植物組織培養(yǎng)第一章

1、植物組織培養(yǎng)第一章第一節(jié) 實驗室及其基本設(shè)備實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模： 1. 以工廠化生產(chǎn)為目的，實驗室規(guī)模太小，則會限制生產(chǎn)影響效率。 2.在設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室時，應按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。實驗室設(shè)計一、準備室 作用：材料、培養(yǎng)器械的清洗、培養(yǎng)基準備、滅菌等的準備工作。普通化學實驗室：儀器及設(shè)備、化學藥品。 純水儀、冰箱、移液槍、過濾滅菌器、電爐、微波爐、磁力攪拌器、低速臺式離心機、電腦等 。 作用：配制培養(yǎng)基。洗滌室：

2、清洗、貯存器皿設(shè)施、鼓風干燥箱等。 作用：玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料的洗滌。自動雙重純水蒸餾器滅菌室：高壓蒸氣滅菌裝置：如立式、臥式和手提式滅菌器。 作用：培養(yǎng)基、器械、棉塞、無菌紙等滅菌消毒高壓滅菌設(shè)備USING THE AUTOCLAVE TO STERILIZE MEDIA, GLASSWARE OR OTHER LAB UTENSILS 細菌過濾器細菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。二、無菌操作室 作用： 進行植物材料分離接種的重要場所，需長時間的無菌操作，對組織培養(yǎng)成功起關(guān)鍵作用。試驗設(shè)施： 超凈工作臺 紫外燈 固定式和移動式載物臺 消毒器、廣口瓶、酒精燈、酒精棉、機械支架 手術(shù)剪、解

3、剖刀、解剖針、鑷子等 超凈工作臺 (a laminar flow hood) 工作原理: 利用鼓風機驅(qū)動空氣 遁過高效過濾器除去 空氣中的塵埃顆粒， 使空氣得到凈化。 凈化空氣徐徐通過工 作臺面，使工作臺內(nèi) 構(gòu)成無菌環(huán)境。 三、培養(yǎng)室 作用： 進行材料的培養(yǎng)的場所。 其大小、規(guī)?？筛鶕?jù)工作性質(zhì)設(shè)定。以充分利用空間和節(jié)能為原則。設(shè)備： 可調(diào)控光、溫、濕度等設(shè)備。 還有固定式培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床。 適用于器官（芽、莖、花藥等）、愈傷組織、細胞和原生質(zhì)體的固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞或組織的各種器皿1234四、細胞學實驗室：作用：細胞學和組織學觀察。需備有高倍顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡、各種相機、

4、恒溫箱、切片機、恒溫水浴、滴瓶、染色缸、載玻片、蓋玻片等。五、溫室：作用：培育組織與細胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移栽鍛煉。第二節(jié) 基本操作一、洗滌方法1、重鉻酸鉀洗液：飽和的重鉻酸鉀洗液：43克重鉻酸鉀溶于1000毫升蒸餾水中（飽和溶液）。按1：1體積比將濃硫酸緩慢地倒入飽和重鉻酸鉀水溶液中。 流程： （12h） 水洗 晾干 重鉻酸鉀洗液 自來水沖凈 、蒸餾水洗兩次 干燥2、洗滌劑：洗衣粉、洗液3、超聲波洗凈器：小型玻璃器皿，頑固性污漬。超聲波除污。（要加水） 新的玻璃器皿：HCl浸泡12小時，洗衣粉、自來水洗、蒸餾水沖。 污染的玻璃器皿：要先高壓滅菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。二、滅菌方

5、法：干熱滅菌： 利用鼓風干燥箱（烘箱）進行烘烤滅菌的方法。箱內(nèi)溫度控制在150，120min。玻璃器皿.濕熱滅菌： 利用高壓蒸汽滅菌的方法。一般溫度為121，壓力，消毒1520min。培養(yǎng)基滅菌.熏蒸滅菌： 利用藥物熏蒸以達到滅菌的目的。用甲醛內(nèi)加入高錳酸鉀、百菌清、硫磺熏蒸。用3%來蘇爾溶液或1%漂白粉水溶液，或0.2%過氧乙酸溶液噴灑、拖擦地板。培養(yǎng)室、接種室滅菌.過濾滅菌： 使溶液通過夾有微孔濾膜的漏斗，濾膜孔徑需選用。在無菌環(huán)境下，用真空泵抽濾，其濾液為無菌。液體培養(yǎng)（不耐高溫活性物質(zhì)）藥劑滅菌： 用7075%酒精、0.2%升汞、10%的次氯酸鈉、新潔爾滅、Clorox等藥劑滅菌的方法

