植物微生態(tài)制劑發(fā)酵工藝及其質(zhì)量控制

1、植物微生態(tài)制劑發(fā)酵工藝及其質(zhì)量控制TheFermentationProcessandQualityControlofVegetableMicro ecologyPreparationMU Yan-kui1HE Juan2ZHOU Zheng1*ZHOU Wei1WU Tao1(1 Hebei Institute of Food Quality Supervistion Inspection and Research,Shijiazhuang Hebei 050051; 2 Hebei Zhongrun Pharmaceutical Company Limited)As a method of

2、effectively controlling continuous cropping obstacles of protected vegetable,the vegetable microecological preparation with the characters of wide effect,low cost,little residual contamination and so on,widely concerned by the world,it has become a hot spot in research and development. But Because o

3、f the backward in fermentation process level and the imperfections in market supervision system nowadays,the development industry about vegetable microecologicalpreparation has been limited.In view of the fermentation technology and the production quality control of producing vegetable microecologic

4、al preparation,the present situation,existing problems and coutermeasures about the industry of vegetable microealogy preparation at present in China were expounded.微生物活菌制劑又稱微生態(tài)制劑 , 是從人類、動物、植物體 內(nèi)分離的有益微生物經(jīng)特殊工藝制成的只含活菌或包含活菌及 其代謝產(chǎn)物的制劑 1 。有益微生物通過作用于生物體表或體內(nèi) , 調(diào)節(jié)生物體固有微生物的比重和平衡 , 從而達(dá)到保健、增產(chǎn)和改 良品質(zhì)等作用 2 。微生態(tài)制劑

5、以其無副作用、無殘留污染、不 產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點 , 逐步成為世界各國研究與開發(fā)的熱點。 1986 年, 我國陳延熙教授 3 首次提出“植物微生態(tài)學(xué)”概念 ,為應(yīng)用 微生態(tài)防治植物病害奠定了基礎(chǔ)。 1992 年克洛珀 4 提出了“植 物內(nèi)生細(xì)菌” (Endophyticbacteria) 概念 , 進(jìn)一步促進(jìn)了植物微 生態(tài)研究與應(yīng)用的發(fā)展。目前 , 國內(nèi)外已經(jīng)研制出一批效果顯著 的植物微生態(tài)制劑 , 應(yīng)用的微生物菌種涉及假單胞菌、 芽孢桿菌、 鏈霉菌、木霉等屬、熒光假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿 菌以及海洋放線菌 M9、海洋芽抱桿菌等 20多種5-10。植物微生態(tài)制劑主要通過功能微生物的生物

6、占位、生物拮 抗、免疫激活等機制達(dá)到控制病害的目的 , 因此活菌數(shù)量和功能 代謝產(chǎn)物的效價是影響微生態(tài)制劑應(yīng)用效果的關(guān)鍵。 而發(fā)酵工藝 則是制約產(chǎn)品質(zhì)量、使用效果和成本的關(guān)鍵, 該文就植物微生態(tài)制劑發(fā)酵工藝及其質(zhì)量控制的現(xiàn)狀、 存在的問題和解決途徑進(jìn)行 探討。生產(chǎn)工藝傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝目前, 微生態(tài)制劑的生產(chǎn)主要包括液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵種工藝 11 。液體發(fā)酵工藝。液體發(fā)酵工藝一般采用傳統(tǒng)的液體發(fā)酵 罐進(jìn)行深層液體培養(yǎng) ,發(fā)酵好的菌液直接裝瓶作為成品 , 或經(jīng)過 濃縮、吸附、干燥制得固體菌劑 , 采用可濕性吸附劑可制成可濕 性粉劑。因液體深層發(fā)酵工藝和設(shè)備已經(jīng)十分成熟 , 根據(jù)發(fā)酵微 生物的生物學(xué)

7、特點和發(fā)酵特性 , 可方便獲得較為理想的發(fā)酵工 藝。液體深層發(fā)酵具有染菌機會小、易于規(guī)?；a(chǎn)等特點。但 是用于活體微生物制劑的發(fā)酵生產(chǎn) , 如果直接制成液體制劑 , 具 有不宜儲運、貨架期短、難以規(guī)模推廣等缺點。工業(yè)生產(chǎn)上曾嘗 試?yán)靡后w發(fā)酵生產(chǎn)芽生孢子 , 而研究表明 , 芽生孢子活力低、 不 耐貯藏,難以應(yīng)用于實際 12 。如果制備固體制劑 , 則工藝繁瑣 , 生產(chǎn)成本高 , 廢液排放污染環(huán)境。固體發(fā)酵工藝。固體發(fā)酵是指利用自然底物做碳源及能 源, 或利用惰性底物做固體支持物 ,其體系無水或接近于無水的 發(fā)酵過程 13 。固體發(fā)酵過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可作為制劑組分應(yīng) 用, 不僅減少了廢物排

