輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病的風(fēng)險評價和機(jī)制研究

1、輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病的風(fēng)險評估和機(jī)制研究項目名稱：輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病的風(fēng)險評估和機(jī)制研究首席科學(xué)家：黃荷鳳浙江大學(xué)起止年限：2012.1 至2016.8依托部門：教育部浙江省科技廳一、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究內(nèi)容,一,關(guān)鍵科學(xué)問題面對嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病發(fā)生率高、發(fā)病機(jī)制不清、源頭防治困難的 挑戰(zhàn)，以及輔助生殖出生子代已成為新人口重要組成部分、遠(yuǎn)期風(fēng)險亟待評估的現(xiàn) 狀,結(jié)合慢性成年期疾病胚胎起源的新學(xué)說，依據(jù)小鼠實驗已證實ART可引起子代高 血壓和糖代謝異常，以及ART子代低出生體重和出生缺陷顯著增高的事實，本項目擬 解決的關(guān)鍵科學(xué)問題為，人類輔助生殖技術(shù)及父/母源性生殖障礙是否干擾

2、配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育而增 加子代胚胎源性疾病風(fēng)險，相關(guān)發(fā)病機(jī)制如何，1、輔助生殖技術(shù)及父/母源性生殖障礙是否干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育，其關(guān) 鍵因素、作用時間窗、作用途徑如何，2、干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育是否增加子代糖尿病、心血管疾病等胚胎源性 疾病風(fēng)險及生育力低下的易感性，相應(yīng)機(jī)制如何，是否存在傳代效應(yīng)，3、胚胎源性疾病是否有相應(yīng)生物預(yù)警標(biāo)記物，消減孕前不良暴露或?qū)嵤┏錾?干預(yù)可否降低胚胎源性疾病的發(fā)病風(fēng)險，二，研究內(nèi)容，胚胎源性疾病發(fā)病機(jī)制不清,輔助生殖技術(shù)本身的非生理性操作、生殖障礙疾 病的不良環(huán)境暴露及這些因素間的相互作用干擾配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育 ，為研究 人類成年期疾病的胚胎

3、起源提供了突破口。本項目圍繞關(guān)鍵科學(xué)問題 ，主要研究內(nèi) 容為，1、對人類ART子代進(jìn)行健康追蹤研究，評估AR儂術(shù)本身及PCOS口子宮內(nèi)膜 異位癥不良生殖內(nèi)環(huán)境增加子代糖尿病、心血管病的風(fēng)險，以及嚴(yán)重少弱畸精癥子代生育力低下的風(fēng)險，結(jié)合動物/體外模型研究，鑒別可能誘發(fā)子代胚胎源性疾 病的高風(fēng)險ART技術(shù)，如卵巢刺激、胚胎培養(yǎng)、胚胎凍存，、關(guān)鍵因素，父/母源性不 良生殖背景、卵巢局部微環(huán)境、宮內(nèi)環(huán)境等，、作用時間窗，配子發(fā)生、早期胚胎發(fā) 育階段,及傳代效應(yīng),分析不同AR儂術(shù)方案誘發(fā)胚胎源性疾病的風(fēng)險程度。2、利用人類ART臨床資源、動物卞g型和體外模型,獲取配子、植入前胚胎、以 及動物宮內(nèi)至出生后

4、子代各個時期靶器官組織標(biāo)本 ，應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、表 觀遺傳組學(xué)等高通量分子技術(shù)聯(lián)合生物信息分析，研究不同AR*案所致發(fā)育階段 特異和組織器官特異的基因/蛋白/表觀遺傳改變，篩選出與子代胚胎源性疾病發(fā)生 相關(guān)的重要候選基因、相應(yīng)表觀遺傳改變及生物預(yù)警標(biāo)記物。3、利用ART哺乳類動物模型和胚胎干細(xì)胞體外分化模型，研究ARTB早期胚 胎表觀遺傳修飾改變的特性，分析其對子代的近遠(yuǎn)期影響及與成年期發(fā)病之間的關(guān) 系，探索優(yōu)化的AR儂術(shù)體系，利用PCO劭物模型、條件性基因敲除小鼠模型、轉(zhuǎn) 基因斑馬魚模式動物，研究干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育誘發(fā)胚胎源性疾病的主要作 用途徑、關(guān)鍵信號通路、表觀遺傳機(jī)制及其

5、他分子機(jī)制 ，探索消減胚胎源性疾病風(fēng) 險的靶點。二、預(yù)期目標(biāo)，一，總體目標(biāo)瞄準(zhǔn)國家戰(zhàn)略需求和生殖與發(fā)育研究前沿圍繞配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育階段的干擾是否誘發(fā)胚胎源性疾病的核心科學(xué)問題以 ART和生殖障礙疾病作為主要干 擾因素研究胚胎源性疾病的發(fā)生機(jī)制、病理生理過程和防控策略。運用基因組 學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳組學(xué)和生物信息學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)系統(tǒng)評估輔助生 殖主流技術(shù)、生殖相關(guān)疾病不良遺傳背景和不良生殖內(nèi)環(huán)境對配子發(fā)生、早期胚胎 發(fā)育干擾所致胚胎源性疾病的風(fēng)險因素探明關(guān)鍵窗口期主要表觀遺傳異常的分 子事件和傳代效應(yīng)，以糖尿病、心血管疾病等作為候選胚胎源性疾病通過探索其 發(fā)病過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、

