基因工程外源基因的工程表達

1、外源基因的工程表達基因工程技術的核心是基因表達技術。基因重組的主要目的是要使目的基因在某一細胞中能得到高效表達。基因表達在原核生物與真核生物中的差別外源基因的起始轉(zhuǎn)錄mRNA的延伸與穩(wěn)定外源基因mRNA的有效翻譯表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性第一節(jié) 外源基因表達的機制1、外源基因的起始轉(zhuǎn)錄 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達的關鍵步驟。轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達的限速步驟。原核生物啟動子誘導型啟動子：組成型啟動子：如lac、trp等的啟動子如T7噬菌體的啟動子2、mRNA的延伸與穩(wěn)定外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達的關鍵。防止因轉(zhuǎn)錄提前終止存在正常的轉(zhuǎn)錄終止序列3

2、、外源基因mRNA的有效翻譯外源基因mRNA有效翻譯必須考慮的基本原則：ATG起始密碼子。SD序列在翻譯起始區(qū)周圍序列不易形成明顯的二級結構。密碼子的選擇性主密碼子 （major codon）罕用密碼子（rare codon）脯氨酸 CCA CCT CCC（大腸桿菌） CCG（人）4、表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性4.1 避免外源基因表達蛋白降解的對策：構建融合蛋白表達系統(tǒng)構建分泌蛋白表達系統(tǒng)構建包涵體表達系統(tǒng)選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)第二節(jié) 外源基因表達系統(tǒng)外源基因表達系統(tǒng)：泛指目的基因與表達載體重組后，導入合適的受體細胞，并能在其中有效表達，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）。外源基因表達系統(tǒng)

3、基因表達載體受體細胞基因表達系統(tǒng)原核生物基因表達系統(tǒng)真核生物基因表達系統(tǒng)（一）大腸桿菌基因表達載體1、大腸桿菌基因表達載體DNA復制及重組載體的選擇系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)（1）DNA復制及重組載體的選擇系統(tǒng)1.1 復制子常見的復制子松弛復制型，每細胞質(zhì)?？截悢?shù)1020個。嚴謹復制型，每細胞質(zhì)?？截悢?shù)少于5個。1.2 選擇標記微生物表型選擇標記顯性標記營養(yǎng)缺陷型標記（2）外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)這一系統(tǒng)包括啟動子、抑制物基因和轉(zhuǎn)錄終止子。抑制物基因（3）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)3.1 核糖體結合位點（SD序列）3.2 翻譯起始密碼子3.3 翻譯終止密碼子由于UAA同時為兩個釋放因子所識

4、別，一般被選作翻譯的終止密碼。起始密碼子是翻譯的起始位點，通常為AUG（ATG），編碼甲硫氨酸（MET），是首選的起始密碼子。3.1 核糖體結合位點影響翻譯的因素核糖體與mRNA的結合程度大腸桿菌SD序列的堿基組成為5 -AGGAGG -3SD序列與起始密碼子之間的距離SD序列與起始密碼子之間的堿基組成（4）常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)Lac和Tac表達系統(tǒng)：是以lac操縱子調(diào)控機制為基礎設計和構建的表達系統(tǒng)。PL和PR表達系統(tǒng)：是以噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子PL和PR構建的。T7表達系統(tǒng)：是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構建的表達系統(tǒng)。4.1 Lac和Tac表達系統(tǒng)由啟動子Plac + 操縱基因la

5、cO + 外源基因組成。Tac=Trp(-35)+PlacLacI PLac4.2 PL和PR表達系統(tǒng)噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR 構建的載體，這兩個強啟動子受控于噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR 啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開始轉(zhuǎn)錄。PL/PRcI857(ts)4.3 T7表達系統(tǒng)T7噬箘體基因編碼的T7 RNA聚合酶選擇性的激活T7噬箘體啟動子的轉(zhuǎn)錄。受體菌通常為E.coli.BL21(DE3)（4） 外源基因的表達形式（一）不溶性蛋白-包涵體蛋白1. 包涵體：在一定條件下，外源基因的表達產(chǎn)物在大腸桿菌中

