第21章免疫學(xué)檢測(cè)原理

1、第21章免疫學(xué)檢測(cè)原理 概述 抗原抗體的檢測(cè)技術(shù) 免疫細(xì)胞的檢測(cè) 細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè) 粘附分子的檢測(cè) 免疫相關(guān)基因的檢測(cè) 免疫標(biāo)記技術(shù) 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)主要內(nèi)容 免疫學(xué)檢測(cè)是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測(cè)定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。 免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用極為廣泛, 疾病的診斷、療效評(píng)價(jià)及理論研究等。 一、概 述 概述 抗原抗體的檢測(cè)技術(shù) 免疫細(xì)胞的檢測(cè) 細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè) 粘附分子的檢測(cè) 免疫相關(guān)基因分析 免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫PCR(IM-PCR)技術(shù) 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)主要內(nèi)容 * 根據(jù)反應(yīng)的基本原理與表現(xiàn)主要分為凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體

2、參與的各種反應(yīng)。 * 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)還有標(biāo)記抗原(或抗體)檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)。二、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù)抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)抗原-抗體的結(jié)合是特異性結(jié)合；抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段： 特異性結(jié)合階段 可見的反應(yīng)階段抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng) 現(xiàn)象，與兩者的分子比例密切相關(guān)?？乖贵w的檢測(cè)方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體溶血反應(yīng) 和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)(Agglutination) 細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集 現(xiàn)象，稱為凝聚反應(yīng)。 1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法

3、和試管法。 2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。凝集試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn)沉淀反應(yīng)（Precipitation) 血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物，這一類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，如絮狀沉淀。大多沉淀反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱免疫擴(kuò)散。沉淀反應(yīng)單擴(kuò)與雙擴(kuò)原理單向瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙擴(kuò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析火箭電泳對(duì)流免疫電泳補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)Western Blot 檢測(cè)HIV一、概述二、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù)三、免疫細(xì)胞的檢測(cè)四、細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)五、粘附分子的檢測(cè)六、免疫相關(guān)基因分析七、

4、免疫標(biāo)記技術(shù)八、免疫PCR(IM-PCR)技術(shù) 九、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)主要內(nèi)容 對(duì)機(jī)體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,計(jì)數(shù)及功能測(cè)定。 (一) 淋巴細(xì)胞及亞群的分離三、免疫細(xì)胞的檢測(cè) (1) 抗凝靜脈血(2) 加等量NS(4) 密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3) 混勻后，緩慢加于分離液上E花環(huán)實(shí)驗(yàn)利用表面標(biāo)志分離淋巴細(xì)胞亞群流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM) FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。FCM還可對(duì)同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息

5、分析，為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項(xiàng)新技術(shù)。流式細(xì)胞儀工作原理FACS細(xì)胞分選FACS 技術(shù)分析用抗IgM單抗分離B細(xì)胞克隆Removal of T cells from marrow graft MagnetMagnetic antibodies(二) 免疫細(xì)胞功能的測(cè)定 1. T細(xì)胞功能測(cè)定： (1) 細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。 * 絲裂原主要有PHA、Con A和PWM； * 抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素、PPD和白色念珠菌等； * 同種MHC及抗CD3單抗等 * 腫瘤細(xì)胞-自體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（形態(tài)學(xué)示意圖）原理：人T細(xì)胞表面有PH

6、A或ConA受體，T細(xì)胞在體外受PHA或ConA的刺激后能轉(zhuǎn)化為體積較大、代謝旺盛、且能進(jìn)行分裂的淋巴細(xì)胞，以此測(cè)定T細(xì)胞的功能。 PHA刺激4872小時(shí)培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過(guò)濾測(cè)量放射性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（3H-TdR摻入法）示意圖靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測(cè)量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時(shí)細(xì)胞毒試驗(yàn)（51Cr釋放法）示意圖(3)T細(xì)胞功能的體內(nèi)檢測(cè)法 * 移植物抗宿主反應(yīng)(GVHR) * 遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH) 2. B細(xì)胞功能判定 (1) B細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)： (2) 溶血空斑形成試驗(yàn) (3) 反向溶血空斑試驗(yàn) (4) 酶聯(lián)免疫斑

