實(shí)驗(yàn)九脲酶波氏比色法測定血清尿素

1、1實(shí)驗(yàn)九 脲酶波氏比色法測定血清尿素實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握該方法的原理和操作2、了解影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素 23概述 非蛋白含氮化合物包括除蛋白質(zhì)以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌呤、谷胱甘肽等多種含氮有機(jī)物。其中尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作為腎小球?yàn)V過功能的指標(biāo)。 4檢測尿素的方法分兩類1、直接法（二乙酰一肟法） 利用二乙酰在強(qiáng)酸條件下與尿素縮合成紅色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，顏色深淺與尿素含量成正比。 本法試劑單一，方法簡便，但試劑具毒性和腐蝕性。在標(biāo)本數(shù)量多時(shí)加熱開始難以達(dá)到100，各管間受熱溫度也可能不一致，因而本法重復(fù)性不佳。 5 2、脲酶法 是直接或間接測定經(jīng)脲酶

2、作用后由尿素轉(zhuǎn)變成 的氨，氨的測定方法有：1) 利用電導(dǎo)電極測量導(dǎo)電率的變化。2) 利用pH電極或pH指示劑測量反應(yīng)前后pH 值的變化。3) 波氏法。4) 偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶340nm測定吸光度下降 率。5）干化學(xué)法。6 一、原理：脲酶水解尿素產(chǎn)生2分子氨和1分子二氧化碳，氨在堿性介質(zhì)中與苯酚及次氯酸鈉反應(yīng)，生成藍(lán)色的吲哚酚陰離子，此過程需用亞硝基鐵氰化鈉催化反應(yīng)。藍(lán)色吲哚酚的生成量與尿素含量成正比，在550nm波長處有吸收峰。 脲酶波氏比色法 4、 尿素標(biāo)準(zhǔn)液 7.14mmol/l7 三、操作步驟： 按下表操作。 脲酶應(yīng)用液預(yù)溫5分鐘 加入物(ml)測定管1、2標(biāo)準(zhǔn)管空白管脲酶應(yīng)用液0.50.

3、50.5血 清0.01尿素標(biāo)準(zhǔn)液 0.01無氨去離子水0.01混勻，37水浴15min酚顯色劑111堿性次氯酸鈉111混勻，置37水浴20min。波長550nm，空白管調(diào)零，讀取吸光度。 89結(jié)果計(jì)算10參考范圍 1.79-6.78 mmol/L。 11臨床意義 1血液尿素濃度增高 分生理性和病理性因 素兩方面。(1) 生理因素：高蛋白飲食引起血清尿素濃度和尿液排出量顯著增高。血清尿素濃度男性比女性平均高0.30.5mmol/L，隨年齡增加有增高傾向。成人日間生理變異平均為0.63mmol/L。12(2) 病理因素1) 腎前性：最重要的原因是失水，因血液濃縮使腎血流量減少，腎小球?yàn)V過率減低而致

4、血液尿素濃度增加。2) 腎性：腎小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎炎及中毒性腎炎等影響腎小球?yàn)V過的疾病，都可使血液尿素含量增高。133) 腎后性疾?。核惺鼓蚵纷枞囊蛩囟伎梢鹧褐心蛩睾吭龈撸缜傲邢倌[大、尿路結(jié)石、尿道狹窄、膀胱腫瘤致使尿道受壓等。2血尿素濃度降低除嬰兒、孕婦以及低蛋白高糖飲食者外，常見于肝功能衰竭患者。14注意事項(xiàng) 本法亦能測定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多1000多倍，因而測定尿氨時(shí)，氨必須經(jīng)過校正，可測定用脲酶處理前尿標(biāo)本中的氨以校正內(nèi)源性氨。空氣中氨氣對(duì)試劑或玻璃器皿的污染或使用銨鹽抗凝劑可使結(jié)果偏高。高濃度氟化物可抑制尿素酶，引起結(jié)果假性偏低。1

5、5大氣及試劑用水中的氨可明顯干擾尿素的測定，使結(jié)果假性增高。酶工作液接觸大氣8d后，測定值上升1.07mmol/L；去離子水明顯吸收氨，使測定值明顯升高。膽紅素在34.2mol/L以上時(shí)尿素測定值有不同程度的降低，在25.6568.4mol/L之間時(shí)，平均降低0.47mmol/L，但與膽紅素含量不成正比。 16方法學(xué)評(píng)價(jià) 1呈色穩(wěn)定性 在1h內(nèi)吸光度的波動(dòng)僅為0.005，12h后較最初吸光度讀數(shù)也僅增高0.010.02。2本法批內(nèi)CV1.8%，批間CV2.7%；回收率96.71%103.35%；與酶偶聯(lián)法對(duì)照測定病人標(biāo)本37例，相關(guān)系數(shù)(r)為0.972；線性范圍較寬，達(dá)17.58mmol/L

6、。17試劑標(biāo)準(zhǔn)化尿素酶對(duì)不同緩沖液的最適PH不同Chaney的配方最適pH為6.5，美國臨床化學(xué)協(xié)會(huì)推薦的配方最適pH為7.5。酶濃度的選擇 每管3U酶量在溫育3分鐘及6分鐘均能達(dá)到終點(diǎn)。試劑穩(wěn)定性觀察 尿素酶干粉4保存至少穩(wěn)定一年，但甘油溶液穩(wěn)定性較差；催化劑劑量對(duì)酶活性的影響 最適為50mg/L，量過多對(duì)酶有抑制作用 18二、酶偶聯(lián)速率法 原理：尿素經(jīng)脲酶催化水解生成2分子氨及1分子二氧化碳，在谷氨酸脫氫酶催化下，氨與-酮戊二酸還原型輔酶作用生成谷氨酸與氧化型輔酶。還原型輔酶在340nm波長處有吸收峰，其吸光度下降的速率與待測樣品中尿素的含量成正比。19方法評(píng)價(jià)1本法批內(nèi)CV 0.78%，批間CV 2.94%；回收率93.0