-第16章免疫學(xué)應(yīng)用課件

1、第十五章 免疫學(xué)應(yīng)用教學(xué)目的：掌握：基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法；免疫細胞的檢測方法 ；人工（自然）主動免疫、人工（自然）被動免疫的概念。理解：基于抗原-抗體反應(yīng)的特點及影響因素；免疫分子的檢測原理；免疫細胞的檢測方法與原理；以抗體、細胞和細胞因子為基礎(chǔ)的免疫治療了解：免疫分子的檢測原理；免疫學(xué)診斷的原理、常用的免疫功能檢測指標(biāo)；免疫治療制劑的類型和作用機制 教學(xué)重點：基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法及原理；人工（自然）主動免疫、人工（自然）被動免疫的概念。教學(xué)難點：抗原-抗體反應(yīng)的特點及影響因素。使用教材：醫(yī)學(xué)免疫學(xué)（第二版），龔非力主編，科學(xué)出版社，2019年。參考教材：醫(yī)學(xué)免疫學(xué)（第五版），金伯

2、泉主編， 人民衛(wèi)生出版社，2019年；/主要內(nèi)容第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法第二節(jié)免疫細胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第四節(jié) 免疫學(xué)預(yù)防第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實驗所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)（serological reaction)應(yīng)用：用已知抗原檢測未知抗體；用已知抗體檢測未知抗原：定性或定量檢測體內(nèi)各種分子；用已知抗體檢測半抗原物質(zhì)。（一）特異性和交叉反應(yīng) 特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性。一、抗原-抗體反應(yīng)的特點交叉

3、反應(yīng)（cross reaction）性：若兩種抗原分子有一個或數(shù)個相同（或相似）的決定基，則針對一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應(yīng)。 結(jié)合價： 天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個抗體分子結(jié)合，為多價。單體形式的抗體分子有兩個Fab段，能結(jié)合兩個相同的抗原決定基，為兩價。前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone) Ab過剩和Ag過剩（二）抗原-抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)Ab過剩和Ag過剩比例合適： 若抗原、抗體的數(shù)量比例合適，抗體分子的兩個Fab段分別與兩個抗原決定基結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體，則反應(yīng)體系中

4、基本不存在游離的抗原或抗體，此時形成肉眼可見的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。因此，確定反應(yīng)體系中抗原、抗體的最適比例十分重要?？乖?抗體反應(yīng)為分子表面的非共價結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體復(fù)合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學(xué)活性。根據(jù)此特點，可借助親和層析法純化抗原或抗體。（三）可逆性（一）電解質(zhì) 抗原和抗體有對應(yīng)的極性基團，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷?。電解質(zhì)的存在使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)，故免疫學(xué)試驗中多用生理鹽水稀釋抗原或抗體。二、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素（二）酸堿度 抗原抗體反應(yīng)的最適pH是6-

5、8。（三）溫度最適溫度為37。有些例外，如冷凝集素在 4左右與紅細胞結(jié)合最好，20以上反而解離。 （四）抗原和抗體的性質(zhì) 抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素。 此外，抗原理化性質(zhì)、抗原決定基多寡和種類等均可影響抗原-抗體反應(yīng)。 抗體分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合能力親和力(affinity)一個抗體分子與整個抗原分子間的結(jié)合強度親合力(avidity) 根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素分類：（一）凝集反應(yīng)（二）沉淀反應(yīng)（三）補體參加的反應(yīng)（四）免疫標(biāo)記技術(shù)三、Ag-Ab反應(yīng)的基本檢測方法顆粒性抗原（細菌或細胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下

6、，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)(agglutination) 。 （一）凝集反應(yīng)（Agglutination Tests）1直接凝集（direct agglutination) ： 細菌或紅細胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，可出現(xiàn)細菌或紅細胞凝集現(xiàn)象。2間接凝集（indirect or passive agglutination) ：檢測針對可溶性Ag的Ab3間接凝集抑制試驗 (direct agglutination inhibition test)4. 協(xié)同凝集試驗（co-agglutination test）1直接凝集YYY+Qualitative agglutination test（定性

7、凝集實驗）Ag or Ab Applications Blood typing（血型測定） Bacterial infections（細菌性感染） Practical considerations Easy（簡便） Semi-quantitative（半定量）2、間接凝集Definition - agglutination test done with a soluble antigen coated onto a particleApplicationsMeasurement of antibodies to soluble antigensYYY+3、間接凝集抑制試驗應(yīng)用：可用于檢測抗原或

8、抗體（如早孕的檢測），其 靈敏度高于一般間接凝集試驗。各種凝集反應(yīng)示意圖Ag-Ab反應(yīng)的基本檢測方法（一）凝集反應(yīng)（二）沉淀反應(yīng)（三）補體參加的反應(yīng)（四）免疫標(biāo)記技術(shù)Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細菌濾液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的現(xiàn)象稱為沉淀反應(yīng)。該反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進行瓊脂擴散或免疫擴散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀。（二）沉淀反應(yīng)（Precipitation Tests）1單向免疫擴散(single immunodiffusion)2雙向免疫擴散(double immunodiffu

