基因工程基本原理及操作程序（行業(yè)經(jīng)驗）

1、基 因 工 程選修3 專題一1陽山書屋c基因工程的概念 基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。2陽山書屋c蘇云金桿菌毒蛋白基因毒蛋白殺死害蟲棉花細胞抗蟲棉的培育3陽山書屋c基因工程的概念 基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。4陽山書屋cDNA片段的連接工具（“分子縫合針”） DNA連接酶基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運輸車”） 運載體一、DNA重

2、組技術(shù)的基本工具準確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”） 限制酶5陽山書屋c 特點：一種限制酶只能識別DNA的一種核苷酸序列，并在特定的位點切割DNA.1、限制酶6陽山書屋c限制性內(nèi)切酶限制酶7陽山書屋c限制酶切割的是么？DNA分子 切割DNA分子兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。8陽山書屋c切割DNA分子后形成什么？黏性末端（在中軸線兩側(cè)切割DNA）平末端 （在中軸線處切割DNA）9陽山書屋c 會產(chǎn)生互補的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。 如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？10陽山書屋c11陽山書屋c 將雙鏈DNA分子片段“縫合”

3、起來，恢復兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接的是什么？2、DNA連接酶12陽山書屋cAATTGCCTTAAG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵13陽山書屋c基因的針線：DNA連接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G剪刀：用同種限制酶切割14陽山書屋cDNA連接酶的種類T4 DNA連接酶： 連接黏性末端和平末端Ecoli DNA連接酶：黏性末端15陽山書屋c3、運載體 常用的運載體： 質(zhì)粒、噬菌體和動植物病

4、毒等標記基因，便于進行檢測。 質(zhì)粒存在于許多細菌和酵母菌等生物中,是擬核或細胞核外能夠自主復制的很小的環(huán)狀DNA分子.16陽山書屋c特點： 1.結(jié)構(gòu)簡單，能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存。 2.具多種限制酶的單一切點，以便與外源基因連接。 3.具有某些標記基因，便于進行篩選。 4.對宿主細胞沒有傷害。作用：將目的基因?qū)胧荏w細胞常用運載體：質(zhì)粒 動植物病毒 噬菌體17陽山書屋c基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將表達載體導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定18陽山書屋c一、目的基因的獲取1、目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因2、獲取目的基因的常用方法?從基因文庫

5、中獲取利用PCR技術(shù)擴增人工合成19陽山書屋c從基因文庫中獲取目的基因基因文庫 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蚪M文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）20陽山書屋c基因組文庫 通過對受體菌群體的培養(yǎng)而儲存一種生物的全部基因。21陽山書屋ccDNA文庫的構(gòu)建提取生物某發(fā)育時期mRNA單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈的cDNA (只含該生物的部分基因)與載體連接導入受體菌群儲存起來22陽山書屋c基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較23陽山書屋c真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶的結(jié)合位點內(nèi)含子

6、外顯子 能轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì) 不能轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)啟動子終止子內(nèi)含子： 外顯子： 24陽山書屋c基因組文庫和 cDNA文庫的比較25陽山書屋c利用PCR技術(shù)擴增目的基因人工合成法： 基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成。26陽山書屋c目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。質(zhì) 粒 目的基因 啟動子 終止子二、基因表達載體的構(gòu)建 27陽山書屋c啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRN

7、A的轉(zhuǎn)錄標記基因：為了鑒別受體細胞中是否導入了目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來28陽山書屋c用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出_。用_切斷目的基因，使其產(chǎn)生_將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶 用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使之露出相同的粘性末端，再加入DNA連接酶。29陽山書屋c三、將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn) 化 方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)

8、維持穩(wěn)定和表達的過程。Ca 處理細胞 2+30陽山書屋c農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。原理：Ti質(zhì)粒上的TDNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。31陽山書屋c基因槍法： 單子葉植物花粉管通道法： 抗蟲棉32陽山書屋c 目的基因表達載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 轉(zhuǎn)基因受精卵 轉(zhuǎn)基因動物顯微注射法33陽山書屋c顯微注射法34陽山書屋c 用Ca2+處理細胞 感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胛⑸锛毎?5陽山書屋c四、目的基因的檢測與鑒定四環(huán)素抗性基因 青霉素抗性基因大腸桿菌3

9、6陽山書屋c四、目的基因的檢測與鑒定分子水平檢測個體水平鑒定檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否 插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法DNA分子雜交方法抗原-抗體雜交抗蟲鑒定、抗病鑒定等方法DNA分子雜交37陽山書屋c DNA分子雜交原理：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴格按照堿基互補配對進行。 因此，當用探針和轉(zhuǎn)基因生物的DNA雜交時候，如果出現(xiàn)雜交帶（用特殊的顯影裝置可以看見），則說明目的基因已插入受體細胞的染色體DNA中。 基因探針：是一小段單鏈的DNA或RNA，帶有放射性同位素標記，并能與目的基因的的一條鏈發(fā)生堿基互補配對。 38陽山書屋c39陽山書屋c檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA方法DNA與mRNA雜交檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì)方法抗原抗體雜交檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因 DNA與DNA雜交 檢測抗蟲棉是否翻譯出毒蛋白：從蘇云金桿菌中提取毒蛋白，注入某種動物體內(nèi)，從動物的血清中分離相應(yīng)抗體，并用熒光標記該抗體。然后用標記的抗體與抗蟲棉的細胞提取液混合，若出現(xiàn)雜交帶，則表明抗蟲基因已在棉花細胞被表達。40陽山書屋c基因工程的基