2022時差成像技術在臨床應用中的進展（全文）

1、2022時差成像技術在臨床應用中的進展(全文)摘要隨著對體外胚胎形態(tài)學參數(shù)、時差動力學參數(shù)的認知，時差成像技術 (time-lapse technology , TLT )已經(jīng)進入了一個快速發(fā)展的階段。TLT 能實時連續(xù)記錄胚胎從受精、卵裂、囊胚形成的各項細節(jié)圖像并發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng) 觀察胚胎技術不能發(fā)現(xiàn)的細節(jié)，為胚胎篩選提供依據(jù)。此外，TLT還能在 臨床應用、實驗室質(zhì)量控制中發(fā)揮作用。與此同時，TLT在體外胚胎發(fā)育 分析、人工智能開發(fā)中也存在問題，本文將對其進行探討。時差成像技術(time-1叩se technology , TLT )融合了胚胎體外培養(yǎng)及 計算機控制的實時觀察系統(tǒng)。TLT培養(yǎng)體系可降

2、低離箱操作所引起的胚胎 應激基因的表達；而TLT系統(tǒng)長波光的照射強度遠低于傳統(tǒng)培養(yǎng)等。1997年至2010年間，TLT僅作為記錄胚胎發(fā)育基礎數(shù)據(jù)的培養(yǎng)系統(tǒng)， 2011年后隨著體外胚胎形態(tài)學參數(shù)、時差動力學參數(shù)逐漸被認知，TLT 進入了一個快速發(fā)展的階段。與傳統(tǒng)體外受精(in vitro fertilization ,IVF ) 技術比較，TLT能實時連續(xù)記錄胚胎從受精、卵裂、囊胚形成的各項細節(jié) 圖像并發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)觀察胚胎技術不能發(fā)現(xiàn)的細節(jié)，為胚胎篩選提供依據(jù)。此 外，TLT可為胚胎發(fā)育過程、胚胎碎片產(chǎn)生及非整倍體產(chǎn)生等重要問題的 機制研究提供依據(jù)1-2 近年來,隨著對TLT的持續(xù)研究,更多關于 員

3、的培訓及管理提出了全新的標準，對信息處理及圖像分析提出了全新的 挑戰(zhàn)，也改變了日常的實驗室操作流程，對管理層、醫(yī)師及胚胎學家提出 了全新的挑戰(zhàn)，也給出了更多的可能性。TLT在胚胎評估中的研究和報道相繼出現(xiàn)3-6 1-TLT的應用現(xiàn)狀及臨床意義TLT實時記錄胚胎發(fā)育的時間點，包括極體排出、原核形成/消失、第一次 卵裂、后續(xù)各期卵裂、桑根胚的細胞融合、囊胚腔形成、囊胚擴張及孵出 等。TLT通過詳實的記錄，擴展了傳統(tǒng)形態(tài)學評估的認知：異常卵裂(1-3 分裂)7 、卵裂球不規(guī)則分裂8 1囊胚致密化9 等現(xiàn)象的認識離不 開TLT的實時記錄，TLT還可用于分析細胞質(zhì)中無規(guī)則的原核運動3 1 原核同步性3

4、1雌原核的異常運動8 1卵裂溝的位置10 等細節(jié)現(xiàn) 象。Coticchio等11 提出的時差動力學參數(shù)對于TLT系統(tǒng)和IVF都具有重 要的意義，時差動力學參數(shù)成為預測臨床結(jié)局的有力工具。囊胚形成預 測參數(shù)：原核的形成與消失12 1第一次卵裂持續(xù)時間13 1第一與第 二次有絲分裂的間隔、第二與第三次卵裂間隔。胚胎著床預測參數(shù)：第 二極體排出時間(the time of the second polar body emission , tPB2 原核消失的時間(time to pronuclear fading , tPNf 二分裂時間(time of cleavage to a two-cell

5、 embryo , t2 )、四分裂時間(time of cleavage to a four-cell embryo , t4 )、囊胚孵出時間(time to hatching blastocyst, tHN )等14-17 1在幾項前期的研究報告中顯示，校正超促排卵方案、患者年齡、胚胎移植類型和獲卵數(shù)等基線后，研究顯示2-細胞期卵裂球不均的囊胚以及4-細 胞多核胚胎會阻礙著床18-19在一項回顧性隊列研究中，出現(xiàn)2-3分裂的胚胎著床率低于正常卵裂的胚胎(1.2%比20.2% , P0.05 ) 7 L 一項對243位患者的299個胚胎進行不同時長囊胚培養(yǎng)的時差動力學分 析顯示：受精后25