6、。培養(yǎng)材料滅菌。燒灼滅菌： 用酒精燈燒灼達到滅菌的目的。接種器具滅菌。射線滅菌： 用紫外線照射的方法滅菌。照射時間一般為1530min。接種時應關(guān)閉紫外燈。室內(nèi)滅菌。三、無菌操作：1. 接種室以及工作臺滅菌：紫外燈30分鐘，用時一定要關(guān)閉它。2. 工作臺消毒：70%乙醇，用小型噴壺消毒或棉球擦拭。3. 點燃酒精燈，開啟滅菌器,對使用器械進行燒烤滅菌。器械冷卻后方可使用。第三節(jié) 培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分（ culture medium：維持離體細胞生存和生長的溶液）主要有：1、無機鹽(inorganic elements)：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn

7、、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。2、 有機化合物（organic compounds) ：碳源（糖類），維生素類，有機含氮化合物。3、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長素，細胞分裂素，赤霉素，脫落酸等。4、 附加物類：瓊脂，活性炭，椰乳，硝酸銀等。1、無機鹽(inorganic elements)大量元素和微量元素大量元素N：用量最多。常用的有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，KNO3、NH4NO3植物組織 從培養(yǎng)基中吸收氮后形成蛋白質(zhì)。P：在植物組織培養(yǎng)在的細胞增殖分化大量需要。主要從NaH2PO4、 KH2PO4供應。磷參與核酸、能量代謝。K：直接影響培養(yǎng)物中酶的活性。主要由KCl、KNO3或KH2PO4供應。Ca

8、、S、Mg： CaCl2、Ca(NO3)2作為Ca來源，MgSO4作為S和Mg的來源。微量元素主要包括Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I等。植物對這些元素需要量甚微，稍多會發(fā)生毒害。Fe是用量較多的一種微量元素，對組織中葉綠素的合成和延伸生長起重要作用。鐵常以FeSO4和乙二胺四乙酸鈉(Na2-EDTA)的螯合物存在于培養(yǎng)基中。2、 有機化合物（organic compounds) 有機碳源：即糖類。作用：維持培養(yǎng)基的合適滲透壓對初生細胞和原生質(zhì)體的完整性有十分重要作用。另外，糖類也是合成有機物的碳源。最常用有：蔗糖、葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。作為氮源，蔗糖一般濃度為

9、2%3%。糖的濃度影響組織分化類型：在高濃度（3%4%）的蔗糖有利于韌皮組織分化；低糖濃度（1.5%2.5%）時，僅生長出木質(zhì)部；適中濃度時形成具有木質(zhì)部和韌皮部。維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質(zhì)、脂肪代謝等重要生命活動。VB1（Thiamine-HCl, 鹽酸硫胺素）參與碳水化合物等有機物轉(zhuǎn)化，促進生長素誘導不定根的發(fā)育。用量10mg/L。VB5 (Nicotinic Acid，煙酸 )，可促進培養(yǎng)物生長。煙酸是尼克酰胺的前體，尼克酰胺核苷酸是脫氫酶輔酶NAD+、NADP+的成分。用量1mg/L。VB6（Pyridoxine-HCl，鹽酸吡哆醇）參與植物氮代謝,促進愈傷組

10、織生長、提高愈傷組織分化能力、促進培養(yǎng)物生長。用量1mg/L。葉酸（VB9）促進培養(yǎng)物生長，參與嘌呤、嘧啶合成。VB12（生物素VH）培養(yǎng)物也有促進作用。肌醇（Myo-insotol , 環(huán)己六醇）：具有幫助活性物質(zhì)發(fā)揮作用的效果，可提高VB1的效應。同時對促進培養(yǎng)物的生長，胚狀體及芽的形成有良好作用。 用量：一般50100mg/L。有機含氮化合物氨基酸：常用的為：甘氨酸及酰胺類物質(zhì)。 如谷氨酰胺（Glutamine），天冬酰胺和多種氨基酸混合物。水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate, LH）、水解酪蛋白（Casein hydrolysate，CH）。3、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

11、生長素： 吲哚乙酸（IAA）：在培養(yǎng)組織中有吲哚乙酸氧化酶，可使IAA解體，而且也可在光下分解，用量稍高。 吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA），人工合成化學物質(zhì)，用量低（2mg/L）。 2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），作用比IBA和NAA強。細胞分裂素： 激動素（Kinetin, KT） 6-芐基腺嘌呤（6-Benzyladenine, 6-BA） 玉米素（Zeatin, ZT） 2-異戊烯基腺嘌呤（2-Isopentenyl adenine, 2iP） 噻重氮苯基脲（Thidiaznron, TDZ）（噻苯?。?赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生長調(diào)節(jié)物質(zhì)也在