6、表觀遺傳機(jī)制及其他分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)有效的預(yù)警分子 標(biāo)記物和易感人群為源頭防控胚胎源性疾病、減少出生缺陷、優(yōu)化ART供科學(xué)依據(jù)。通過本課題的實施使發(fā)育源性疾病，如糖尿病和心血管病等人類重大疾病， 在配子/胚胎層面有發(fā)病機(jī)制上的理論突破使 ART的遠(yuǎn)期安全性評估有科學(xué)依據(jù) 獲得一批有自主知識產(chǎn)權(quán)的成果同時以本項目的實施為契機(jī)，促進(jìn)生殖醫(yī)學(xué)、 生殖生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)和代謝病研究的銜接和交叉集成培養(yǎng)一批 臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究與基礎(chǔ)研究相結(jié)合的復(fù)合型人才使我國的生殖健康研究領(lǐng)域躋 身國際領(lǐng)先行列。,二,五年預(yù)期目標(biāo)1、通過ART出生子代健康追蹤研究篩選發(fā)生低體重、糖 /代謝異常和表觀遺 傳修飾異常的

7、主要ART 干擾因素明晰輔助生殖技術(shù)本身或合并父/母源性生殖障 礙誘發(fā)糖尿病、心血管疾病等胚胎源性疾病的風(fēng)險度識別增加疾病易感性的生殖 障礙疾病因素。2、結(jié)合臨床資源、動物模型、體外模型和模式動物研究識別配子發(fā)生/早期胚胎階段至成年期疾病相關(guān)基因/蛋白和表觀遺傳差異明確引起異常的主要高危 AR儂術(shù)、關(guān)鍵因素和作用時間窗闡明 AR#目關(guān)干擾對子代的近遠(yuǎn)期影響以及傳 代效應(yīng)3、明確相關(guān)候選基因/蛋白和相應(yīng)表觀遺傳改變與成年期發(fā)生胚胎源性疾病的 關(guān)聯(lián)性確定ART相關(guān)干擾誘發(fā)胚胎源性疾病及生育力低下的主要致病窗口期、主 要表觀遺傳異常的分子機(jī)制建立規(guī)避風(fēng)險的 AR儂術(shù)措施和適應(yīng)癥規(guī)范。4、闡明ART相

8、關(guān)干擾所致相關(guān)異常引發(fā)糖尿病、心血管病等胚胎源性疾病的 主要作用途徑、具體信號通路和表觀遺傳修飾機(jī)制鑒定數(shù)個疾病相關(guān)的關(guān)鍵基因 /蛋白和表觀遺傳異常的分子事件篩選可進(jìn)行有效疾病預(yù)警的分子標(biāo)記。5、利用疾病預(yù)警分子標(biāo)記檢出易感人群建立消減胚胎源性疾病發(fā)病風(fēng)險 的出生后飲食/生活方式。6、培養(yǎng)一批生殖與發(fā)育領(lǐng)域具國際視野的優(yōu)秀人才，取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果，在國際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表 SCI論文50篇以上，爭取多篇高影響因子的論 文發(fā)表，取得若干項國際或國家發(fā)明專利。建立國內(nèi)一流、國際領(lǐng)先的生殖安全研 究基地和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)基地，使我國的生殖健康研究領(lǐng)域躋身國際前列。三、研究方案,一，總體研究思路成年

9、期重大疾病的生命早期起源學(xué)說自提出之日起就受到了廣大臨床和基礎(chǔ)研 究科學(xué)家的高度關(guān)注。然而，由于倫理和技術(shù)限制，對人類發(fā)育源性疾病的在體直接 研究非常困難，以往只能借助于流行病學(xué)調(diào)查和動物模型實驗，主要研究宮內(nèi)不良環(huán) 境所致胎兒源性成人疾病的可能機(jī)制。但更值得關(guān)注的是，疾病的早期起源可以追 溯至胚胎甚至配子發(fā)育時期，因此，闡明干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育引起胚胎源性 成人性疾病的發(fā)生機(jī)制，對于疾病診治前移、源頭防控具有更加重大的意義。隨著 輔助生殖技術(shù)的高速發(fā)展，人類配子和胚胎在實驗室的可操作性使得在體外模擬人 體內(nèi)配子發(fā)生/胚胎發(fā)育的內(nèi)源性，如遺傳、表觀遺傳，和外源性，內(nèi)外環(huán)境，因素成 為可能