6、積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結構，這種結構稱為包涵體。2. 包涵體存在部位：細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)3.包涵體的組成蛋白質(zhì)非蛋白質(zhì)外源基因的表達產(chǎn)物：占大部分，具有正確的氨基酸序列，但空間構相錯誤，因而包涵體蛋白一般沒有生物學活性。受體細胞本身的表達產(chǎn)物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達載體編碼的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。4.包涵體形成的本質(zhì) 是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集，主要包括三個方面：折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；蛋白質(zhì)折疊中間體的作用。5. 形成包涵體的原因基因工程菌的表達產(chǎn)率過高重組蛋白的氨基酸組成重組蛋白所處的溫度與pH值重組蛋白是

7、大腸桿菌的異源蛋白6.包涵體純化破菌： 1、機械破碎 2、超聲破碎 3、化學方法破碎 4、溶菌酶處理分離： 離心：5000-20000g，15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。 洗滌： 通常用低濃度的變性劑如2M尿素洗滌，用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。 溶解： 常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍，通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。7. 包涵體復性方法稀釋復性透析復性超濾復性柱上復性（二）可溶性蛋白-融合蛋白融合蛋白將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，以這種方式表達的蛋白稱為融合蛋白。1.融合

8、蛋白與單獨表達的外源蛋白相比具有以下優(yōu)點：可溶性狀態(tài)存在表達效率高穩(wěn)定性好較易于分離純化2.融合表達的親和純化蛋白標簽個子越小越好生理條件下帶電越少越好 容易得到和天然蛋白相似的產(chǎn)物融合標簽的免疫原性越少越好 融合產(chǎn)物不必除去標簽可直接作為抗原免疫 2.1 His蛋白標簽特點優(yōu)勢6組氨酸與Ni-NTA的結合是不受構象影響的在天然或變形的條件下進行一步純化使用的是溫和的洗脫液環(huán)境結合、洗滌和洗脫步驟不會對蛋白結構產(chǎn)生影響6組氨酸標簽比普通的標簽（Tag）要小得多純化后蛋白可以直接進行下游操作6組氨酸可以用于任何表達系統(tǒng)，包括：細菌、桿狀病毒和哺乳動物6組氨酸標簽在生理溶液pH下不帶電荷標簽不會干

9、涉重組蛋白的結構和功能6組氨酸不會影響蛋白的分泌6組氨酸標簽免疫原性差重組蛋白可以不需要除去標簽直接作為抗原進行免疫利用Xa因子蛋白酶可以方便地將6組氨酸標簽有效地切除去除標簽的蛋白可以用作晶體成像或者核磁共振研究2.2 His蛋白標簽類型N末端加入標簽C末端加入標簽順式抑制載體多系統(tǒng)表達載體含有雙標簽載體2.3 GST融合表達系統(tǒng)表達融合蛋白物是在載體上接上了一種的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因。2.4 pGEX表達融合蛋白的優(yōu)越性載體構建無需考慮SD及RBS序列由于載體自帶LacI基因，對宿主無選擇性蛋白純化條件溫和，有利于保持蛋白活性GST蛋白與目的蛋白分離簡便（二）酵母基因表達載體酵母基因表達系統(tǒng)

10、的載體一般是一種穿梭質(zhì)粒，能在酵母菌和大腸桿菌中進行復制。1. DNA復制起始區(qū)在大腸桿菌中復制的復制起始序列在酵母菌中引導進行自主復制的序列2. 選擇標記營養(yǎng)缺陷型選擇標記：它與宿主的基因型有關。3. 有絲分裂穩(wěn)定區(qū)4. 表達盒表達盒由啟動子、分泌信號序列和終止子等組成，是酵母表達載體的重要元件。第三節(jié) 外源基因表達產(chǎn)物的檢測外源基因表達產(chǎn)物檢測的過程就是對特異性mRNA或蛋白質(zhì)的檢測。檢測特異性mRNA的方法Northern雜交法檢測特異性蛋白質(zhì)的方法報告基因的酶法檢測免疫學檢測法生物學活性檢測法定量RT-PCR法一、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測1. 定量RT-PCR技術 可以檢測外源基因是否轉(zhuǎn)