6、.9 h內(nèi)第一次分裂形成2-細胞,37.9 h內(nèi)第二次分裂 形成4-細胞的胚胎及79.9 h內(nèi)達到囊胚期的胚胎與未在此時間內(nèi)完成分 裂的胚胎相比妊娠率較高(74.6%比40.9% , P0.01 )201 Azzarello 等21 比較了活產(chǎn)與未著床胚胎的原核形態(tài)和動力學變化，顯示活產(chǎn)組 原核消失時間更長(24.90.6 ) h 比(23.30.4 ) h , P=0.022 1此 外,原核消失發(fā)生在20.8 h前與活產(chǎn)相關。Amir等22 報道，與平衡 易位染色體的胚胎相比，非平衡易位胚胎時間動力學參數(shù)異常，自受精至 4-細胞期及囊胚形成時間延長(38.24.5) h比(39.54.8)

7、h ;( 100.1 7.3 ) h比(103.79.3 ) h，均P0.05 )。此夕卜，非平衡易位胚胎在 原核消退時表現(xiàn)出顯著延遲(24.13.3 ) h比(23.43.6 ) hF=0.011 1 近年來 多項研究報道了不規(guī)則分裂，囊胚開始時間(start of blastulation , tSB 1 囊胚擴張時間(time to expanded blastocyst, tEB )、間隔時間(tEB-tSB )以及整倍體和非整倍體狀態(tài)與著床率之間相關性23-24 , 利用TLT,存在非侵入性選擇染色體正常胚胎的可能性。另有納入5個隨機對照試驗randomized controlled

8、 trial ,RCT洪1637 名研究對象的meta分析表明,與傳統(tǒng)培養(yǎng)和評估相比，TLT能夠提高妊 娠率(51.0%比 39.9% 0.001 )、活產(chǎn)率(44.2%比 31.3% ?=0.009 ), 降低流產(chǎn)率(15.3%比21.3% , P=0.019 )251但最近一項包含9個 RCT共2955名研究對象的分析顯示，TLT培養(yǎng)與傳統(tǒng)培養(yǎng)胚胎結(jié)局在活 產(chǎn)率、流產(chǎn)率或臨床妊娠率上的差異是否具有統(tǒng)計學意義尚無定論26 1 同樣，其他meta分析也無法證實TLT對胚胎結(jié)局的影響10,27-28 L 由于研究證據(jù)的質(zhì)量差異，TLT培養(yǎng)和評估體系在活產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率、 流產(chǎn)和死產(chǎn)率或臨床妊娠率

9、方面與傳統(tǒng)培養(yǎng)是否存在差異還有待繼續(xù)研 究。-TLT在實驗室質(zhì)量控制中的應用以傳統(tǒng)的實驗室質(zhì)量控制指標(key performance index , KPI)進行日 常管理(包括培養(yǎng)箱數(shù)量/類型、培養(yǎng)液組成、氧濃度、培養(yǎng)皿、人員操作 等)易導致信息延滯的困擾，如以臨床妊娠或胚胎著床考察人員或培養(yǎng)體 系需追溯28 d左右，對臨床工作及患者造成質(zhì)量控制的滯后性。之前的 實驗表明，在培養(yǎng)液中加入過氧化異丙苯，胚胎呈現(xiàn)出與正常培養(yǎng)基不同 的時差動力學參數(shù)29 1并且在不同培養(yǎng)液、不同空氣質(zhì)量的培養(yǎng)環(huán)境 中30 ,時差動力學參數(shù)比形態(tài)學、囊胚形成率在不同培養(yǎng)液中反應更 敏感。這些研究表明，不同的培養(yǎng)體

10、系可能造成時差動力學參數(shù)的不同。 將時差動力學參數(shù)引入質(zhì)控，在胚胎培養(yǎng)23 d就可以判斷操作培養(yǎng)體系 存在的問題。時差動力學參數(shù)可以精細量化時間，其敏感性優(yōu)于囊胚形成 率且可以縮短質(zhì)控周期，基于上述原理，TLT及時差動力學參數(shù)可能優(yōu)化 傳統(tǒng)的實驗室質(zhì)控流程。= TLT應用中需要注意的問題.安全性：胚胎暴露于一定強度、某些波長的光源中可能影響胚胎發(fā)育。 有證據(jù)表明，光照對胚胎發(fā)育有負面影響，藍光(400-500 nm )相比紅 光、橙光等更可能導致氧化應激31 ;損傷作用不僅與光譜組成相關， 與光照的強度和曝光時間亦呈相關性。TLT標量輻照度、光暴露低于傳統(tǒng) 形態(tài)學評估，在將胚胎培養(yǎng)至57 d的