10、，此外，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWASJ MeDIP-chip、Chip-chip、microRNA等新 技術(shù)的應(yīng)用極大推動了基因組學(xué)包括遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究的進(jìn)展。本項目在全世界率先提出和建立以臨床輔助生殖為技術(shù)平臺，以基因組學(xué)包括遺傳學(xué)和表觀遺 傳學(xué)研究最新技術(shù)在內(nèi)的相關(guān)方法學(xué)為研究手段，以人配子和胚胎為主要研究對象， 以輔助生殖出生子代為成人性疾病發(fā)生結(jié)局的載體 ，將發(fā)病率高、危害重大的慢性 成人性疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的關(guān)注點前移至配子發(fā)生 /胚胎早期發(fā)育階段，具有致 病機(jī)制研究思路創(chuàng)新性和疾病防治策略的前瞻性。因此 ，本項目設(shè)計ART及相關(guān)的 生殖障礙疾病干擾配子發(fā)生和胚胎發(fā)育誘發(fā)胚胎源

11、性疾病的風(fēng)險評估和機(jī)制研究，是生殖與發(fā)育領(lǐng)域前沿的嶄新研究課題。不僅能回答人類發(fā)育源性糖尿病、心血管 病等發(fā)病機(jī)制方面的重大科學(xué)問題，同時對促進(jìn)人類現(xiàn)代生殖科技的進(jìn)步有重大科 學(xué)意義。根據(jù)總體學(xué)術(shù)思路，本項目研究的技術(shù)線路如圖所示。具體而言，本項目將通過人類輔助生殖子代健康追蹤，利用模式動物、動物模型 與自然妊娠子代比較，研究促超排卵藥物、體外培養(yǎng)和配子胚胎凍融等ART主流技術(shù)出生子代，以及PCOS子宮內(nèi)膜異位癥、嚴(yán)重少弱精癥等父/母源性生殖障礙患 者ART子代的生長發(fā)育、糖/脂代謝、心血管結(jié)構(gòu)功能、性成熟等表型特征，探索不 同AR儂術(shù)誘發(fā)上述疾病的風(fēng)險程度，以及父/母源性生殖障礙疾病背景是否

12、增加疾 病的易感性，分析人類ART子代與糖尿病、心血管疾病相關(guān)的基因/蛋白表達(dá)調(diào)控的 差異。同時利用動物模型和體外模型研究平臺，通過基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀 遺傳組學(xué)等高通量和生物信息學(xué)分析方法，分析配子發(fā)生/早期胚胎階段的表觀遺傳 異常、子代DN物變、不同發(fā)育階段重要靶器官組織相關(guān)基因/蛋白表達(dá)、重要候 選基因調(diào)控區(qū)DNA甲基化、染色質(zhì)組蛋白甲基化/乙?；约靶NAW飾等表觀遺 傳修飾異常，探明ART相關(guān)干擾誘發(fā)胚胎源性疾病的關(guān)鍵時間節(jié)點、致病窗口期、 主要風(fēng)險因素、主要表觀遺傳修飾異常的分子事件，明確相關(guān)干擾對子代的近遠(yuǎn)期 影響以及傳代效應(yīng)。在上述研究工作基礎(chǔ)上，利用模式動物、胚胎干細(xì)

13、胞體外分化模型，剖析輔助生殖相關(guān)干擾誘發(fā)糖尿病、心血管病和低生育力的主要候選基因/蛋白和信號通路，重點研究糖尿病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子pdx-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運基因glu-4、信號 通路分子 PI3K/PKC /IRS-1,心血管疾病相關(guān) eNOS,NO PGI2、Endothelin、TXA2 以及精子組蛋白泛素化，去泛素化，UPP,系統(tǒng)在胚胎源性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，深 入闡明輔助生殖干擾配子發(fā)生、早期胚胎發(fā)育所致相關(guān)異常引發(fā)上述胚源性疾病的 具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、重要候選基因表觀遺傳修飾機(jī)制及其他分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的預(yù)警生物分子標(biāo)記物。利用預(yù)警生物標(biāo)記，檢出易感人群，探尋優(yōu)化ART和消減胚 胎源性疾病發(fā)病

14、風(fēng)險的技術(shù)措施/營養(yǎng)方式，實現(xiàn)胚胎源性疾病的防治前移。剪帽/休林牌，it-國 制 一引弗，小-17 i-14ixv4!l.出片嗎,甘*性 日曾：4地曄司I* .TJ北予*生/軍瑞賓育周雄才的了*f*前門/去中/竹青卓項目的可行性分析1、項目實施有堅實的理論依據(jù)，“胎兒源性成人疾病”理論已獲公認(rèn)，但與胎 兒發(fā)育相比，配子的發(fā)生和成熟受潛在危害的作用時間更長，受精及胚胎期，受精6 周內(nèi)，處于表觀遺傳重編程和細(xì)胞快速分化及器官形成期 ，是環(huán)境干擾致病的最敏感 階段。本項目將成人期疾病的發(fā)生關(guān)注點進(jìn)一步前移至配子發(fā)生和胚胎發(fā)育期 ，具 有取得重大理論突破和研究進(jìn)展的可行性。2、具有動物實驗依據(jù)，小鼠A