8、放 ,還可提高產(chǎn)品的使用效果 ; 而且固體發(fā) 酵的孢子特性明顯好于液體深層發(fā)酵的孢子 , 對干旱條件更具抗 性, 在干燥的環(huán)境中更穩(wěn)定。但缺點是易污染、產(chǎn)量低、難以規(guī) ?；a(chǎn) , 僅適用于好氣微生物的發(fā)酵生產(chǎn)。為克服固體發(fā)酵工 藝的弊端 ,國內(nèi)外已開始注重固態(tài)生物反應(yīng)器的研究與開發(fā) , 在 小規(guī)模發(fā)酵罐研制方面已取得突破并進(jìn)行商業(yè)化運作 , 這為農(nóng)用 微生態(tài)制劑、 酶制劑、 發(fā)酵飼料等的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化開發(fā)帶來了 曙光。新型生產(chǎn)工藝液固兩相發(fā)酵工藝。首先采用液體深層發(fā)酵工藝快速生 產(chǎn)出大量菌絲或孢子 , 再接種到密閉固體發(fā)酵罐中進(jìn)行固體發(fā)酵 使菌體在近自然環(huán)境狀態(tài)中生長、 產(chǎn)孢 14 。發(fā)酵產(chǎn)

9、物經(jīng)低溫干 燥、粉碎 , 即得到成品。該項工藝結(jié)合了液體深層發(fā)酵和固態(tài)發(fā) 酵,充分發(fā)揮了兩者的長處 , 又避免了兩者的缺點。 這種密閉接種 方法不易染菌 ,質(zhì)量穩(wěn)定 ,生產(chǎn)上便于管理 ,且種子培養(yǎng)周期短 , 發(fā)酵產(chǎn)物活力高。 這種工藝的技術(shù)難點在于液體種子與固體培養(yǎng) 基的銜接 , 需通過試驗將液、固培養(yǎng)基和液、固培養(yǎng)條件合理銜 接, 以達(dá)到最佳效果。筆者以鏈霉菌S506為菌種，將液-固結(jié)合發(fā)酵與傳統(tǒng)固體發(fā) 酵進(jìn)行比較 , 結(jié)果表明 : 種子制備時間縮短了 72 h, 且菌體濃度達(dá) 到98億cfu/mL;在固體培養(yǎng)基中加入增效物質(zhì)M后，發(fā)酵延滯期較短,且發(fā)酵周期大幅度縮短 ,產(chǎn)物活菌濃度可達(dá)到

10、100億 cfu/g 以上 15 。分段培養(yǎng)。 最佳的工藝條件對菌體量和芽孢的生產(chǎn)是 不同的。在菌體生長階段采用如補料發(fā)酵等高密度的培養(yǎng)方法可 提高菌群密度。采用 2階段策略,在第 1階段處于菌體量生產(chǎn)的 最佳環(huán)境中 , 刺激產(chǎn)生更多的菌體 ; 第 2 階段 , 在有助于芽孢形成的最佳操作條件下形成芽孢。 通過采用這種策略和最佳的實驗條 件，菌體（Bacillus coagulans RK-02）增加了大約 55%,芽抱在干菌體中達(dá)到 101 000 億 cfu/g16 。（3）對復(fù)合菌株的產(chǎn)品 , 通過正交試驗確定最佳配比。 將各菌 株設(shè)不同比例 , 按正交試驗表進(jìn)行組合 , 然后用試驗檢驗

11、效果。（4）采用細(xì)胞生物量的檢測。目前國外許多微生態(tài)制劑己廣 泛采用快速菌檢技術(shù)-生物發(fā)光分析,利用菌種體內(nèi)ATP與熒光 素酶反應(yīng)發(fā)光，其光強與ATP含量成比例，通過光強測定來確定 菌種數(shù)量。2 植物微生態(tài)制劑的質(zhì)量控制生產(chǎn)植物微生態(tài)制劑的過程中 , 應(yīng)嚴(yán)格遵守國家標(biāo)準(zhǔn) , 如有 效活菌數(shù)1億cfu/g（固體制劑）或2億cfu/mL（液體制劑）； 霉菌雜菌數(shù)w 300萬cfu/g（固體制劑）或w 300萬cfu/mL（液體制 劑）；保質(zhì)期6個月（固體制劑）或3個月（液體制劑）等。為了 保證制劑的質(zhì)量 , 生產(chǎn)中要注意以下幾個方面 :2.1 篩選優(yōu)良菌株菌種 （ 株） 是維系微生態(tài)制劑生命力的關(guān)

