中國漢族原發(fā)性閉角型青光眼大家系臨床資料總結及TIGR基因第三外顯子突變篩查

1、中國漢族原發(fā)性閉角型青光眼大家系臨床資料總結及TIGR基因第三外顯子突變篩查【摘要】 目的 總結一中國漢族原發(fā)性閉角型青光眼大家系臨床表型特點及遺傳模式，并篩查在該家系成員中是否存在TIGR/MYOC基因第三外顯子突變。方法 對該家系家庭成員進行眼科檢查，包括視力、屈光檢查、Goldmann壓平眼壓計測量眼壓、房角鏡檢查、自動視野檢查以及眼球A超檢查。應用聚合酶鏈反應（PCR）擴增22名家系成員TIGR基因第三外顯子，并對PCR產物進行測序分析。結果 原發(fā)性閉角型青光眼在此家族中呈常染色體顯性遺傳模式，其臨床表型為慢性閉角型青光眼。與第6代成員相比，第4代及第5代成員的眼軸及前房較短，晶狀體較

2、厚。第4代成員的平均屈光狀態(tài)為遠視，第5代為正視，第6代為近視，但第6代中仍有一名成員為遠視。家族的22名成員中未檢測到TIGR基因第三外顯子突變或單核苷酸多態(tài)性（SNP）。結論 在此中國漢族常染色體顯性遺傳原發(fā)性閉角型青光眼大家系中排除了TIGR基因第三外顯子突變與青光眼發(fā)病之間的關系。 【關鍵詞】 原發(fā)性閉角型青光眼 家系 TIGR基因 中國人 Abstract: Objective To identify the hereditary mode and clinical features of the disease in a Chinese primary angle closure

3、glaucoma (PACG) pedigree of the Han nationality and to screen the existence of exon 3 mutation of TIGR genes in this family. Methods A Chinese 7-generation PACG pedigree was enrolled in this study. The ophthalmologic examinations consisted of evaluation of visual acuity, refraction, Goldmann applana

4、tion tonometry, gonioscopy, automatic visual field test and A ultrasonography. The coding sequence of exon 3 of the TIGR gene was extended to 22 family members by polymerase chain reaction (PCR) using genomic DNA, followed by sequencing of the PCR products. Results The pedigree exhibited an autosoma

5、l dominant pattern of inheritance of PACG. The clinical features of PACG in this pedigree can be classified as chronic angle closure glaucoma. Relatively shorter axial length and anterior chamber depth with thicker lens were observed in the generations and than in the generation . The mean refractio

6、n status changed from hyperopic in generation to emmetropia in generation , while in generation , the mean refraction status was myopic, but still, there was one member in generation was hyperopic. Neither mutation nor SNP in exon 3 of the TIGR gene was detected in this pedigree. Conclusion The resu

7、lts of this study do not support a role of mutation in exon 3 of the TIGR gene in the pathogenesis of PACG inherited with an autosomal dominant pattern in this Chinese pedigree. Key words: primary angle closure glaucoma; pedigree; TIGR gene; Chinese 在原發(fā)性閉角型青光眼患者及其家屬中?？捎^察到眼前段結構的擁擠現(xiàn)象。在因紐特人中，原發(fā)性閉角型青光眼患

8、者的一級親屬發(fā)病率比一般人群高3.5倍1，中國原發(fā)性閉角型青光眼患者的家族成員發(fā)病率則比一般人群高6倍2。Trnquist3在1953年首先提出存在一個原發(fā)性閉角型青光眼顯性基因，但至今為止仍未發(fā)現(xiàn)原發(fā)性閉角型青光眼疾病基因或與之相關的候選基因位點。有關原發(fā)性開角型青光眼的分子遺傳學研究則已明確了15個與開角型青光眼相關的基因位點，此外還有7個與其他類型青光眼致病相關的疾病基因也得到確認4。其中小梁網糖皮質激素誘導反應蛋白（TIGR）基因，也稱為MYOC基因。TIGR基因是目前為止研究最多的原發(fā)性開角型青光眼疾病基因5，在白人、亞裔人及非洲裔人中均發(fā)現(xiàn)了致病堿基改變，其中3%5% 的成年性開角

9、型青光眼患者存在該基因突變，而在青少年性開角型青光眼患者中其突變率為8%36%。目前已報道的突變基因有70個，絕大部分致病突變基因位于第三外顯子區(qū)域，與青少年性青光眼相關的突變基因則全部位于第三外顯子與嗅球蛋白高度同源的片段6-8。 在近年來針對加拿大青光眼人群的基因型及表現(xiàn)型的研究中，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性閉角型青光眼患者中亦存在TIGR基因突變，Pro481Leu、Glu368STOP、Gly399Val均位于第三外顯子區(qū)域，證明原發(fā)性閉角型青光眼患者也可攜帶TIGR基因突變。我們從2004年開始對一個連續(xù)7代患有原發(fā)性閉角型青光眼的家系進行了定期隨訪，我們認為在進行其他候選基因篩查及全基因組掃描前