15、RT模型已證實ART可引起成年后小鼠高血壓和糖代謝異常，為本項目人類ART誘發(fā)胚胎源性疾病研究提供了最直接的支持。3、前期研究基礎(chǔ)扎實，本項目組前期研究已證實 ART子代表觀遺傳修飾異常增加及出現(xiàn)新發(fā)基因突變，而表觀遺傳修飾異常是代謝性疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一。因此，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行胚胎源性疾病發(fā)生機(jī)制研究有望取得突破性成果。4、ART子代低出生體重為胚胎源性疾病發(fā)生提供切入點，已證實低出生體重是 胎兒源性心血管疾病和糖尿病等的獨立高風(fēng)險因素。而ART子代低出生體重發(fā)生率顯著增高，因此以低出生體重為切入點研究 ART 誘發(fā)的胚胎源性疾病發(fā)生機(jī)制研究 極有可能獲得胚胎源性疾病發(fā)病機(jī)制研究的重大

16、突破。5、研究團(tuán)隊實力雄厚，項目組匯集了生殖、發(fā)育、代謝性疾病與生物信息學(xué) 等相關(guān)領(lǐng)域的優(yōu)勢力量，多學(xué)科交叉、優(yōu)勢互補(bǔ)，已建立了長期合作的協(xié)作關(guān)系，臨 床資源豐富、研究平臺完善，為項目的順利完成提供了可靠的保障。，二,創(chuàng)新點1、本項目瞄準(zhǔn)生命科學(xué)國際前沿和生殖與發(fā)育學(xué)科的新興領(lǐng)域 ，從配子發(fā)生 和胚胎早期發(fā)育層面探索胚胎源性成人疾病的發(fā)病機(jī)制，將宮內(nèi)“胎兒源性成人疾 病”的研究前移到配子和胚胎發(fā)育早期的“胚胎源性成人疾病” ，具有學(xué)術(shù)思想的 創(chuàng)新性。利用人類ART的技術(shù)特征和父/母源性生殖障礙疾病致生殖細(xì)胞特異不 2、良內(nèi)環(huán)境暴露作為胚胎源性成人疾病的獨特研究模型 ，以表觀遺傳/基因/蛋白 組

17、學(xué)為新視角,結(jié)合模式動物、體外模型研究，甄別ART誘發(fā)胚胎源性疾病的高危技 術(shù)風(fēng)險和致病易感性、并闡明其傳代效應(yīng)，具有研究對象和技術(shù)途徑的新穎性。3、以發(fā)病率高、危害重大的糖尿病和心血管疾病以及影響人類繁衍的生育力異常作為主要候選疾病，通過鑒定ART誘發(fā)胚胎源性疾病的關(guān)鍵候選蛋白/基因，發(fā) 現(xiàn)有效預(yù)警胚胎源性疾病的生物標(biāo)記，探索可行的早期防治策略，為重大疾病防控前 移戰(zhàn)略提供新的科學(xué)依據(jù)。,三，課題設(shè)置以及課題間的相互關(guān)系課題設(shè)置圍繞配子發(fā)生和胚胎發(fā)育階段的 AR邙境暴露是否以及如何誘發(fā)胚胎源性疾病 的發(fā)生這個關(guān)鍵科學(xué)問題，本項目設(shè)置了三個課題，課題1 :輔助生殖致胚胎源性疾病的技術(shù)風(fēng)險因素研

18、究主要研究內(nèi)容：1、人類ART子代健康追蹤研究以自然妊娠子代為對照，追蹤超促排卵、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎冷凍復(fù)蘇等人類 輔助生殖主流技術(shù)出生子代,特別是低出生體重,low birth weight, LBW,及小于胎齡兒,small for gestational age,SGA,的子代，測定空腹和餐后血糖、胰島素水平、糖耐量試驗和胰島素抵抗指數(shù)等糖代謝指標(biāo) ，評估罹患糖尿病的風(fēng)險，通過血 壓、主動脈及頸動脈厚度、內(nèi)膜中層厚度、彈性以及心臟幾何結(jié)構(gòu)和舒張功能等心 血管結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)，以及血管活性物質(zhì)NO PGI2、TXA2 Endothelin等血管內(nèi)皮 舒縮功能指標(biāo)，評估罹患心血管病風(fēng)險，檢查青

