等； HIV冠狀病毒分枝桿菌組織胞漿菌二、免疫組化的局限性至今無(wú)絕對(duì)特異的抗體！相當(dāng)多的腫瘤缺乏特異的抗原表達(dá)；同一種抗原常?？稍诙喾N腫瘤中表達(dá)，不少腫瘤又由于分化太差或細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)改變而不表達(dá)相關(guān)的抗原。 二、免疫組化的局限性不同抗體滴度有不同的陽(yáng)性結(jié)果：HBME-1 1:100 (推薦

8、濃度)間皮膜陽(yáng)性，幾乎所有腺癌胞漿陽(yáng)性1:200015000 僅僅間皮膜陽(yáng)性內(nèi)源性生物素：假陽(yáng)性（胞漿），如肝細(xì)胞及肝細(xì)胞癌二、免疫組化的局限性免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化（同一實(shí)驗(yàn)室及不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的一致性）、定量結(jié)果的判斷等還存在不少的問(wèn)題尚待解決。 三、如何正確應(yīng)用免疫組化 正確、有價(jià)值的免疫組化結(jié)果：免疫組化實(shí)驗(yàn)室規(guī)范、合適的技術(shù)操作（包括組織固定、抗原修復(fù)、檢測(cè)系統(tǒng)、各類試劑的質(zhì)量保證，染色技術(shù)等）是最重要的基礎(chǔ)保證；但病理醫(yī)生在組織塊的選擇，抗體的選擇，結(jié)果的判斷等方面也起著不容忽視的作用。 三、如何正確應(yīng)用免疫組化 1、組織塊的選擇首選有典型病變、分化較好、固定較好的組織塊。應(yīng)盡量選擇有正

9、常組織（有內(nèi)對(duì)照組織）的蠟塊。對(duì)固定時(shí)間較長(zhǎng)或未及時(shí)固定的組織，凍融后的組織或脫鈣后的組織應(yīng)盡可能地避免使用。 2. 抗體的選擇經(jīng)驗(yàn)性、知識(shí)性要求很高的一項(xiàng)藝術(shù)工作。選擇到組織合適的抗體費(fèi)用最小而又能完全達(dá)到目的。病理醫(yī)生須通過(guò)認(rèn)真觀察HE切片并聯(lián)系臨床相關(guān)信息，準(zhǔn)確地列出要鑒別的幾種可能性診斷。病理醫(yī)生對(duì)HE形態(tài)要熟練掌握，知識(shí)面廣，既不能撒大網(wǎng)似的羅列出太多的診斷，使費(fèi)用增加過(guò)多；也不能遣漏可能的診斷，造成誤診或再選擇抗體延遲報(bào)告時(shí)間。 CD302. 抗體的選擇另一方面病理醫(yī)生要對(duì)各種抗體的免疫反應(yīng)譜（包括交叉反應(yīng)）都十分熟悉：如CK不僅表達(dá)于上皮還可表達(dá)于肌纖維母細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞及間皮下

10、細(xì)胞等。并熟知各種腫瘤的免疫表型（包括異常的免疫組化表達(dá)）。 CK2. 抗體的選擇如何了解各種抗體的免疫反應(yīng)譜及各種腫瘤的免疫表型？產(chǎn)品目錄 ？專業(yè)書籍 ？新的文獻(xiàn) 專家咨詢 網(wǎng)上檢索 2. 抗體的選擇至今無(wú)絕對(duì)特異的抗體！無(wú)100%病例或腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性的抗體！選擇一組抗體而不是一個(gè)抗體“交叉陽(yáng)性”的原則：如癌與惡性黑色素瘤鑒別：選一個(gè)或二個(gè)低分化癌表達(dá)陽(yáng)性而惡黑陰性的抗體，如CK、EMA，同時(shí)還要選一個(gè)或二個(gè)惡黑表達(dá)陽(yáng)性而癌表達(dá)陰性的抗體，如S100，Melan-A。若染色結(jié)果與預(yù)期結(jié)果矛盾則應(yīng)考慮其他的診斷或核查免疫組化染色是否有問(wèn)題。 2. 抗體的選擇抗體選擇不僅要選準(zhǔn)，還要選足。一個(gè)可能