10、有必要首先篩查TIGR基因第三外顯子，從基因學上確認所研究的家系屬原發(fā)性閉角型青光眼家系。 1 資料和方法 1.1 一般資料 該原發(fā)性閉角型青光眼家系成員大部分居住于中國南部偏僻山區(qū)農村，該家族所有成員均為漢族且無近親結婚史。家族中22名成員納入本研究并在北京大學深圳醫(yī)院眼科接受檢查。所有參與此項研究的患者均簽署了知情同意書，研究計劃亦通過了醫(yī)院道德委員會審批。 1.2 家系研究方法 眼科檢查包括：視力及校正視力，屈光狀態(tài)，眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡檢查，Goldmann壓平眼壓計測眼壓，房角鏡檢查，眼底檢查（90 D前置鏡及檢眼鏡檢查），自動視野計檢查（Humphery field analyzer

11、）,A型超聲檢查（Alcon Biophysic, OcuScan, Version 3.02）。所有家系成員（1因只有5歲故未接受檢查）均接受以上檢查，家系成員的疾病診斷及排除均由2名青光眼專業(yè)醫(yī)師確認。其他信息如既往眼壓及降眼壓治療或其他治療、激光手術或其他抗青光眼手術史等也一并記錄于檔案中。 1.3 原發(fā)性閉角型青光眼診斷標準 青光眼性視盤改變，存在盤沿組織的缺失；青光眼性視野改變，且與盤沿組織缺失相一致；動態(tài)房角鏡檢查見房角關閉。對于存在上述診斷標準第3條但未見青光眼性視盤及視野改變的診斷為可疑原發(fā)性閉角型青光眼。已死亡患者的診斷根據其病史及手術記錄。家系成員的精神疾病診斷依據其病史。

12、 1.4 實驗方法 抽取2名家系成員外周靜脈血，采用TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生物有限公司)從300 l全血中抽提基因組DNA，采用PCR 方法擴增涵蓋TIGR基因第三外顯子的927 bp的片斷，正向及反向引物分別為:5-GCTGTCACATCTACTGGCTC-3和5-ATCTCCTTCTGCCATTGCCT-3。 反應體系為50 l，其中包括100 ng基因組DNA，5 l 10pfu緩沖劑，4 l 25 mol/L Mg2+，1.2 l 10 mol/L引物，1 l 10 mmol/L dNTP，及1.25 U pfu DNA 聚合酶(MBI，Lithuan

13、ia)。PCR反應程序為： 95變性2 min；隨后35個循環(huán)，包括95變性30 s，55退火30 s，72延伸2 min；最后72延伸5 min 完成全部過程。 PCR產物長度為927 bp，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行產物分析，以紫外線凝膠照相系統(tǒng)（BIO-RAD公司）記錄結果。只有結果顯示無非特異性擴增的產物在進一步純化（DNA Gel Extraction Kit，上海晶泰生物技術有限公司)后進行DNA雙向測序。 雙向測序所使用的引物為5-ACTGGCTCTGCCAAGCTTCC-3及5-GCTGAATACCGAGACAGTGA-3, 使用儀器為Applied Biosystems 3

14、730 DNA Analyzer (ABI公司)，并使用其附帶軟件Sequencing Analysis Software 5.2.0進行分析。 2 結 果 2.1 家系中原發(fā)性閉角型青光眼表型總結 該原發(fā)性閉角型青光眼家系為7代，原發(fā)性閉角型青光眼為顯性遺傳。納入研究的22名成員中，4人確診為原發(fā)性閉角型青光眼，2人為可疑原發(fā)性閉角型青光眼，1人因具有青光眼神經病變以及青光眼性視野改變，房角鏡下房角為開角且年齡為30歲而診斷為青少年性開角型青光眼（圖1）。 該家系中原發(fā)性閉角型青光眼發(fā)病年齡在3050歲。先證者在40歲確診患有原發(fā)性閉角型青光眼并在中山醫(yī)科大學附屬眼科醫(yī)院接受了雙眼小梁切除手

15、術，術后沒有接受降眼壓藥物治療，眼壓一直保持正常水平，直至80歲。12亦接受了雙眼小梁切除手術，術后同樣不需加用抗青光眼藥物治療。15因患有精神病而未接受過任何藥物或手術治療，該名患者具有典型青光眼視神經病變及嚴重視野缺損，但因患有抑郁癥仍拒絕任何治療。11接受抗青光眼藥物治療但拒絕任何形式的抗青光眼手術治療。 該家系中原發(fā)性閉角型青光眼的臨床表型特點為：發(fā)病年齡為3050歲；周邊前房關閉形態(tài)為錐狀粘連或堤狀粘連并逐漸擴大；房角逐漸關閉，青光眼損害隱匿，急性或亞急性發(fā)作前可無任何癥狀；周邊前房淺，中央前房無明顯異常；抗青光眼手術降眼壓效果明顯。家系成員眼球生物測量數據見表1。表1 第4、5、6