11、錄出mRNA及mRNA表達水平PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系 一、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測1. 定量RT-PCR技術1.1 熒光染料和熒光探針1.1.1 SYBR Green I一、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測1. 定量RT-PCR技術1.1 熒光染料和熒光探針1.1.2 分子信標（molecular beacon）一、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測1. 定量RT-PCR技術1.1 熒光探針和熒光染料 1.1.3 TaqMan 探針一、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測1. 定量RT-PCR技術1.1 熒光探針和熒光染料 1.1.3 LUX Primers 一、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測2. Northe

12、rn雜交技術 可以檢測外源基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。提取總RNA分離mRNA。制備DNA探針。Northern雜交。2.1 Northern雜交的步驟：Northern 雜交Southern雜交、報告基因的酶法檢測報告基因必須具備兩大特點：其表達產(chǎn)物及其功能在未轉(zhuǎn)化的細胞中并不存在；其表達產(chǎn)物便于檢測。二、外源基因蛋白產(chǎn)物的檢測2008年度諾貝爾化學獎 下村修錢永健馬丁查爾菲Beta桶狀結構，直徑30 高40 外部有11個反向平行的beta折疊（綠色）內(nèi)部有alpha螺旋（亮藍色）中心部有一個熒光基團（黃色）2.1.1 GFP（Green Fluorescent Protein）結構特點熒光穩(wěn)定

13、檢測方便無種屬特異性,也沒有細胞種類和位置的限制GFP 對受體細胞基本無毒害不受假陽性干擾。不需任何反應底物和輔助因子; 可制成永久標本。靈敏度高。2.1.2 GFP 用作標記蛋白具有的優(yōu)點增強型GFP 熒光強度提高了35 倍人工GFP 適合在哺乳動物細胞中高效表達紅移熒光蛋白 更適于普通熒光顯微鏡觀察藍色熒光蛋白可用作指示劑的GFP 突變型 如p H敏感GFP 被用來測量細胞器或更小顆粒 的p H ,并記錄其變化。2.1.3 改進型GFP類型Application of AFPs for studying microbe-plant interactions. (a) Dual-labeli

14、ng experiment showing colonization of tomato roots by P. Fluorescens and P. chlororaphis (b) Visualization of Rhizobia in the infection thread during nodulation . Alfalfa seedlings were inoculated with mixed cultures of Sinorhizobium meliloti, labeled with GFP or DsRed, and the infection process obs

15、erved (d) Biocontrol interaction between fungi visualized with GFP.、免疫學檢測免疫沉淀法放射免疫法Western雜交法Western印跡法流程蛋白質(zhì)的提取SDS分離蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)條帶印跡探針制備雜交檢測Western電轉(zhuǎn)移裝置Western印跡法流程蛋白質(zhì)的提取SDS分離蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)條帶印跡探針制備雜交檢測、表達產(chǎn)物生物學活性檢測 第四節(jié) 基因表達產(chǎn)物的分離純化一、基因表達產(chǎn)物分離純化的步驟：細胞破碎離心分離柱層析電泳1、細胞的破碎細胞破碎方式變性劑裂解法超聲波破碎法機械破碎法酶裂解法2、離心分離離心力一般在數(shù)萬g范圍以內(nèi)，主要

16、用來去除未破碎的細胞和細胞壁碎片等；高速離心：超速離心：離心力一般100,000g以上，可用來去除細胞膜碎片等高分子復合物。附：離心力和轉(zhuǎn)速的換算公式：RCF=11.18(N/1000)2rRCF：相對離心力，單位為重力加速度gN：轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)速度（轉(zhuǎn)速），用r/min表示r：轉(zhuǎn)頭半徑，為離心管中軸底部內(nèi)壁到離心機轉(zhuǎn)軸中心的距離，單位為厘米（cm）3、特異性表達蛋白的初步分離沉淀法：超濾濃縮法：根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同而進行初步分離的一種方法。簡便有效，能處理大量的樣品、并除去大量的雜蛋白。常用硫酸氨或有機溶劑4、柱層析柱層析純化蛋白質(zhì)的步驟：裝柱柱平衡上樣洗脫分部收集檢測5、聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE-半乳糖苷酶 ；乳酸菌；沙克乳桿菌細菌素 Figure 1. Schematic overview of the pEH plasmids used in this study.256rep: replication determinants; lacLM: structural gene; erythromy