7、點(diǎn)法(ELISPOT): 一種可檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞，又可測(cè)定抗體分泌量的體外實(shí)驗(yàn)方法。 溶血空斑實(shí)驗(yàn)ELISPOT實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、特異，且抗原用量少； 可同時(shí)檢測(cè)不同抗原誘導(dǎo)的 抗體分泌，并可定量檢測(cè) 可檢測(cè)組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞3. NK細(xì)胞活性測(cè)定 (1)形態(tài)學(xué)檢查法 (2)放射性核素釋放法：用放射性核素(51Cr、125I UdR)標(biāo)記靶細(xì)胞。 (3)酶釋放法：測(cè)定靶細(xì)胞膜受損后從胞漿內(nèi)釋放至介質(zhì)中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。(4)化學(xué)發(fā)光法(5)流式細(xì)胞術(shù) 4吞噬細(xì)胞功能測(cè)定(1)中性粒細(xì)胞趨化功能測(cè)定 濾膜滲透法(Boyden小室法) 。(2)中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能測(cè)定 1) 顯微鏡

8、檢法 2) NBT試驗(yàn) 3) 化學(xué)發(fā)光測(cè)定法(3) 巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定(4) 巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒測(cè)定一、概述二、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù)三、免疫細(xì)胞的檢測(cè)四、細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)五、粘附分子的檢測(cè)六、免疫相關(guān)基因分析七、免疫標(biāo)記技術(shù)八、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)主要內(nèi)容 細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè) 免疫學(xué)檢測(cè)法 生物學(xué)測(cè)定法 分子生物學(xué)測(cè)定法 細(xì)胞因子受體檢測(cè)的基本技術(shù) 免疫學(xué)檢測(cè)的基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原進(jìn)行定量檢測(cè)。如免疫斑點(diǎn)法、ELISA法、RIA法和免疫印跡法等均已用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。某些細(xì)胞因子含量甚微的樣品(如腦脊液)可用免疫聚合酶鏈反應(yīng)(immuno-PCR)進(jìn)行檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)法 根據(jù)細(xì)胞因子對(duì)

9、特定的生物學(xué)活性,應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng),同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比測(cè)定,從而得知樣品中細(xì)胞因子的活性水平, 一般以活性單位(U/ml)表示。生物學(xué)測(cè)定法1、促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法 3H-TdR摻入法、 比色法（ MTT、WST-1） 染色法 直接計(jì)數(shù)法2、細(xì)胞毒活性測(cè)定法 51Cr釋放 比色法（ MTT、WST-1）3、集落形成法4、細(xì)胞病變抑制法5、趨化活性測(cè)定法分子生物學(xué)測(cè)定法 RNA印跡法、核酸酶保護(hù)分析、原位雜交、PCR和Real Time PCR等。亦可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的基因組成或mRNA量，推算出細(xì)胞因子的合成量。 CKR檢測(cè)的基本技術(shù) 細(xì)胞因子的廣泛生物學(xué)活性是通過(guò)與各自相應(yīng)的受體結(jié)

10、合而發(fā)揮的。因此細(xì)胞因子受體的檢測(cè)與細(xì)胞因子檢測(cè)一樣，已成為基礎(chǔ)理論和臨床免疫學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容。 一、概述二、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù)三、免疫細(xì)胞的檢測(cè)四、細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)五、粘附分子的檢測(cè)六、免疫相關(guān)基因分析七、免疫標(biāo)記技術(shù)八、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)主要內(nèi)容 粘附分子的檢測(cè) 某些粘附分子除表達(dá)于細(xì)胞膜表面外，還以可溶性形式存在于體液中。粘附分子的檢測(cè)方法目前大多采用免疫學(xué)技術(shù)檢查其在細(xì)胞膜上的分布和測(cè)定某些樣品中的含量。一、概述二、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù)三、免疫細(xì)胞的檢測(cè)四、細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)五、粘附分子的檢測(cè)六、免疫相關(guān)基因分析七、免疫標(biāo)記技術(shù)八、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)主要內(nèi)容 免疫相關(guān)基因分析 *

11、包括各種類型的雜交技術(shù)，如轉(zhuǎn)印雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交等以及PCR技術(shù)等。 * 雜交技術(shù)主要工具是核酸探針，它是指一段用放射性核素或其他標(biāo)記物(生物素、熒光素、地高辛等)標(biāo)記，并與目的基因互補(bǔ)的DNA片段或單鏈DNA、RNA。分為cDNA探針、寡核苷酸探針、基因組DNA探針及RNA探針等。一、細(xì)胞因子基因組DNA或mRNA的檢測(cè) 1. Northern雜交分析 2. 斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交: 將DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上再進(jìn)行雜交 3. 原位雜交法 4. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交分析：將細(xì)胞因子的mRNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性細(xì)胞因子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)Southern blot后，

