2015-2016生物藥物分離純化技術實驗指導

1、實驗一蔗糖密度梯度離心分離實驗一、實驗目的熟悉蔗糖密度梯度離心原理熟練掌握蔗糖密度梯度離心操作技術二、實驗原理溶液的密度自上而下逐漸變化的分布狀態(tài)稱為密度梯度。在超速離心技術中，樣品的密度應該分布在溶液的密度梯度范圍內(nèi)。三、材料、試劑及儀器1.試劑20%、40%、60%、80%的蔗糖溶液；墨汁。2.儀器燒杯，普通離心機，試管若干。四、實驗步驟梯度液的制備（1）制備出不同濃度的蔗糖溶液，濃度間隔相同，分別是濃度為20%、40%、60%、80%的蔗糖溶液。（2）每個濃度量取相同的體積，按濃度依次減小的順序逐個緩慢鋪入離心管中，制成不連續(xù)階梯密度梯度。（3）此離心管在20-25靜止2-3h，通過重力

2、作用即成接近線性的蔗糖密度梯度液。若用細鐵絲輕敲離心管，靜置時間可以縮短至0.5-lh。溫度低時所需靜置的時間較長,溫度高的時候則較短。為減少對流，靜置后應將離心管置于冰浴中備用。蔗糖密度梯度離心向已形成密度梯度的離心管中加入半滴墨汁，加入離心管中離心,3000r/min離心10min,觀察實驗現(xiàn)象。五、結果與分析蔗糖密度梯度離心和差速離心有什么區(qū)別？實驗二雙水相相圖的制備一、實驗目的了解雙水相萃取的原理和發(fā)展歷史、趨勢掌握用濁點法制作雙水相系統(tǒng)相圖的方法二、實驗原理某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可形成兩相，并且在兩相中水分占很大比例，即形成雙水相。常見的雙水相系統(tǒng)可分為兩類，即

3、雙聚合物體系和聚合物鹽體系。雙水相形成的條件和定量關系可用相圖來表示，它是研究雙水相萃取的基礎。相圖是一根雙節(jié)線，當成相組分的配比在曲線的下方時，|,系統(tǒng)為均勻的單相，混合后溶液澄清透明，稱為均相區(qū)；當配比在曲線的上方時，能自動分成兩相，稱為兩相區(qū)；若配比在曲線上,混合后，溶液恰好由澄清變?yōu)闇啙?。連接雙節(jié)線上的兩點的直線稱為系線，它由三點確定，即M(初始混合物組成情況)、T(上相組成情況)、B(下相組成情況)，其中T/B互為共扼相。系線越長，兩相間的差別越大，當系線長度趨向零時，兩相差別消失。系線上系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同體積不同的兩相，兩相體積服從杠桿規(guī)則：VT/VB=BM/MT三

4、、材料、試劑及儀器1試劑PEG400；硫酸銨。2儀器漩渦振蕩器、微量滴管裝置、電子天平。四、實驗步驟雙水相系統(tǒng)的制作精確配制43%(g/ml)的(NH)SO溶液，并測定其密度。2精確稱取PEG400液體0.7g于試管中，按表格中所列第一號數(shù)據(jù)，用吸管加入0.5毫升水，緩慢滴加已配制好的(NH)S0溶液，并在混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直2至試管內(nèi)溶液開始出現(xiàn)渾濁為止，記錄(NH)S0的加入量，根據(jù)密度求出重量。2按下表列出的第2號數(shù)據(jù)加入水，使其澄清，繼續(xù)向試管中滴加(NH)S0溶液，2使其再次達到渾濁。如此反復操作，計算每次達到渾濁時PEG400和(NH)S0在系統(tǒng)總量中2的百分含量。

5、序加水量加(NH)S0純(NH)S0純(NH)S0溶液累計PEG400(NH)S0號(ml)溶液量（ml）新增量（g）累積量（g）總量（ml）重量百分比重量百分比1234567相圖的繪制以PEG400的重量百分比濃度為縱坐標，（NH）S0的重量百分比濃度為橫坐標作圖，即424得到一條雙節(jié)線的相圖。五、注意事項微量滴定管在使用前必須先洗滌干凈，否則容易產(chǎn)生氣泡或發(fā)生堵塞現(xiàn)象。洗滌時，不用去污粉，可用鉻酸洗液或洗滌液先浸泡一段時間后，用一根細長的刻度移液管刷刷洗刻度處，最后用蒸餾水反復沖洗數(shù)次。清洗干凈的微量滴定管必須先用蒸餾水試漏，如有漏液，可涂少量凡士林（過量的凡士林會堵塞滴定管）。試漏成功的

6、滴定管要潤洗兩次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗滌兩遍。由于支管拐彎處易藏氣泡，一般待滴定液放滿刻度管后打開支管旋塞用洗耳球?qū)⑷芤褐袣馀輨偤么等胭A液杯中即可，也可緩慢傾斜滴定管使氣泡從口部溢出。4滴定過程要注意愛護儀器，輕拿輕放。用（NH）SO4滴定時，在接近滴定終點左右時42一定要每滴一滴，便徹底混勻后方可滴定下一滴。六、思考問題雙水相萃取中相圖有何意義？雙水相萃取在分離生物大分子物質(zhì)時有何意義？實驗三牛血清蛋白在雙水相萃取系統(tǒng)中的分配一、實驗目的了解雙水相萃取的原理和方法雙水相系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)的操作二、實驗原理某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可形成兩相，并且在兩相中水