16、代患者的屈光度及眼球A超測量結果 2.2 家系成員TIGR基因第三外顯子篩查結果 在原發(fā)性閉角型青光眼家系的22個成員中，未發(fā)現(xiàn)TIGR基因的第三外顯子出現(xiàn)任何堿基改變，包括其中1名青少年性開角型青光眼患者。說明TIGR基因突變未參與該家系中青光眼的發(fā)病機制；而其他同時研究的青少年開角型青光眼家系中的患者均攜帶特定TIGR第三外顯子的突變。 3 討 論 該家系中原發(fā)性閉角型青光眼屬慢性閉角型青光眼。通常慢性閉角型青光眼可表現(xiàn)淺前房、高眼壓但沒有房角粘連；或眼壓正常，房角粘連及房角關閉。此外慢性閉角型青光眼還包括混合機制性青光眼、高褶虹膜型青光眼以及由長期使用散瞳藥物引起的閉角型青光眼，這些均非

17、該家系中閉角型青光眼的臨床類型。 已有研究表明，閉角型青光眼患者的眼前節(jié)具有特殊的解剖特征，包括較淺的前房、較厚的晶狀體以及較短的眼軸，并且這類患者通常還患有遠視眼。參與本研究的閉角型青光眼家族的第4以及第5代成員與第6代成員相比較，均表現(xiàn)出較短的眼軸、較淺前房以及較厚的晶狀體，第4代與第5代成員中患有原發(fā)性閉角型青光眼的人數較第6代多。第4代的平均屈光狀態(tài)為遠視，第5代為正視，到第6代則為近視，但第6代中仍有1名成員為遠視及弱視（14）。對這些家族成員均應進行定期嚴密隨訪以及時發(fā)現(xiàn)異常情況以免延誤診斷。 在此家族中原發(fā)性閉角型青光眼表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，但所有患者的TIGR基因第三外顯子均

18、未發(fā)現(xiàn)突變或單核苷酸多態(tài)性（SNP），包括在編號為19的青少年性開角型青光眼患者亦未發(fā)現(xiàn)基因序列的變化。本研究結果表明此家族的原發(fā)性閉角型青光眼發(fā)病與TIGR基因第三外顯子突變不相關。一項以106名散發(fā)中國慢性閉角型青光眼患者為對象的研究顯示，該人群中出現(xiàn)了TIGR基因的8個序列改變，其中包括以往研究報道的Arg46Stop與Thr353Ile突變9，但這些改變同樣出現(xiàn)在正常中國人群中。另外一項以臺灣人群為對象的研究顯示，位于MMP9基因區(qū)域的基因單核苷酸多態(tài)性rs2664538與閉角型青光眼發(fā)病密切相關10。 原發(fā)性閉角型青光眼發(fā)病的分子遺傳學機制至今尚未清楚，這可能是由于對患者家族史缺乏收

19、集及整理，只把每個患者當做獨立個體診斷，從而失去了進行遺傳學研究的資料11。此外該病發(fā)病年齡較大，并且缺乏關于前代患者準確的臨床資料，這都成為了研究原發(fā)性閉角型青光眼遺傳特性的絆腳石9。 由于原發(fā)性閉角型青光眼與疾病相關的解剖基礎集中于眼前節(jié)，因此與眼前節(jié)發(fā)育相關的基因PAX6基因12-14可能在原發(fā)性閉角型青光眼的發(fā)病機制中起到重要的作用。因此，我們將在后續(xù)研究中對該家系成員進行與眼前房發(fā)育相關基因的篩查分析，并最終進行全基因組掃描，這將有助于揭示原發(fā)性閉角型青光眼發(fā)病機制的分子遺傳學基礎。 【參考文獻】 1 Sim DH, Goh LG, Ho T. Glaucoma pattern am

20、ongst the elderly Chinese in Singapore J. Ann Acad Med Singapore,1998,27(6):819-823. 2 Wang RR. Genetic principles in primary angle-closure glaucoma J. Chin J Ophthalmol,1985,21(2):95-101. 3 Trnquist R. Shallow anterior chamber in acute angle-closure glaucoma: a clinical and genetic study J. Acta Op

21、hthalmol,1953,31(Suppl 39):1-74. 4 Craig JE, Mackey DA. Glaucoma genetics: where are we? Where will we go?J. Curr Opin Ophthalmol,1999,10(2):126-134. 5 Stone EM, Fingert JH, Alward WL, et al. Identification of a gene that causes primary open angle glaucoma J. Science,1997,275(5300):668-670. 6 Finger

22、t JH, Hon E, Liebmann JM, et al. Analysis of myocilin mutations in 1703 glaucoma patients from five different populations J. Hum Mol Genet,1999,8(5):899 -905. 7 Fingert JH, Stone EM, Sheffield VC, et al. Myocilin glaucoma J. Surv Ophthalmol,2002,47(6):547-561. 8 Nguyen TD, Chen P, Huang WD, et al. G

23、ene structure and properties of TIGR, an olfactomedin-related glycoprotein cloned from glucocorticoid-induced trabecular meshwork cells J. J Biol Chem,1998,273(11):6341-6350. 9 Aung T, Yong VH, Chew PT, at al. Molecular analysis of the myocilin gene in Chinese subjects with chronic primary-angle closure glaucoma J. Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46(4):1303-1306. 10 Wang IJ, Chiang TH, Shih YF, et al. The ass