19、春期第二性征、性激素水平等性發(fā)育 表型指標(biāo)，以及檢測與配子發(fā)生、成熟和生育力密切相關(guān)的基因，AZF、GDF-9等，突變與表觀遺傳修飾的變化，評估子代生育力是否受到明顯影響。2、人類ART子代胚胎源性疾病相關(guān)基因/蛋白研究獲取ART子代的胎盤、臍血/外周血等臨床資源，將低出生體重ART子代與正常 體重ART子代、自然妊娠子代作為同期對照，進(jìn)一步對不同促排卵方案、胚胎體外 培養(yǎng)環(huán)境、胚胎凍融方式及凍存時間出生子代進(jìn)行比較，采用基因芯片和蛋白組學(xué) 篩選差異表達(dá)基因/蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)分析篩選出與糖尿病、心血管疾病和生育 力低下等疾病相關(guān)的重要候選基因以及生物預(yù)警標(biāo)記。利用甲基化免疫共沉淀測序，Me

20、DIP-seq,技術(shù)，檢測全基因組DNAE特定位點的甲基化控制區(qū)，利用組蛋白乙?；庖吖渤恋頊y序，ChIP-seq,技術(shù)檢測組 蛋白修飾，乙?；?甲基化，位點或控制區(qū)域，比較表觀遺傳修飾，DNA甲基化、組蛋 白修飾、基因印記，差異，研究ART子代發(fā)生表觀遺傳修飾改變的規(guī)律性，結(jié)合生物 信息學(xué)方法，篩選相應(yīng)調(diào)控的基因，包括印記基因及非印記基因，進(jìn)一步驗證表觀遺 傳修飾改變對基因表達(dá)的影響。3、AR儂物模型和體外模型研究建立不同AR儂術(shù)的動物模型和體外模型，對超促排卵、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎 凍融分別進(jìn)行單因素研究，評估不同AR儂術(shù)出生子代體重、生長發(fā)育、糖/脂代謝 指標(biāo)、血壓、生育力等，明確罹患糖尿

21、病、心血管疾病和生育力低下等疾病風(fēng)險。 將不同ART式出生子代與正常妊娠子代相互交配,出生子二代,評估ART子二代生 長發(fā)育及代謝等相關(guān)指標(biāo)，明確ART所致胚胎源性疾病的傳代風(fēng)險及親源性遺傳特 征。獲取ART動物不同發(fā)育階段配子、胚胎，結(jié)合體外培養(yǎng)模型，研究促排卵影響卵 子發(fā)生過程表觀遺傳重編程、尤其是基因印記重建時序性的關(guān)鍵時間窗，探索胚胎培養(yǎng)、凍存等影響植入前胚胎去甲基化和新發(fā)甲基化等表觀遺傳修飾的關(guān)鍵因素，獲取ART模型不同胎齡的胚胎組織,分析亞穩(wěn)態(tài)表等位基因，metastable epialleles, 表達(dá)，確定子代受影響的時間窗，采用高通量技術(shù)比較全基因組甲基 化、組蛋白甲基化、乙

22、?；缺碛^遺傳修飾變化，重點研究ART所致的早期胚胎印t己丟失,loss of imprinting,或印t己松弛,relaxation of imprinting,等基因轉(zhuǎn)錄微環(huán)境的改變，獲取ART動物出生后子一代和子二代不同組織器官，胰腺、肝臟、心 臟、血管、性腺等，標(biāo)本，篩選糖尿病、心血管疾病和生殖障礙相關(guān)差異基因 /蛋 白。通過數(shù)據(jù)挖掘分析，明確ART中高風(fēng)險技術(shù)因素及相應(yīng)生物預(yù)警分子標(biāo)記。研究目標(biāo)：通過輔助生殖主流技術(shù)誘發(fā)糖尿病、心血管病等胚胎源性疾病的風(fēng)險評估和干擾配子/胚胎發(fā)育機(jī)制研究，明確AR儂術(shù)干擾影響配子發(fā)生和胚胎發(fā)育的高危因素及關(guān)鍵時間窗，篩選出超促排卵、體外培養(yǎng)和凍融技

23、術(shù)致相關(guān)疾病的靶基因及生物 預(yù)警標(biāo)記。承擔(dān)單位，浙江大學(xué)、中南大學(xué)課題負(fù)責(zé)人，黃荷鳳學(xué)術(shù)骨干，盧光誘、金帆、陳新、譚躍球、徐晨明經(jīng)費比例，33%課題2 ,父/母源性生殖障礙誘發(fā)胚胎源性疾病風(fēng)險評估及機(jī)制研究 主要研究內(nèi)容，1、生殖障礙患者ART子代健康追蹤研究以同期匹配的單純輸卵管性不孕 ART子代為又1照組,跟蹤觀察生殖障礙，PCOSffi 子宮內(nèi)膜異位癥,、嚴(yán)重少弱畸精癥患者經(jīng) ART出生子代的健康狀況。通過孕期 B 超監(jiān)測宮內(nèi)生長發(fā)育，特別關(guān)注胎兒生長受限，F(xiàn)GR,、LBW及SGAf代，檢測不同年 齡段子代血清糖代謝、脂代謝、血管內(nèi)皮功能、生殖內(nèi)分泌等相關(guān)指標(biāo)，無創(chuàng)性檢查心血管幾何結(jié)構(gòu)和