11、TLT系統(tǒng)觀察期，TLT曝光時間總 量明顯低于傳統(tǒng)形態(tài)學評估18 1與常規(guī)胚胎培養(yǎng)相比，TLT可保持關 鍵環(huán)境參數(shù)的穩(wěn)定性(如溫度、二氧化碳濃度、氧含量等)32 ,減少將 胚胎取出培養(yǎng)箱導致培養(yǎng)環(huán)境變化對胚胎的影響。多項研究報告稱，TLT 為胚胎的觀察、研究和臨床應用提供了目前認為安全的環(huán)境，與傳統(tǒng)標準 培養(yǎng)箱相比，在TLT體系中進行胚胎培養(yǎng)有助于胚胎發(fā)育及胚胎評估，但 仍缺乏相關的RCT作為依據(jù)33-34 L.與患者的交互性：借助于TLT的記錄系統(tǒng)，實驗室工作人員可為患者提 供胚胎發(fā)育的圖像，而不再是枯燥的數(shù)字及符號。但考慮到專業(yè)與復雜性, 與患者溝通胚胎形態(tài)動力學相關專業(yè)信息時，患者可能無

12、法理解其含義, 醫(yī)生需要耐心向患者進行解釋。需要說明的是：TLT并不能精準識別胚胎 著床發(fā)育潛能，僅能根據(jù)已有的TLT分析數(shù)據(jù)對胚胎移植順序進行分類； TLT能否改善臨床結(jié)局目前仍然缺乏足夠的證據(jù)35-37 I.信息化大數(shù)據(jù)與人工智能(artificial intelligence , AI):近年來，隨著 學習算法的進步，電子醫(yī)療數(shù)據(jù)的增加和計算處理能力的提高，AI以一種 用于多參數(shù)分析的無偏倚方法參與到數(shù)據(jù)分析中。在使用TLT的前提下, 嘗試使用更強大的計算機處理能力分析大量的圖像數(shù)據(jù)集，以確定可能與 胚胎發(fā)育能力相關的參數(shù)。AI不只是依賴于胚胎學家的訓練來分析胚胎特 征，而是對胚胎的整個

13、圖像進行評估，允許對所有可用數(shù)據(jù)進行量化，從 而識別胚胎學家人眼無法識別的形態(tài)學特征。先前的研究運用形態(tài)動力學分析方法36 , 38 ,基于研究胚胎發(fā)育中已知事件（如早期卵裂等）對這些已知事件進行評分。目前，通過利用經(jīng)典機器學習方法，如支持向量機（support vector machines , SVM ）和 隨機森林以及深度學習方法，如卷積神經(jīng)網(wǎng)絡（convolutional neuralnetworks , CNN ） 39-40 來進行結(jié)果預測或等級分類，基于從數(shù)據(jù)中 的層次學習，通過多層的相互連接的神經(jīng)元處理信息41 L AI可以直接分析整個原始延時視頻，利用從TLT采集的每個數(shù)據(jù)點

14、來進行胚胎評估。到目前為止，已有幾種AI方法被用于評估囊胚。圖像分割和先進的圖像 分析技術，使用具有紋理描述符的神經(jīng)網(wǎng)絡、水平集、相位一致性和擬合 橢圓方法已經(jīng)在小鼠42 牛39 和人43 的囊胚中被證實。有研 究利用CNN的深度學習算法與胚胎學家分別對97例患者的胚胎進行雙 盲評估，研究顯示CNN的深度學習算法選擇高質(zhì)量胚胎的準確率高于胚 胎學家（單胚胎移植周期：63.9%比52.8% , P0.05 ;雙胚胎移植周期: 79.4%比72.4% , P0.05 ）,利用AI在鑒定具有高發(fā)育潛力的胚胎方面超 過胚胎學家的能力44 L在胚胎存活率評估中,Rocha等45 報道, AI能在選擇第5