12、組織培養(yǎng)中應用。 GA3主要用于促進試管苗的生長。 ABA體胚的發(fā)育成熟。 PP333促進壯苗。 在組織培養(yǎng)中，生長素的主要作用是誘導外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織及促進培養(yǎng)物生長，誘導根器官的分化。 細胞分裂素的主要作用是促進細胞的分裂和分化，誘導不定芽和胚狀體的分化和形成，延緩組織衰老，增加蛋白質(zhì)合成。4、 附加物類常用附加物類有:瓊脂(Agar): 組織培養(yǎng)支持物.本身并不提供任何營養(yǎng)，它是一種高分子的碳水化合物，從紅藻等海藻中提取，僅溶解于熱水，成為溶膠，冷后(40以下)即凝固為固體狀的凝膠。在固體培養(yǎng)方式中不可缺少。一般用量為0.5%1.0%，有固體條狀和粉狀兩種。瓊脂糖(Agerose)

13、:可改善培養(yǎng)物的供氧狀況。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C（Vc）以及硝酸銀等，可防止培養(yǎng)材料的褐變.活性碳(AC)：具有吸附能力，減少有害物質(zhì)的影響，如可防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。也有利于某些植物生根 .用量1-5%. 馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時可將馬鈴薯去皮、切碎、水煮20一30分鐘，然后將濾液加入培養(yǎng)基中，其用量通常為100200g/L。當培養(yǎng)基中添加了馬鈴薯萃取液后，可以對pH產(chǎn)生緩沖作用，試管苗也生長得更為健壯。香蕉：多用于蘭花的組織培養(yǎng)，將成熟香蕉果肉搗爛后，添加到培養(yǎng)基中，用量150200g/L。香蕉果泥可緩沖培養(yǎng)基的pH，對外植體的分化有著較為明顯的促

14、進作用。椰乳：Coconut milk, CM。用于較難培養(yǎng)的植物材料的培養(yǎng)基中?？蓪⒁拥囊簯B(tài)胚乳取出、或高壓滅菌，或無菌過濾。使用濃度100-200mLL。 二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基 無機鹽數(shù)量適宜，硝酸鹽、鉀和銨鹽的含量比其他培養(yǎng)基高。 應用最廣泛。主要用于園藝植物、木本植物、花卉、蔬菜等的組織培養(yǎng)。B5培養(yǎng)基 銨的含量較低。在豆科植物上應用最多。 培養(yǎng)大豆細胞和組織培養(yǎng)設(shè)計。White培養(yǎng)基 成分比較簡單，無機鹽和糖的用量低。（二）培養(yǎng)基按試驗目的分為： 誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基 （脫分化培養(yǎng)基）： 外植體誘導發(fā)生愈傷組織的培養(yǎng)基

15、。 水稻誘導愈傷組織時加；而煙草、胡蘿卜既需生長素，又需細胞分裂素。繼代培養(yǎng)基： 誘導出愈傷組織后，使愈傷組織能不斷地生長下去的培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)： 由愈傷組織誘導形成小苗（幼芽或胚狀體）的培養(yǎng)基。 不加任何激素的基本培養(yǎng)基，即可誘導分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。 加較高濃度細胞分裂素和少量生長素培養(yǎng)基。如煙草、矮牽牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒掛金鐘等組織的分化。 只加細胞分裂素的培養(yǎng)基。如豌豆、油菜、小麥等。生根培養(yǎng)基： 誘導再生小苗生根的培養(yǎng)基。在無任何生長激素的基本培養(yǎng)基中就可生出良好的根系。如煙草、紅薯、草莓、枸杞等。有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以誘導根。有些需要減低培養(yǎng)

16、基中無機鹽的濃度。如用MS 培養(yǎng)基中1/2或1/4的無機鹽誘導生根，?？色@得良好的效果。 生長素和細胞分裂素對擬南芥愈傷組織器官分化的影響生長素和細胞分裂素對褐斑伽藍葉片器官分化的影響（三）培養(yǎng)基按其物理性質(zhì)劃分為：固體培養(yǎng) 在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，使液體培養(yǎng)基固化,一般用于組織或器官培養(yǎng).優(yōu)點：使用方便，占地不大。缺點：培養(yǎng)外植體只能有部分組織與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)物上下部因接受養(yǎng)分不均勻，引起組織生長的差異。液體培養(yǎng) 培養(yǎng)物消毒后直接置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),一般用于細胞培養(yǎng)。優(yōu)點：培養(yǎng)物吸收營養(yǎng)比較充分，容易獲得均勻一致的細 胞群體。缺點：轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基較麻煩。 液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培

