大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化精課件

1、實(shí)驗(yàn)九，十大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化 在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌（受體細(xì)胞）經(jīng)理化方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時(shí)性改變，成為能允許外源 DNA 分子進(jìn)入的細(xì)胞，稱感受態(tài)細(xì)胞。一. 實(shí)驗(yàn)原理1. 概念感 受 態(tài) 細(xì) 胞 轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 轉(zhuǎn) 化 轉(zhuǎn)化過程

2、所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體,它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如物理制備法,化學(xué)制備法等)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。 進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。 將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。 轉(zhuǎn) 化轉(zhuǎn)化過程KCl法， CaCl2法，電擊感受態(tài)制備等 RbCl(KCl)法制

3、備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但制備較復(fù)雜，不適合實(shí)驗(yàn)室用 電擊感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，操作簡便，但需電擊儀 CaCl2法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15的無菌甘油于-70以下保存半年，因此CaCl2法使用更為廣泛.常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于的培養(yǎng)菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),

4、這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。 提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5。提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的,并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新

5、的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。 提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素1）材料E. coli DH5菌株； 質(zhì)粒、 1.5ml 離心管（又稱eppendorf管） 卡那霉素； 2）設(shè)備 恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，低溫冰箱，恒溫水浴鍋，制冰機(jī)，分光光度計(jì)，微量移液槍， eppendorf管等。 二. 材料，設(shè)備及試劑 0.1mol/L的CaCl2 LB液體培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基 Kana母液：卡那霉素(Kanamycin )母液：配成 50mg/m

6、l水溶液, -20保存?zhèn)溆?3. 試 劑三. 操作步驟 本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于質(zhì)粒帶有卡那霉素抗性基因，可通過卡那霉素抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，則在含卡那霉素的培養(yǎng)基上不能生長。能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。 受體菌的培養(yǎng) 1) 從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37,180rpm振蕩培養(yǎng)過夜； 2) 將該菌懸液以1:30-100的比例接

7、種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23小時(shí)至OD600在0.5左右 ; 3) 無菌條件下取1.5 ml菌液到eppendorf管中，冰浴10min，4, 8000rpm離心5min; 4) 徹底棄上清液，在冰浴上加入500ul預(yù)冷的無菌CaCl2 (0.lmol/L)使細(xì)胞懸?。?5) 4 ,8000 rpm離心4min，棄上清液; 6) 用100l預(yù)冷的無菌CaC12 (0.lmol/L) 重新懸浮細(xì)胞，冰上備用；2. 轉(zhuǎn)化 取50l感受態(tài)細(xì)胞懸液，在冰浴中使其解凍，加入10l連接產(chǎn)物（或質(zhì)粒DNA）(含量不超過50ng,體積不超過10l)，輕輕搖勻，冰上30-40min；A.質(zhì)粒DNA組：10l 質(zhì)粒DNA +50l感受態(tài)細(xì)胞懸液B.空白對(duì)照組:10ul 無菌水50l感受態(tài)細(xì)胞懸液 42水浴中熱擊90秒（勿搖動(dòng)），熱擊后迅速置于冰上冷卻2min； 向管中加入400l LB液體培養(yǎng)基(不含卡那霉素)，混勻后37，180rpm振蕩培養(yǎng)40min，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(卡那霉素 )；涂平板：將上述菌液搖勻后取80ul涂布于含Kana的篩選平板上，在菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，37倒置培養(yǎng)皿培養(yǎng)1218h。 注意：1、含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基的配制:將滅菌的LB固體培養(yǎng)基水浴溶解后冷卻至60左右,加入Kana儲(chǔ)存液,使終濃度為10