9、sion)3免疫電泳(immunoelectrophoresis)4免疫比濁(immunonephelometry) （二）沉淀反應(yīng)單向免疫擴散(single immunodiffusion)雙向免疫擴散(double immunodiffusion) 單擴與雙擴原理Ag-Ab反應(yīng)的基本檢測方法（一）凝集反應(yīng)（二）沉淀反應(yīng)（三）補體參加的反應(yīng)（四）免疫標(biāo)記技術(shù)用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，進行抗原-抗體反應(yīng)的檢測，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點。（四）免疫標(biāo)記技術(shù)（I

10、mmunolabelling technique） 此法乃用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對抗原進行定性或定位。 1免疫熒光法(immunofluorescence,IF)（1）直接熒光法：熒光素直接標(biāo)記抗體，對標(biāo)本進行檢測。該法優(yōu)點是特異性高，缺點是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進行檢測。該法優(yōu)點是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢測,但非特異性反應(yīng)亦增強。免疫熒光法分類免疫熒光法圖示Mouse kidney sectionLa

11、minin - green-fluorescent Qdot 565 IgG CD31- red-fluorescent Qdot 655 IgG Nuclei - blue-fluorescent Hoechst 33342ControlTSLPTSLP - AlexaFluor 488 Nuclei - propidium iodide HASMC 此法將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。應(yīng)用酶標(biāo)測定儀測定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達ng/ml甚至pg/ml水平。常見的標(biāo)記物為：辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP） 酶

12、免疫測定(enzyme immunoassay, EIA)常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) （2）免疫細胞或組織化學(xué)（immunocytochemistry or immunohistochemistry,ICC or IHC)1） ELISA是酶免疫測定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測定可溶性抗原或抗體。優(yōu)點：靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性強，可自動化檢測，從而被廣泛用于檢測多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細胞因子等。雙抗體夾心法：用于檢測特異性抗原。該試驗所用的包被抗體與酶標(biāo)抗體應(yīng)分別針對不同

13、抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應(yīng)無交叉反應(yīng)。間接法：用于檢測特異性抗體。用已知抗原包被固相，加入待檢血清標(biāo)本，再加酶標(biāo)記的二抗，加底物觀察顯色反應(yīng)。ELISA分類間接法圖示ELISA反應(yīng)過程動畫演示2)酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)生物素（biotin）是廣泛分布于動、植物體內(nèi)的一種生長因子，又稱輔酶R或維生素H。親和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一種蛋白質(zhì)，由4個亞單位組成。生物素與親和素間具有高度親和力，且均能偶聯(lián)抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響其生物學(xué)活性。3）BAS（biotin avidin system)-ELISA：BAS-ELISA 應(yīng)用酶標(biāo)記的抗

14、體與組織或細胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對組織或細胞表面抗原進行定性、定量、定位。4）免疫細胞或免疫組化技術(shù)ICCIHC 乃用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進行免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測靈敏度達pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。 該法常用于測定微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。 3放射免疫測定法(radioimmunoassay, RIA)化學(xué)發(fā)光免疫分析 將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分

15、析儀測定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。 該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。 該法又稱Western印跡法，其結(jié)合凝膠電泳與固相免疫技術(shù)，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體，再應(yīng)用酶免疫、放射免疫等技術(shù)進行檢測。 該法能對分子大小不同的蛋白質(zhì)進行分離并確定其分子量，常用于檢測多種病毒抗體或抗原。免疫印跡法(immunoblotting)免疫印跡法第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法第二節(jié)免疫細胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第四節(jié) 免疫學(xué)預(yù)防 一、 淋巴細胞及亞群的分離外周血單個核細胞(PBMC)的分離：葡聚糖泛影葡胺（即淋巴細胞分離液）密度梯度離心法淋巴細

16、胞亞群的分離 淋巴細胞為不均一的群體，可借助其表面標(biāo)志及功能差異而分為不同的群和亞群。 1尼龍棉分離法 2E花環(huán)分離法 3洗淘法 4流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM) 5磁珠分離技術(shù)E花環(huán)實驗磁珠分選Removal of T cells from marrow graft MagnetMagnetic antibodies二、免疫細胞功能的測定 1. T細胞功能測定：(1) 細胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗： 可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。 * 絲裂原主要有PHA、Con A和PWM； * 抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素、PPD和白色念珠菌等；淋巴細胞增殖實驗(2) T細胞介導(dǎo)的細胞毒試

