耐膽酸革蘭陰性菌檢查法-供參考

1、耐膽酸革蘭陰性菌、大腸埃希菌和沙門菌檢查法1所用方法：平皿法1.1.培養(yǎng)基制備：1.1.1.腸道菌增菌液體培養(yǎng)基制備：1.1.1.1.取脫水腸道菌增菌液體培養(yǎng)基加水配制后，按驗證過的高壓滅菌程序滅菌備用。1.1.2.紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基制備：1.1.2.1.取脫水紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基加水配制后，按驗證過的高壓滅菌程序滅菌備用。1.1.3.胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備：1.1.3.1. 取脫水胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加水配制后，按驗證過的高壓滅菌程序滅菌備用。1.2.供試品檢查：1.2.1.陽性對照試驗：各取不大于100cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌接入腸道菌增菌液體培養(yǎng)基和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂

2、培養(yǎng)基中，在規(guī)定的溫度和最短的時間下培養(yǎng)，應檢出相應的控制菌。1.2.2.陰性對照試驗：1.2.2.1以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調(diào)查。1.2.3.供試液制備和預培養(yǎng): 1.3.3.1.取供試品，用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法” 制成1 : 10供試液，混勻，在2025C培養(yǎng)，培養(yǎng)時間應使供試品中的細菌充分恢復但不增殖(約2小時)。1.2.4.定性試驗：1.2.4.1. 除另有規(guī)定外，取相當于l g 或lm l供試品的上述預培養(yǎng)物接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體

3、培養(yǎng)基中，3035C培養(yǎng)2448小時后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035C培養(yǎng)1824小時。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。1.2.5.定量試驗：1.2.5.1選擇和分離培養(yǎng) 取相當于0.1g 、O.Olg和O.OOlg(或0. 1ml、0. 01ml和0. OOlml) 供試品的預培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，303 5C培養(yǎng)244 8小時。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035*C培養(yǎng)182 4小時。1.2.6.結果判斷 1.2.6.1若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有

4、菌落生長，則對應培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結果，從表2查l g 或lm l供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。1.3.大腸埃希菌1.3.1.供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105)” 制成1 : 1 0供試液。取相當于l g 或lm l供試品的供試液，接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035C培養(yǎng)1824小時。（2）選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物l m l接種至1 0 0 m l麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244*培養(yǎng)244 8小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035C

5、培養(yǎng)1872小時。1.3.2.結果判斷 若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。1.4.沙門菌1.4.1.供試液制備和增苗培養(yǎng)取1 0 g或1 0 m l供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，303 5C培養(yǎng)182 4小時。1.4.2.選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物0 . 1 m l接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，3035C培養(yǎng)182 4小時。取少量R V沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，303 5 t：培養(yǎng)1848小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)182 4小時，或采用其他適宜方法進一步鑒定。1.4.3.結果判斷 若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或三