11、的診斷要選2個(gè)或多個(gè)抗體，以防腫瘤異常免疫表達(dá)造成誤診。如淋巴瘤分類診斷時(shí)，一組抗體中至少要包括2個(gè)以上的T細(xì)胞及B細(xì)胞標(biāo)志（CD3、CD43、CD20、CD79a等）。 CD432. 抗體的選擇先采用一線抗體，先確定一定的范圍，再應(yīng)用二線抗體進(jìn)一步明確診斷？可能由于一線抗體選擇太少，部分腫瘤有交叉反應(yīng)而導(dǎo)致開始就犯導(dǎo)向性的錯(cuò)誤，最終導(dǎo)致誤診。 EMAKappa 輕鏈Pre-pre B cellPre-B cellImmature B cellMature B cellActivated B cellPlasma cellPrecursor cells; antigen independent

12、Virgin B cells; antigen independentGerminal center & post-GC cells; antigen dependentTdTCD20, CD22CD19CD79aCD10Bcl-6CD138Cytoplasmic CD222. 抗體的選擇選擇同一類抗體時(shí)還要考慮到各種抗體的敏感性及特異性。首選當(dāng)然要選敏感性及特異性都好的抗體，但有些特異性雖然不高但有很高敏感性的抗體在不少情況下可能發(fā)揮更重要的作用。如S100。不同公司生產(chǎn)的同一類抗體可能敏感性及特異性有所不同，或要求的抗原修復(fù)方法等技術(shù)條件不同，應(yīng)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行選擇。 3. 結(jié)果

13、的判斷免疫組化染色最終是否能得到正確的結(jié)論，關(guān)鍵還要看對(duì)染色結(jié)果如何評(píng)價(jià)（解釋）。同一種染色結(jié)果可有不同的病理診斷。應(yīng)該首先核查一下染色反應(yīng)是否成功（這也是免疫組化室內(nèi)質(zhì)控的一個(gè)重要步驟）。評(píng)價(jià)染色反應(yīng)是否成功最好比較同一張切片中存在的正常組織，即所謂的內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照。 CKpanCD20 CK-7SMA CD3 CD203. 結(jié)果的判斷有不少染色或病例缺乏內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照，若對(duì)染色反應(yīng)有疑問(wèn)只能選用另外的陽(yáng)性對(duì)照片核實(shí)。若內(nèi)（或外）陽(yáng)性對(duì)照組織免疫反應(yīng)陰性，瘤組織陽(yáng)性則表明假陽(yáng)性；瘤組織陰性則表明假陰性。只有陽(yáng)性對(duì)照染色陽(yáng)性瘤組織反應(yīng)才屬真實(shí)。 3.結(jié)果的判斷除了內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照，還要看內(nèi)陰性對(duì)照是否有非特

14、異反應(yīng)。內(nèi)源性生物素造成的非特異染色（如在肝、腎及富含線粒體的細(xì)胞等），常常表現(xiàn)為非特異的胞漿陽(yáng)性?？傊?，只有陽(yáng)性對(duì)照染色陽(yáng)性，陰性對(duì)照組織又基本陰性，這樣的免疫組化染色結(jié)果才可信。 desmindesminSMA3. 結(jié)果的判斷 其次，要分析陽(yáng)性染色的部位（細(xì)胞的微解剖部位）是否正確: 如許多淋巴細(xì)胞的標(biāo)志（CD20，CD43，CD5，CD45RB，CD30，C-erbB2等）應(yīng)為膜陽(yáng)性，若胞漿彌漫陽(yáng)性間或細(xì)胞核陽(yáng)性則為假陽(yáng)性。反之，有的抗體染色應(yīng)為核陽(yáng)性（如ER，PR，TdT，Cyclin D1等），若胞漿或胞膜陽(yáng)性也為假陽(yáng)性。還有的抗體可表現(xiàn)為二種陽(yáng)性反應(yīng)類型，如S100，ALK可為核陽(yáng)

15、性也可伴有胞漿陽(yáng)性；CD30，CD15即可表現(xiàn)為細(xì)胞膜陽(yáng)性，也可表現(xiàn)為核旁高爾基區(qū)陽(yáng)性。 C-erbB-2 E-cadherinCD20 CD30PCNA PR ER TDTTTF-1 P 53Ki-67 Me l-AMel-pan ALK-1ALK-1ALK-1ALK-1CD30 CD15CEACEA C-Kit/CD1173. 結(jié)果的判斷隨著對(duì)免疫反應(yīng)靶分子部位的更深入了解，免疫反應(yīng)的形態(tài)也是重要的參考依據(jù)，如嗜鉻蛋白A，細(xì)胞毒標(biāo)志（粒酶B，穿孔素，TIA1）等陽(yáng)性反應(yīng)在胞漿內(nèi)應(yīng)呈顆粒狀，而CD79a等為胞漿彌漫陽(yáng)性，細(xì)胞角蛋白染色陽(yáng)性應(yīng)為胞漿細(xì)絲狀，若反應(yīng)類型不符可能也要懷疑為假陽(yáng)性。但