12、再用標(biāo)記探針檢測(cè)特異細(xì)胞因子DNA的水平。 5Southern印跡雜交 二、BCR及TCR克隆性基因重排分析1Southern印跡雜交法： 僅適用于科研，而不適用于臨床診斷。2. PCR擴(kuò)增技術(shù): 免 疫 印 跡 法 示 意 圖 PCR擴(kuò)增技術(shù): 正常多克隆淋巴細(xì)胞群DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物含有不同長(zhǎng)度的片段，電泳檢查呈現(xiàn)彌漫涂片狀結(jié)構(gòu)或多條帶。而單克隆性基因重排經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生明顯相同長(zhǎng)度的片段，電泳呈現(xiàn)單一緊密折帶狀結(jié)構(gòu)。應(yīng)用PCR 擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行基因診斷具有特異、敏感(1/1041/105克隆性細(xì)胞)、快速(24h可完成)等優(yōu)點(diǎn)。用于惡性淋巴瘤和白血病等的臨床診斷以及白血病治療后微小殘留病灶的

13、檢測(cè)。 三、HLA基因分型技術(shù)1序列特異性寡核苷酸探針PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:應(yīng)用最多的一種簡(jiǎn)單、快速而又精確的HLA-類抗原分型方法，能鑒定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精確地分析DNA的多態(tài)性。2限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (PCR-RFLP)技術(shù)：此項(xiàng)技術(shù)特別適用于個(gè)別標(biāo)本和小樣本的檢測(cè)。3單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR ( PCR-SSCP ) ：藉此可鑒別編碼HLA-類抗原基因的多態(tài)性。 應(yīng)用PCR-SSCP可以直接比較供、受體之間HLA-類基因是否完全一致，且可精確到12個(gè)堿基之差，具有相對(duì)簡(jiǎn)捷而精確的特點(diǎn)。在異基因骨髓移植的配型中已初步應(yīng)用于臨床。4序列特異

14、性引物PCR技術(shù)(PCR-SSP)：該法操作簡(jiǎn)單、快速、實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易判斷，雜合子也很易檢出。不足之處在于，為檢出所有的等位基因必須用多個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增。5指紋圖譜 (PCR-fingerprinting)技術(shù)|：進(jìn)行HLA-基因分型鑒定時(shí)，將供、受體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物混合，電泳后得出一指紋圖，再與二者各自的PCR指紋圖譜進(jìn)行比較，從中選擇出指紋圖一致的供、受體進(jìn)行移植。 * PCR指紋圖譜在選擇非親緣關(guān)系的供、受體進(jìn)行骨髓和器官移植配型時(shí)，可以節(jié)省大量時(shí)間。6. SNP(單個(gè)核苷酸多態(tài)性)分析一、概述二、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù)三、免疫細(xì)胞的檢測(cè)四、細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)五、粘附分子的檢測(cè)六、免疫相關(guān)基

15、因分析七、免疫標(biāo)記技術(shù)八、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)主要內(nèi)容免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫熒光技術(shù) 放射免疫分析法 酶免疫技術(shù) 發(fā)光免疫測(cè)定標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)抗原免疫標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)抗體免疫熒光實(shí)驗(yàn)直接與間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)ELISA實(shí)驗(yàn)抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn) Ag* Ab Ag 標(biāo)記抗原 特異性抗體 待測(cè)抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab 和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測(cè)定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性 放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖一、概述二、抗原抗體的檢測(cè)技術(shù)三、免疫細(xì)胞的檢測(cè)四、細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)五、粘附分子的檢測(cè)六、免疫相關(guān)基因分析七、免疫標(biāo)記技術(shù)八、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)主要內(nèi)容 形態(tài)學(xué)方法普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)法熒光顯微鏡檢測(cè)法 材料：石蠟切片;冰凍切片;細(xì)胞學(xué)涂 方法:電鏡觀察凋亡小體 生化學(xué)方法 免疫學(xué)方法 末端標(biāo)記法 形態(tài)學(xué)方法： PI染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；核紅色 DAPI染液；核藍(lán)白色 AO染液：核黃綠色* 凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮, 染色加深