24、功能，了解血管彈性及內(nèi)皮舒張功能等，評估父/母源性生殖障 礙疾病是否增加胚胎源性疾病的易感性。2、生殖障礙患者ART子代差異基因/蛋白研究獲取PCOS子宮內(nèi)膜異位癥和嚴(yán)重少弱畸精癥等生殖障礙疾病患者經(jīng)輔助生殖 出生子代的臨床標(biāo)本，如絨毛、羊水胎兒細(xì)胞、臍血、胎盤、外周血、唾液等,利用蛋白組學(xué)及全基因組表達(dá)譜芯片篩選差異表達(dá)的蛋白、印記基因與非印記基因，尤其是亞穩(wěn)態(tài)表等位基因，分析相應(yīng)生物學(xué)功能，應(yīng)用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因 集合富集分析，Gene Set Enrichment Analysis, GSEA,、分類預(yù)測分析,Prediction Analysis for Microarray,

25、 PAM,等，篩選發(fā)生顯著性改變的信號通路或者關(guān)鍵基因集合，遴選出可用于早期診斷及預(yù)警的分子標(biāo)志物。應(yīng)用 DNAft接測序法，檢測生殖障礙患者ART子代與配子發(fā)生及與，糖尿病、心血管病、生育力低下等，胚胎源性疾病相關(guān)重要候選基因，AZF、GDF-9 INSR等，的單核甘酸多態(tài)性,SNP,分析其與臨床表型的關(guān)聯(lián)性，應(yīng)用SNP5片、外顯子組測序等技術(shù)，確定嚴(yán)重少弱畸精癥主要基因變異對關(guān)鍵基因、蛋白的影響，重點研究，精子發(fā)生來源的、參與組蛋白和p53降解的，泛素化,去泛素化，UPP,系統(tǒng)，包括Huwe1,USP：J口 USP1舞分子，在輔助生殖過程中誘發(fā)胚胎源性疾病的作用和影 響，尤其是對ICSI男

26、性子代生育力的作用和影響。3、生殖障礙疾病模型及傳代效應(yīng)研究建立基于PCOSI理生理變化的動物模型和模擬子宮內(nèi)膜異位癥腹腔微環(huán)境的 體外模型，結(jié)合模式動物和胚胎體外培養(yǎng)模型，觀察子宮內(nèi)膜異位癥盆腔微環(huán)境、 PCO哪巢局部不良微環(huán)境、宮內(nèi)高雄環(huán)境和胰島素抵抗等不良暴露因素誘發(fā)子代 胚胎源性糖尿病、心血管病和生育力降低的遠(yuǎn)期效應(yīng)，以及對子二代的隔代遺傳效 應(yīng)和親源性遺傳特征，獲取配子、植入前胚胎、以及宮內(nèi)至出生后發(fā)育各個時期靶 器官組織標(biāo)本，胰腺、肝臟、肌肉、脂肪、心臟、血管、性腺等,動態(tài)研究胚胎源 性疾病相關(guān)差異基因及蛋白表達(dá)的發(fā)育階段特異性，stage specificity,和組織器官特異性

27、,tissue specificity,明確致病關(guān)鍵時間窗。重點研究父/母源性生殖障礙背景對卵泡發(fā)育、卵子成熟及早期胚胎重編程的干擾，尤其是高雄激素內(nèi)環(huán)境下 KNDy Kisspeptin和NKB言號系統(tǒng)對卵泡發(fā)育/成熟的負(fù)面影響。研究目標(biāo)，明確排卵障礙性疾病PCOS口子宮內(nèi)膜異位癥、嚴(yán)重少弱畸精癥等父/母源性生 殖障礙疾病是否增加輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病易感性及其關(guān)鍵因素 ，揭示生殖障 礙疾病影響配子發(fā)生和胚胎/胎兒發(fā)育的關(guān)鍵時期，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的表觀遺傳修飾改變和 相關(guān)重要基因。承擔(dān)單位，南京醫(yī)科大學(xué)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、浙江大學(xué)課題負(fù)責(zé)人，劉嘉茵學(xué)術(shù)骨干,王琳芳、祝輝、葉英輝、朱小明

28、、宋偉經(jīng)費比例，28.5%課題3 ,輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病的發(fā)生機(jī)制研究主要研究內(nèi)容，1、AR四早期胚胎表觀遺傳修飾改變的機(jī)制研究建立ART哺乳類動物模型,研究ART對哺乳類動物早期胚胎表觀遺傳修飾的影響及其對子代的近遠(yuǎn)期影響。利用胚胎干細(xì)胞體外分化模型及模式動物，結(jié)合差異表達(dá)的基因功能，定性、定量地分析早期胚胎印記丟失對胎盤與胎兒發(fā)育、印記基 因表達(dá)、新生個體生長發(fā)育以及成年期疾病的影響，重點研究體內(nèi)與體外胚胎的差 異，識別可指示早期胚胎質(zhì)量的可溶性生物分子，分析不同生物因素對早期胚胎表觀 遺傳修飾的干擾，探索能降低或避免早期胚胎表觀遺傳修飾改變的 ART培養(yǎng)體系和 生物因子組合。2、輔助