16、要精確觀察到陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)微類型表現(xiàn)必須切片薄，并采用高分辨率的顯色系統(tǒng)。 CD35 granzyme B3. 結(jié)果的判斷再者，確定免疫反應(yīng)陽(yáng)性的組織或細(xì)胞是否為腫瘤或有意義的組織/細(xì)胞。若腫瘤成份較少，彌散存在，可能會(huì)將周圍反應(yīng)性成份或殘余組織的陽(yáng)性反應(yīng)誤認(rèn)為腫瘤陽(yáng)性，導(dǎo)致錯(cuò)誤的診斷。如伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的未分化癌（鼻咽未分化癌），富于T細(xì)胞的大B細(xì)胞淋巴瘤，瘤組織中殘余的橫紋肌，脂肪組織等。還有的細(xì)胞（如肥大細(xì)胞）可對(duì)多種抗體表達(dá)陽(yáng)性反應(yīng)，應(yīng)注意區(qū)別。 3. 結(jié)果的判斷免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果較陰性結(jié)果更有意義，陰性結(jié)果：可能抗原的確不存在，或抗原含量低，組織處理時(shí)抗原丟失，染色方法不敏感或操

17、作有誤。 3. 結(jié)果的判斷應(yīng)用于鑒別診斷或證實(shí)診斷的免疫組化染色多為定性觀察，定量沒有太大的意義。但用于預(yù)后，增殖指數(shù)、激素受體等檢測(cè)的免疫組化染色不僅要做定性觀察，還應(yīng)該做定量的評(píng)價(jià)才對(duì)臨床有價(jià)值。 CK 滑膜肉瘤3. 結(jié)果的判斷遺憾的是目前由于實(shí)驗(yàn)室間未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，因此定量的標(biāo)準(zhǔn)（域值）尚無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，如ER受體，有的實(shí)驗(yàn)室只要有陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞就視為陽(yáng)性，而有的實(shí)驗(yàn)室要至少20細(xì)胞陽(yáng)性才視為陽(yáng)性，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)往往是隨意確定的，未經(jīng)臨床病理研究證實(shí)。3. 結(jié)果的判斷單單免疫組化染色結(jié)果無(wú)任何診斷價(jià)值！ 免疫組化診斷時(shí)結(jié)合HE形態(tài)十分重要：抗體的選擇及結(jié)果的判斷都要以HE形態(tài)為依據(jù)。免疫組化診斷的一

18、個(gè)重要原則！當(dāng)免疫組化最后結(jié)果出乎意料之外，與HE預(yù)期結(jié)果差別很大時(shí)首先要核查免疫組化染色中存在的問(wèn)題；若確實(shí)免疫組化染色無(wú)誤，要進(jìn)一步核實(shí)（查閱文獻(xiàn)/上網(wǎng), 專家，產(chǎn)品目錄？）是否有不了解的交叉反應(yīng)或異常表達(dá)。 3. 結(jié)果的判斷如果免疫組化染色結(jié)果確定可信，則不能不考慮另外的診斷，并要結(jié)合臨床、影像學(xué)等檢查結(jié)果綜合分析后才能否定原來(lái)的HE診斷。出現(xiàn)這樣的情況可能是新文獻(xiàn)了解不全面，對(duì)某些腫瘤特殊的HE形態(tài)表現(xiàn)尚未了解，或的確有新的特殊的形態(tài)表現(xiàn)如印戒細(xì)胞型濾泡淋巴瘤，小細(xì)胞型的大細(xì)胞間變型淋巴瘤，上皮樣硬化性纖維肉瘤，肝臟血管平滑肌脂肪瘤，酷似少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤的中樞神經(jīng)細(xì)胞瘤，脊索瘤樣腦膜瘤等。免疫組化在病理診斷中的正確應(yīng)用觀念不斷更新 及時(shí)更新抗體（組織細(xì)胞標(biāo)記，myoglobin， vimentin，等）新應(yīng)用抗體（p63，calponin，E-Cadherin, TTF-1, et al)新反應(yīng)（CD10, CD34, CD99，et al)新pattern不斷地學(xué)習(xí)，使這項(xiàng)技術(shù)得以正確的應(yīng)用，達(dá)到確診的目的。免疫組化在病理診斷中的正確應(yīng)用抗體的新反應(yīng)：CD10：粒細(xì)