顯微鏡直接計數(shù)法知識課件

1、顯微鏡直接計數(shù)法 湯國平一、實驗?zāi)康?、明確顯微鏡計數(shù)的原理。2學(xué)習(xí)使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。二、實驗材料 酵母菌懸液，血球計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)管、吸水紙等。三、實驗原理 利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法的優(yōu)點是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的（0.13），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。 血球計數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽

2、構(gòu)成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室，微生物的計數(shù)就在計數(shù)室中進行。 計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，共400小格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格，總共也是400小格。所以無論是哪種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的。每一個大方格邊長為1，則每一大方格的面積為12，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1，所以計數(shù)室的容積為0.13。其計算方法如下：12516的計數(shù)板計算公式細(xì)胞數(shù)/ ml

3、=(80小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù) /80)40010000稀釋倍數(shù) =A/5 25 104 B21625的計數(shù)板計算公式細(xì)胞數(shù)/ ml=(100小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù) /100)40010000稀釋倍數(shù) =A/4 16 104 B四、操作過程1稀釋將酵母菌懸液進行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數(shù)。3加樣品將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細(xì)口滴管將稀釋的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），使菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。靜置510分鐘即可計數(shù)。4顯微鏡計數(shù)將血

4、球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有510個菌體為宜。若選用2516規(guī)格的計數(shù)板則每個計數(shù)室選5個中方格，可選4個角和中央的中格（即80個小格），若選用1625規(guī)格的計數(shù)板，則數(shù)四個角：左上、右上、左下、右下的四個中方格，（即100小格）中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時，即作兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。5.對每個樣品計數(shù)三次，取其平均值，計算每1ml菌液中

5、所含的酵母菌個數(shù)。 各中格中菌數(shù)A B二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室第二室 A-五個中方格的總菌數(shù)B-稀釋倍數(shù)6清洗血球計數(shù)板 血球汁數(shù)板使用后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，或用95的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。 7.注意事項（1）實驗過程中發(fā)現(xiàn)，如何稀釋？ 如果發(fā)現(xiàn)每小格中酵母菌的個數(shù)多于10個，可按以下處理：取1ml酵母菌培養(yǎng)液加入到盛有9ml蒸餾水的試管中，搖勻，再計數(shù)；如發(fā)現(xiàn)酵母菌的個數(shù)仍然過大，則同樣再稀釋一次，直至每小格中酵母菌的個數(shù)介于5-10，并作記錄。（2）調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。