cas9技術(shù)原理簡介易懂版

1、 /6 /6CRISPR/Cas9技術(shù)簡介1、來源簡介2、結(jié)構(gòu)簡介3、工作原理簡介4、sgRNA克隆步驟（整理歸納文獻版本）1、來源簡介CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒與外源DNACRISPR/Cas9系統(tǒng)通過將入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應(yīng)的CRISPRRNAs（crRNAs）來指導(dǎo)同源序列的降解從而提供免疫性。（文字來源：百度百科）2、結(jié)構(gòu)簡介CRISPR/Cas9系統(tǒng)其實分為兩個部分：CRISPR和Cas9。其中CRISPR是一段特殊DNA結(jié)構(gòu)的序列，而Cas9為一種核酸酶。1）CRISPR英

2、文全稱：Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，即：規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，也就是一種基因編輯器。它是細(xì)菌用以保護自身對抗病毒的一個系統(tǒng)，也是一種對付攻擊者的基因武器。是一種精確的萬能基因武器，可以用來刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標(biāo)基因oCRISPR簇是一個廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族。其結(jié)構(gòu)如下：ACRfSPfflLocusSpacersRepealsAArray其序列由一個前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個間隔區(qū)(Spacer)組成。前導(dǎo)區(qū)一般位于CR

3、ISPR簇上游，是富含AT長度為300500bp的區(qū)域，被認(rèn)為可能是CRISPR簇的啟動子序列。重復(fù)序列區(qū)長度為2148bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。重復(fù)序列之間被長度為2672bp的間隔區(qū)隔開。Spacer區(qū)域由俘獲的外源DNA組成，類似免疫記憶，當(dāng)含有同樣序列的外源DNA入侵時，可被細(xì)菌機體識別，并進行剪切使之表達(dá)沉默，達(dá)到保護自身安全的目的。2)Cas9:通過對CRISPR簇的側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在其附近存在一個多態(tài)性家族基因。該家族編碼的蛋白質(zhì)均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且與CRISPR區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)

4、基因(CRISPRassociated)，縮寫為Cas。目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)有三種不同類型即I型、II型和III型，它們存在于大約40%已測序的真細(xì)菌和90%已測序的古細(xì)菌中。其中II型的組成較為簡單，以Cas9蛋白以與向?qū)NA(gRNA)為核心組成，也是目前研究中最深入的類型。Cas9含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA的兩條單鏈，其結(jié)構(gòu)簡單認(rèn)識為：NH2IRzC活性位點HNH活性位點COOH在Cas9的氨基末端有RuvC活性位點，在蛋白中部有HNH活性位點。這兩個獨特的活性位點在Cas9發(fā)揮剪切作用時至關(guān)重要。3、工作原理簡介當(dāng)細(xì)菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時，在前導(dǎo)區(qū)

5、的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長的RNA前體(PreRISPRRNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，最終識別并結(jié)合到與其互補的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。在II型系統(tǒng)中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9單獨參與。在pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時，與其重復(fù)序列互補的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也轉(zhuǎn)錄出來，并且激發(fā)Cas9和雙鏈RNA特異性RNaseIII核酸酶對pre-crRNA進行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復(fù)合體，其中crRNA與tracr

6、RNA退火形成的復(fù)合物能夠特異性識別基因組序列，隨后復(fù)合物通過PAM(ProtospacerAdjacentMotif，結(jié)構(gòu)特征：5-NGG-3。CRISPR/Cas9的剪切位點位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(qū)(5-GG-N18-NGG-3)特征區(qū)域中的NGG位點，該位點是實現(xiàn)剪切功能的關(guān)鍵。)序列結(jié)合于目的DNA中crRNA互補的序列，然后解開DNA雙鏈,形成R-loop，使crRNA與互補鏈雜交，形成DNA-RNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，而另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9中的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA鏈，RuvC活性位點剪切非互補鏈，最終引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶在目的片段生

7、成DNA雙鏈斷裂(double-strandbreaks，DSBs)。工作原理簡化如下：+r,r-R.NARuvC性targe!DMA恆點ri：iiiii-rniiiiii活性prospace-rIIMIWPAMHIIIIIIIHIIIillllnccIIIIIIIIIIIL,4rRNAharRMARenamespecificsgNAsquert-ce1111111111Hl1111H11H1111CiiiiimiaQPAM(S-NGG-1)Sm口in禮DNAIImuGenomicPA-SitapeiHc：dsDNAbffaslc剪切復(fù)合體引發(fā)雙鏈斷裂（DSBs）后，細(xì)胞的非同源末端連接修復(fù)機

8、制（NHEJ）重新連接斷裂處的基因組DNA，并引入插入或缺失突變。另一種情況是，一個外源雙鏈供體DNA片段可以通過同源重組（HR）整合進斷裂處的基因組。如下圖：TargetedlocusTargetedlocusTargelediteknot&seleconm軻keChrZflP.：|54W4、sgRNA克隆步驟上述識別復(fù)合體可以通過融合crRNA與tracr-RNA序列形成sgRNA(single-guideRNA)進行簡化。融合的sgRNA具有與野生型RNA類似的活力，通過將sgRNA的元件與表達(dá)Cas9的元件連接，得到可以同時表達(dá)兩者的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，便能對目的基因進行操作。構(gòu)建高活

9、性的sgRNA也是進行Cas8克隆的關(guān)鍵步驟之一。多個sgRNA克隆與一個Cas9克隆共轉(zhuǎn)染可同時在基因組中編輯多個位點。crRNA與tracr-RNA融合后如下圖：口旺泊NAchimera以上內(nèi)容整合了各介紹內(nèi)容以與個人理解。.loybio./biowiki/t3170/.biomart./news/16/133166.htm.fulengen./product/crispr-cas9/baike.baidu./link?url=3Y0Ho6nmHYSd1AObCd0rLIbY9TXYLPwdR4t94yItw4UUAuwxJwyRe3oQ01VLGqy5bOM-6x_J_YY-bIaNtV5aeq.biomart./infosupply/20341973.htm參考文獻：FAnnRan,FengZhangetal.GenomeengineeringusingtheCRISPR-Cas9system.natureprotocols|VOL.8NO.11|2013|Mali,P.,L.Yang,etal.(2013).RNA-guidedhuman