29、生殖致胚胎源性糖尿病機(jī)制研究建立PCOS-AR動物模型和傳代模型，分離低出生體重子代的胰腺和胰島素靶器官，肝臟、肌肉和脂肪,采用高通量和生物信息學(xué)分析方法，篩選影響胰島B細(xì)胞 功能、靶器官糖原合成和葡萄糖利用的糖尿病相關(guān)重要候選基因，如調(diào)控B細(xì)胞增殖和分化的轉(zhuǎn)錄因子pdx-1,參與葡萄糖轉(zhuǎn)運的基因glu-4,及胰島素下游信號通路 分子PI3K,PKCIRS-1等,，并在子一代、子二代進(jìn)行甲基化差異和相應(yīng)重要候選基因 的表達(dá)差異驗證。結(jié)合體外實驗，研究ART相關(guān)干擾對胰島B細(xì)胞數(shù)量、分泌功能及靶器官葡萄攝取、利用和糖原合成的影響，闡明ART出生小鼠子代和子二代發(fā)生糖尿病的 風(fēng)險，明確傳代效應(yīng)。建

30、立候選基因的胰島B細(xì)胞系過表達(dá)或敲減模型，檢測ERK1/2,PI3K/Akt/Cyclin等參與細(xì)胞增殖的信號通路，p53、caspase等參與細(xì)胞凋亡的信號通路，以及 sAC/cAMP?參與胰島素合成和分泌的信號通路，確定候選基因參與B細(xì)胞增殖/凋 亡、胰島素合成/分泌的分子機(jī)制，選擇在效應(yīng)最明顯的胰島素效應(yīng)器官，如肝臟，肌 肉或脂肪，的原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系中，超表達(dá)或敲減候選基因，檢測細(xì)胞對胰島素 的應(yīng)答，例如效應(yīng)細(xì)胞對葡萄糖的攝取和分泌速率、糖原合成速率、脂肪細(xì)胞的分 化和代謝等，并證明候選基因的作用機(jī)制和信號途徑。3、輔助生殖致胚胎源性心血管病機(jī)制研究結(jié)合課題1,2,確定ART?代出現(xiàn)

31、心血管的年齡、表型，研究不同AR3物模型 所致子代心血管系統(tǒng)改變，探索ART方案及父母健康異常對子代心血管系統(tǒng)的影響， 通過比較心血管指標(biāo)異常 ART子代與正常子代血管，內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，心肌細(xì) 胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，包括關(guān)鍵因子基因調(diào)控，的異同，驗證在ART子代人群中篩選出 候選體液調(diào)節(jié)因子和基因調(diào)控因子，闡明ART子代心血管異常發(fā)生機(jī)制。結(jié)合體外實驗，在細(xì)胞水平研究ART藥物、ART實施時細(xì)胞內(nèi)環(huán)境因素對血管內(nèi) 皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞生長遷移，血管內(nèi)皮細(xì)胞源性舒縮血管因子，NO,ET等,，血 管平滑肌舒縮的影響極其機(jī)制，研究ART子代候選體液調(diào)節(jié)因子、基因調(diào)控因子及 表觀遺傳改變所致心血管

32、異常高危險的可能性極其機(jī)制。4、胚胎源性糖尿病、心血管病發(fā)病風(fēng)險消減研究建立基于低出生體重的ART子代小鼠糖尿病/心血管病的誘導(dǎo)模型。在子代出 生后，通過控制哺乳母鼠和斷奶小鼠的蛋白質(zhì)、糖、脂肪含量等的攝入量，觀察出生后營養(yǎng)對ART子代糖尿病和心血管病相關(guān)指標(biāo),空腹和餐后血糖水平、胰島素水平、糖耐量和胰島素抵抗指數(shù)以及血壓、血管結(jié)構(gòu)和動脈血管舒縮功能等，的影響，比較不同營養(yǎng)模式ART子代糖尿病和心血管病的發(fā)病率，以及重要候選基因和相 關(guān)信號通路分子的表達(dá)，分析不同營養(yǎng)模式、重要候選基因及關(guān)鍵信號分子表達(dá)水 平和發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性，探索消減胚胎源性疾病發(fā)病風(fēng)險的營養(yǎng)方式/生活方式，驗 證預(yù)測發(fā)病的