12、鍵因素, 是微生態(tài)制劑的質(zhì)量保證 , 是品質(zhì)控制中最重要的指標(biāo)。優(yōu)良的菌種應(yīng)具備 3個條件 : 一是微生態(tài)制劑產(chǎn)品應(yīng)標(biāo)明所用菌種的所屬、種名和 菌號等 17; 二是對植物無毒副作用 , 對土壤不污染 ; 三是菌種具 有較穩(wěn)定的生物學(xué)、遺傳學(xué)特征 , 在使用和貯存期間應(yīng)保持穩(wěn)定 和活菌狀態(tài)。發(fā)酵工藝最佳化 活菌濃度是評定產(chǎn)品質(zhì)量的一個關(guān)鍵指標(biāo)。目前 , 我國微生 態(tài)制劑行業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品存在有效活菌濃度低、 雜菌率偏高、 有效 期短等諸多問題 , 嚴(yán)重影響了市場的開拓和農(nóng)民使用的積極性。 還有些產(chǎn)品雖然開始有較高的活菌數(shù) , 但由于產(chǎn)品中休眠體少 , 致使產(chǎn)品質(zhì)量迅速下降 , 影響使用效果。這就要求

13、在培養(yǎng)過程中 要通過工藝和配方的優(yōu)化 , 獲得較高的產(chǎn)孢率。如選取合適的碳 源,降低發(fā)酵培養(yǎng)基中的有機氮源含量 ,添加適量的 Mn2+18, 將 芽孢接種到培養(yǎng)基中活化培養(yǎng) , 使之得到有效地提純和復(fù)壯 19 。這些對提高菌數(shù)和產(chǎn)孢率均有顯著的影響。 對于不產(chǎn)芽孢 和孢子的菌種 ,要采用合適的載體或保護(hù)劑 ,以保存有效活菌 , 延 長保存期。吳皓瓊等 20 研究表明 ,用糖蜜、麩皮等作為保護(hù)劑 , 對活菌保存有顯著效果 , 且成本低 , 使用方便 , 適宜在生產(chǎn)中應(yīng) 用。產(chǎn)品質(zhì)量檢測與監(jiān)督 目前的植物微生態(tài)制劑檢驗標(biāo)準(zhǔn)中一般包括活菌數(shù)測定、 雜 菌檢查和安全試驗等。 活菌數(shù)檢測常采用血細(xì)胞計數(shù)

14、板計數(shù)的方 法, 這種方法快捷、簡單 ,但無法排除死細(xì)胞的干擾 ; 雜菌檢查要 求嚴(yán)格無菌以防再污染 , 給檢測帶來了不便 ;有的安全試驗需要 較長時間 , 因此開發(fā)出便捷、可靠的質(zhì)量檢測方法迫在眉睫。另 外,目前市售的品種沒有統(tǒng)一的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn) , 同一項目規(guī)格單 位的表示方法不統(tǒng)一 , 所以應(yīng)盡快規(guī)范植物微生態(tài)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。存在的問題植物微生態(tài)制劑雖然有很多的優(yōu)點 , 但在實際生產(chǎn)和應(yīng)用中 仍存在以下問題 :生產(chǎn)條件和生產(chǎn)工藝落后 ,產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。 相當(dāng)多的生 產(chǎn)微生態(tài)制劑的廠家雖具備了基本生產(chǎn)設(shè)備和條件 , 但需改進(jìn)的 地方還很多 , 如攪拌設(shè)備簡陋 ,干燥、造粒、原材料滅菌等達(dá)不到

15、 微生物學(xué)要求。生產(chǎn)微生態(tài)制劑的原料質(zhì)量不穩(wěn)定。以液體發(fā)酵工藝的 吸附材料草炭為例 ,草炭產(chǎn)量大 ,但由于草炭加工技術(shù)落后和草 炭顆粒過大 , 限制了微生態(tài)制劑質(zhì)量的提高?；罹苿┰谏a(chǎn)、 加工、運輸過程中極易失活 , 降低了生 物活性?；罹M(jìn)入植物根系微生態(tài)環(huán)境后 , 受各種環(huán)境條件的制 約, 不宜生長和定植 ,致使使用效果不穩(wěn)定。國家法規(guī)不健全 , 市場混亂。有些廠家將少量發(fā)酵的微生 物摻到大量的化肥或其他營養(yǎng)基質(zhì)中 , 再以“微生態(tài)制劑”的名 義進(jìn)入市場推廣應(yīng)用 , 對判定起主要作用的物質(zhì)沒有做深入的試 驗,無可靠的證據(jù)驗證 , 嚴(yán)重?fù)p害了農(nóng)民的利益。解決對策 微生態(tài)制劑具有低投入、高產(chǎn)出、高質(zhì)量、高效益、無污染 等優(yōu)點 , 非常符合現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。如何使微生態(tài)制劑更好的發(fā)揮功效成為現(xiàn)今的熱點話題。 針對現(xiàn)存問 題 , 在未來的生產(chǎn)和研究中應(yīng)該著重做到以下幾個方面。(1) 加強微生態(tài)制劑應(yīng)用的基礎(chǔ)研究。 多年來 , 國外許多學(xué)者 在諸如微生物和寄主間的關(guān)系、 品種專性和廣譜性機制、 制品中 微生物進(jìn)入土壤后的制約因素等方面進(jìn)行了大量的研究。 在特定 微生物進(jìn)人