15、日具有高植入潛力的胚胎以及在預測胚泡發(fā)育方面表現(xiàn) 出高度的準確性。Segal等46 利用隨機森林，利用2744個胚胎進行 形態(tài)學評估來預測胚胎發(fā)育情況，準確率達76.4% ,敏感度為55.0% ,特 異度為87.8%0此外Iwata等47 利用基于CNN的深度學習方法結(jié)合 TLT,對118個人類胚胎進行監(jiān)測，以確定質(zhì)量良好的胚胎。通過驗證不 同的細胞階段預測胚胎質(zhì)量，數(shù)據(jù)集精確度達到70%90%。此外，AI 對體外胚胎發(fā)育時的形態(tài)動力學數(shù)據(jù)分析預測了捐卵周期的活產(chǎn)情況，準 確率超過90.0% ,預測被選擇胚胎自然流產(chǎn)的準確率達77.0% 48L研 究證實整倍體胚胎和非整倍體胚胎有不同的動力學行

16、為49 logistic 回歸分析在校正超促排卵方案、患者年齡、不孕年限、激素水平(抗苗勒 管激素、卵泡刺激素、雌二醇)、胚胎移植類型和獲卵數(shù)等基線后，分析 胚胎出現(xiàn)2-細胞到5-細胞(t5-t2 3-細胞到5-細胞(cc3 )分裂情況時， 與胚胎非整倍體的相關性。以是否為整倍體胚胎為自變量，胚胎出現(xiàn)2- 細胞到 5-細胞(OR=2.85 , 95% CI=1.764.62 )、3-細胞到 5-細胞 (OR=2.10,95% Q=1.363.24 )分裂情況時，預示著胚胎為非整倍體 的可能性增大。利用TLT發(fā)現(xiàn)這些差異，結(jié)合AI可提高非侵入性選擇正 常胚胎的概率。但AI預測染色體整倍性也受置于

17、胚胎植入前非整倍性檢測(preimplantation genetic testing for aneuploidy , PGT-A )的診斷精度。嵌合體是PGT檢測里的一項熱點問題,活檢位置決定著能否獲取 真實的結(jié)果如活檢位置可能在:正常滋養(yǎng)外胚層細胞(tropheetoderm ,TE 異常TE及復合TE細胞的位置,而現(xiàn)在的AI研究對標的結(jié)果就是PGT-A的診斷結(jié)果，因此AI研究面臨著遭遇與PGT-A假陰性結(jié)果的可能性。目前所做的AI還處于早期胚胎的研究，而胚胎在桑意胚及囊胚期存 在修復機制，是否會修復早期的非整倍體胚胎也需要相關的研究證實。未來的AI和TLT必將結(jié)合機器學習以促進對大型數(shù)

18、據(jù)集的復雜分析,進 而顯示目前尚未識別的視覺標記組合。AI與TLT結(jié)合需借助于海量人工標 注、分辨胚胎構(gòu)成如胚胎不同發(fā)育階段及相應的細節(jié)現(xiàn)象，對技術人員專 業(yè)度及工作效率也是嚴峻考驗?，F(xiàn)有部分研究已對AI及TLT聯(lián)合運用有 初步成果，如利用通過卷積網(wǎng)絡運算，識別原核數(shù)、原核位置、原核大小、 卵裂模式等7 0部分結(jié)果已經(jīng)顯示出人工智能評分等與胚胎質(zhì)量的相關 性50 1但胚胎學家們尚無法根據(jù)圖像信息判斷胚胎是否異常，同樣AI也存在無 法精確識別胚胎質(zhì)量的問題。且由于AI系統(tǒng)的暗箱算法無法鑒別參數(shù)意 義，因此標記可能出現(xiàn)誤判或出現(xiàn)假陽性結(jié)果，臨床AI應用仍需要進行 大量驗證，以評估AI利用效能。.人員配置與硬件優(yōu)化:目前TLT圖像分析由胚胎實驗室人員一對一完成, 借助動力學參數(shù)評價胚胎發(fā)育存在耗時長、主觀性強等問題，應建立一個 新的技術崗位，經(jīng)過專業(yè)培訓后負責TLT信息采集工作?，F(xiàn)階段已知TLT 能夠提供時差動力學參數(shù)及記錄胚胎發(fā)育細節(jié)，但仍缺少一個標準系統(tǒng)和 軟件綜合分析TLT記錄的各項時差動力學參數(shù)，無法自動告知胚胎學家體 外培養(yǎng)胚胎的情況以選擇可