17、驗：CTL (1) B細胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗 (2) 溶血空斑形成試驗 (3) 酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT): 2. B細胞功能判定溶血空斑實驗第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法第二節(jié)免疫細胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第四節(jié) 免疫學(xué)預(yù)防 在體外用已知抗原檢測相應(yīng)抗體：見前述 用已知抗體對各類免疫球蛋白作定性、定量測定：檢測血清含量高的IgG、IgA和IgM時，可用免疫比濁法；檢測IgD和IgE選用ELISA、RIA等靈敏度高的方法。診斷免疫球蛋白異常性疾?。ㄈ绻撬枇?、性聯(lián)無丙種球蛋白血癥等），可用免疫電泳等方法。一、免疫球蛋白的測定 了解體內(nèi)補體激活狀況，輔助有關(guān)疾病的診斷。對血清含量高的C

18、3、C4、B因子等，可用免疫比濁法，其他含量低的成分則借助ELISA、RIA等方法。血清總補體活性測定常采用50%補體溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作為抗原抗體復(fù)合物，通過經(jīng)典途徑激活待檢血清中的補體，導(dǎo)致SRBC溶解。若待檢血清補體含量減少或成分缺失，則影響溶血結(jié)果。二、補體測定（一）免疫學(xué)測定法以細胞因子作為抗原，用相應(yīng)抗體進行定量或半定量檢測。對于分泌性細胞因子，常用方法為雙抗體夾心法ELISA、RIA、ELISPOT、免疫印跡法等方法檢測。對于胞內(nèi)細胞因子，采用FCM免疫熒光技術(shù)檢測三、細胞因子（CKs）檢測（二）生物活性測定法根據(jù)細胞因子特定的生物學(xué)活性，借助

19、相應(yīng)指示系統(tǒng)，如選用各種依賴性細胞株或靶細胞，同時與標(biāo)準(zhǔn)品對照測定，從而得知樣品中細胞因子活性水平，一般以活性單位（U/ml）表示。 （三）分子生物學(xué)測定法具體方法為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實時定量PCR等。 第一節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法第二節(jié)免疫細胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第四節(jié) 免疫學(xué)預(yù)防一、免疫學(xué)預(yù)防 免疫學(xué)預(yù)防（immunoprophylaxis）是指通過人工刺激機體產(chǎn)生或直接輸入免疫活性物質(zhì)，從而特異性清除致病因子，達到預(yù)防疾病的目的。免疫包括：先天免疫：生物體在長期種系發(fā)育和進化中逐漸形成的一系列防衛(wèi)機制。特異性免疫：個體在生命過程中接受抗原刺激后主動產(chǎn)生或被動獲得的。特異

20、性免疫獲得方式有兩種： 1、自然免疫（natural immunization) 自然主動免疫：指機體受到各種病原體隱性或顯性感染后主動產(chǎn)生的特異性免疫。自然被動免疫：指機體經(jīng)胎盤或初乳被動獲得的特異性免疫。2、人工免疫（artificial immunization） 即免疫學(xué)預(yù)防，指采用人工方法，將疫苗、類毒素或含特異性抗體和細胞的免疫制劑接種于人體，以增強宿主的抗病能力。人工主動免疫人工被動免疫人工主動免疫(artificial active immunization)：指給機體接種抗原性物質(zhì)如疫苗、類毒素等，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫力的方法。人工被動免疫(artificial p

21、assive immunization)：指給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細胞因子等制劑,使受者迅速獲得特異性免疫力的方法。 人工自動免疫與人工被動免疫的比較人工自動免疫人工被動免疫產(chǎn)生免疫力的物質(zhì)抗原（疫苗、類毒素、瘤苗等）抗體、活化的淋巴細胞、細胞因子等發(fā)揮作用的潛伏期較長，約24周短，無需誘導(dǎo)期、立即發(fā)揮作用免疫力維持時間較長，約半年數(shù)年較短，數(shù)周數(shù)月主要用途預(yù)防傳染性疾病治療腫瘤傳染性疾病的治療或緊急預(yù)防，調(diào)節(jié)機體免疫功能，治療腫瘤人工主動免疫的接種物疫苗（Vaccine）：細菌，病毒，螺旋體，立克次體和類毒素等抗原性生物制品統(tǒng)稱為疫苗。理想疫苗的標(biāo)準(zhǔn)：安全；有效；實用 分類： 1、死疫苗（death vaccine）:選用免疫原性強的微生物標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)大量培養(yǎng)后，用物理或化學(xué)方法將其殺死或滅活而制成的預(yù)防制劑。如霍亂、百日咳、傷寒、鉤端螺旋體疫苗。 優(yōu)點：主要誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，安全 缺點：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反應(yīng)嚴(yán)重2、減毒活疫苗（live-attenuated Vaccine）用人工定向變異或從自然界篩選得到的毒力高度減弱或基本無毒的病原微生物制成的預(yù)防制劑。優(yōu)點：一次免疫即可獲得長久免疫力，類似自然狀態(tài)下的輕型或隱性感染。誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫。缺點：不易保存，存在回復(fù)突變的危險如卡介苗，牛痘，麻疹等死疫苗