33、分子標(biāo)記物。5、ART子代生育力降低機(jī)制研究SNPS因芯片分析臨床嚴(yán)重少弱畸精癥患者的血液、精子樣本及其ART子代臍血，調(diào)查其子代生育力降低的基因突變、拷貝數(shù)異常等遺傳變異，研究這些變異與表 觀遺傳學(xué)變化的關(guān)系，明確AR儂術(shù)是否會造成遺傳缺陷的累積傳遞。對于鑒定出 的變異，通過模式生物，如轉(zhuǎn)基因斑馬魚，識別這類遺傳變異是否是胚胎源性疾病的 危險因子。結(jié)合課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的與精子組蛋白泛素化相關(guān)的重要蛋白HuwelTRIM69利用條件性基因敲除Huwel USP2,USP1的小鼠模型,深入研究泛素化連接 酶Huwel TRIM69在精子發(fā)生、早期胚胎發(fā)育和 DNAt復(fù)復(fù)合物泛素化調(diào)節(jié)中的作

34、用，闡明ART相關(guān)干擾能否引起此類蛋白功能異常，詮釋Huwel TRIM69在子代精子 功能、基因突變和表觀遺傳學(xué)改變中所起的作用，闡明ART相關(guān)干擾致子代生育力降低的可能分子機(jī)制。研究目標(biāo)，揭示重要候選基因在胚胎源性糖尿病、心血管病和生育力低下發(fā)病中的作用和機(jī)制，重點闡明表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制在 ART誘發(fā)的胚胎源卜t疾病中作用，通過建立有 效預(yù)警的生物標(biāo)志物，提出優(yōu)化ART和早期防控胚胎源性疾病的策略。承擔(dān)單位，浙江大學(xué)、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、四川大學(xué)課題負(fù)責(zé)人，楊衛(wèi)軍學(xué)術(shù)骨干，陳小章、孫方臻、趙正言、盛建中、董旻岳、許文明、黃衛(wèi)紅經(jīng)費比例，38.5%課題間的相互關(guān)系本項目的三個課

35、題分別從AR儂術(shù)因素、生殖障礙相關(guān)疾病因素對配子和胚胎的影響，以及相關(guān)胚胎源性疾病發(fā)生機(jī)制三個方面進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，最終為胚胎源性疾病的防治和ART的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。三個子課題以輔助生殖誘發(fā)胚胎源性 疾病風(fēng)險評估及發(fā)病機(jī)制研究為主線，在三個方面展開研究，課題1和課題2為并列 關(guān)系，課題1以自然妊娠出生子代為對照，研究ART誘發(fā)胚胎源性疾病的技術(shù)風(fēng)險因 素，課題2結(jié)合課題1以輸卵管阻塞性不孕ART子代為對照，研究母親PCOS子宮 內(nèi)膜異位癥及父親嚴(yán)重少弱畸精癥是否增加 ART 誘導(dǎo)胚胎源性疾病和子代生育力低 下的機(jī)率，課題3是對課題1,2的深入，進(jìn)一步研究胚胎源性糖尿病和心血管疾病等 以及A

36、RT致子代生育力降低的發(fā)生機(jī)制和傳代效應(yīng)。結(jié)合三個課題的研究結(jié)果，完成對發(fā)育源性疾病發(fā)病機(jī)制理論研究的突破，研究結(jié)果可為源頭防控胚胎源性疾 病、優(yōu)化ART供科學(xué)依據(jù)。 五年目標(biāo)為總體目標(biāo)的分解，前兩年完成主要科學(xué)發(fā) 現(xiàn)，尤其關(guān)注臨床助孕技術(shù)安全性的基礎(chǔ)研究以及對子代隨訪資料的科學(xué)性和完整 性進(jìn)行完善，并對研究內(nèi)容進(jìn)行適當(dāng)修正以保證后三年深入的機(jī)制研究的進(jìn)行。四、年度計劃年度計劃內(nèi)容和目標(biāo)研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)1、開展人類ART主流技術(shù)及PCOS子宮內(nèi)膜異位癥患者ART出生子代1、建立并完善各類AR儂術(shù)及的生長發(fā) 育、糖脂代謝和心血管結(jié)生殖障礙患者 ART子代標(biāo)本構(gòu)功能白健康追綜調(diào)查；收集子代庫；制定出樣品采集、子代健臍血/外周血/組織標(biāo)本，整理流行康追蹤的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程 第病學(xué)資料2、明確ART出生子代出現(xiàn)心血2、建立ART及生殖障礙疾病的動物模管、代謝異常的指標(biāo)、年齡、型和體外模型，研究AR儂術(shù)對配相關(guān)表型及表觀遺傳修飾機(jī)一 子/胚胎/胎兒組織的表觀遺傳重編制；初步評估ART與 子代糖尿程的影響；分析出生子代及子二代病、心血管病的相關(guān)性及生殖的出生體重和成年后糖尿病、心血障礙疾病致胚胎源性疾病的管病相關(guān)指標(biāo)易感性 年3、通過高通量基因芯片分析，尋找 3、篩選出ARTS關(guān)的糖尿病、心ART?代動物 表達(dá)差異的基因，篩血管病發(fā)病候選基因查ART