17、養(yǎng)兩種形式。靜止培養(yǎng) 在液體培養(yǎng)中用濾紙做成紙橋，橋系緊貼培養(yǎng)液表面，四周插入溶液中，直至瓶底部，使營養(yǎng)液借助毛細管力滲入濾紙，培養(yǎng)物置于濾紙橋面，通過紙橋源源不斷地供給養(yǎng)分。振蕩培養(yǎng) 將裝有培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)基的器皿置于轉(zhuǎn)床或搖床上進行培養(yǎng)，它既能使培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中均勻的接觸吸收培養(yǎng)基成分，又能保持良好的通氣條件. 搖床有旋轉(zhuǎn)式、半旋轉(zhuǎn)式和往復式三種。速度比轉(zhuǎn)床快。 （三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長情況，確定較適宜的培養(yǎng)基。調(diào)整：根據(jù)培養(yǎng)物的生長情況或培養(yǎng)目的的不同，對培養(yǎng)基進行調(diào)整，探索新的培養(yǎng)基。 如：改良MS、改良B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等。三、 培養(yǎng)基的制備

18、 （一）母液的配制大量元素母液：配制原溶液的1050X，依次溶解，混合定容。微量元素母液：一般配制100X，定容。稱量時最好用萬分之一的電子天平。鐵鹽母液：亦配制100X，硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸鈉（Na2-EDTA）分別溶解后，混合后再螯合30分鐘，最后定容。有機物母液：100X，定容。生長調(diào)節(jié)物母液：濃度1mg/ml。 生長素類：IAA、NAA、IBA為有機酸，制備時用堿液溶解。 IAA溶液配置：一般稱25mg ，加3ml，溶解后，加水定容25ml，即為IAA 1mg/ml，也可用無水乙醇溶解后定容。 細胞分裂素類，KT、BA等，一般用溶解后加水定容。配制母液注意幾點：配制倍數(shù)不宜過高，可避

19、免浪費；也可避免倍數(shù)過高，吸取量相對少而影響準確性。母液配制好后應放在24冰箱內(nèi)保存。母液貯備時間不宜過長。過長時宜出現(xiàn)沉淀和微生物污染。幾種培養(yǎng)基成分表(mg/L)培養(yǎng)基 成分Murashige&Skoog(MS,1962)Gamborg(B5,1968)White(W-63,1963)N6朱至清，1975）（NH4）SO4NH4NO3KNO3Ca(NO3)2.4H2OCaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4NaH2PO4.H2ONa2-EDTAFe-EDTANaFe-EDTAFeSO4.7H2OKClNa2SO4Fe2SO4)3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OH3BO3

20、KIMoO3Na2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl.6H2O鹽酸硫胺素VB1煙酸鹽酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸蔗糖瓊脂pH1650190044037017037.327.822.38.66.20.830.250.0250.0250.10.50.51002.030(g)10(g)5.8134250015025015037.327.8102.03.00.750.250.0250.025101.01.010020(g)10(g)5.580200720172002.55.03.01.50.750.0010.10.30.13.020(g)10(g)5.6463283016618540037.3

21、27.84.43.81.60.81.00.50.52.050(g)10(g)5.8大量元素微量元素有機物鐵鹽溶液（二）培養(yǎng)基配制按培養(yǎng)基配方濃度將母液實際用量依次加入大量筒中。然后將蔗糖溶解加入，用蒸餾水定容至所需要的體積。調(diào)整pH值（1mol/L NaOH或1mol/L HCl)。另外,瓊脂溶解后的總體積計算在培養(yǎng)基體積中，溶解后，分裝培養(yǎng)器皿中，加塞，準備消毒。 第四節(jié) 離體培養(yǎng)體系的建立 一、建立離體培養(yǎng)體系的基本程序 1. 無菌外植體的獲得 2. 初代培養(yǎng)物的建立 3. 形態(tài)發(fā)生和植株再生 外植體（離體的植物器官、組織、細胞）脫分化愈傷組織再分化器官發(fā)生：不定根或不定芽胚胎發(fā)生：胚狀體植物體二、外植體選擇的基本原則 1. 再生能力強： 基因型；分化程度；發(fā)育年齡；器官和組織的類型、部位等。 2. 遺傳穩(wěn)定性好； 3. 外植體來源豐富； 4. 外植體容易滅菌：地上比地下、一年生比多年生、幼嫩比老齡、