7、分占很大比例，即形成雙水相。常見的雙水相系統(tǒng)可分為兩類，即雙聚合物體系和聚合物/鹽體系。雙水相形成的條件和定量關系可用相圖來表示，它是研究雙水相萃取的基礎。雙縮脲反應是指蛋白質(zhì)在堿性溶液中與而家銅離子結合生成紫色絡合物的反應，雙鎖尿是由兩分子尿素縮合而成的化合物在堿性溶液中與硫酸銅反應生成紫紅和絡合物。因此具有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物都有雙縮脲反應，其顏色深淺和蛋白質(zhì)含量成正比?？衫么朔磻M行蛋白質(zhì)定性鑒別材料、試劑及儀器1、材料牛血清蛋白2.試劑Peg6000、硫酸銨、硫酸銅、酒石酸鈉鉀、氫氧化鈉、蒸餾水。2.儀器離心機、離心管、燒杯、玻璃棒、量筒、天平。四、實驗步驟雙水相系統(tǒng)的制作配

8、制牛血清蛋白溶液：lg/L配制高濃度的聚合物和鹽溶液母液：PEG6000,400g/L、硫酸銨400g/L各20ml。配制相應的高聚合物子液(60g/L,100g/L,140g/D和鹽的子液(140g/L,140g/L，140g/L)各4ml將高聚合物子液和鹽的子液轉(zhuǎn)到10ml離心管中，加入牛血清蛋白2ml,共三組。離心管封口后，反復倒置5-10min,6-10次/分鐘。使充分混合。1500R/min下離心3-5min后，觀察情況。小心吸取目標物，加入雙縮脲試劑進行定性鑒定。五、注意事項離心前，必須配平。由于支管拐彎處易藏氣泡，一般待滴定液放滿刻度管后打開支管旋塞用洗耳球?qū)⑷芤褐袣馀輨偤么等胭A

9、液杯中即可，也可緩慢傾斜滴定管使氣泡從口部溢出。4滴定過程要注意愛護儀器，輕拿輕放。用(NR04滴定時，在接近滴定終點左右時一定要每滴一滴，便徹底混勻后方可滴定下一滴。六、思考問題1雙水相萃取蛋白的優(yōu)點。2雙水相萃取成相的影響因素有哪些？實驗四機械剪切法細胞破碎實驗及PPO的粗提一、實驗目的熟悉細胞破碎的基本方法2.熟練掌握機械破碎法操作技術二、實驗原理細胞破碎技術(包括機械破碎法：搗碎法、珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法；非機械破碎法：凍結-融化法、滲透壓沖擊法、有機溶劑法、表面活性劑法、酸堿法、酶溶法)是提取分離生物藥物的一個基本技術，是一項必須掌握的基本技能)。三、材料、試劑及儀器1.材

10、料：土豆2.試劑O.lmol/L的NaF溶液(4.2gNaF溶于1000ml水中)；0.1mol/L的鄰苯二酚溶液(l.lg鄰苯二酚溶于1000ml水中，用稀NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為6.0)。3.儀器家用勻漿機，燒杯，布氏漏斗，抽濾瓶，量筒，容量瓶，普通離心機，水浴鍋，不銹鋼鍋。四、實驗步驟酶抽提物的制備(1)拿一塊土豆，洗去上面的泥土；(2)去土豆皮后切成小塊；稱取50g土豆塊放入勻漿機中，再加入50ml氟化鈉溶液；在勻漿器中研磨30s；把勻漿物通過幾層細布濾到一個100ml的燒杯中；加入等體積的飽和硫酸銨溶液(70g硫酸銨溶于100ml水，加熱到70-80使其溶解，冷卻到室溫后過濾，即得飽和

11、硫酸銨溶液)，混合后于4C放置30min；在4000r/min下離心15min,倒掉上清液；將沉淀物用大約15ml檸檬酸緩沖液(pH=5.6，將0.1mol/L的A液檸檬酸和0.1mol/L的B液檸檬酸三鈉按5.5：14.5的比例混合)，既得該酶粗制品。多酚氧化酶的顏色反應將3只干凈的試管編號為1、2、3.按下面的要求制備各管：管號酶抽提液水鄰苯二酚(0.01mol/L)混合均勻115滴15滴215滴15滴315滴15滴(3)把三只試管放于37C水浴(4)每隔5min震蕩試管并觀察每管中溶液顏色的變化，共反應25min。(5)觀察現(xiàn)象，記錄實驗結果。五、結果與討論(1)記錄以上實驗過程每一步驟

12、的現(xiàn)象，并對現(xiàn)象所說明的問題進行分析。(2)本實驗中加入硫酸銨的目的是什么？(3)預測試管1、2、3的現(xiàn)象，并說明預測的依據(jù)。實驗五：高壓勻漿法、珠磨法細胞破碎技術一、實驗目的：細胞破碎技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術，是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)(產(chǎn)品)的基礎。目前已發(fā)展了多種細胞破碎方法，以便適應不同用途和不同類型的細胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機械法和非機械法兩大類。機械破碎主要的方法有珠磨法、高壓勻漿法、超聲波等方法。本實驗主要介紹高壓勻漿法、珠磨法的介紹和使用。二、實驗原理：1高壓勻漿法是大規(guī)模破碎細胞的常用方法，作用機理是液體剪

13、切作用，利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破碎，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。1.1高壓勻漿機工作原理及工作示意圖高壓勻漿器是常用的設備，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵和排出閥組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。細胞漿液通過止逆閥進入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速沖擊，使細胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多次

14、循環(huán)通過等方式，也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可在進口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20C左右。在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。1.2高壓勻漿破大腸桿菌菌體濃度150gXL-1左右(目標蛋白表達量為20%)用去離子水懸浮，在80MPa壓力下，連續(xù)高壓勻漿三次。影響高壓勻漿破碎的因素主要有壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)，工業(yè)生產(chǎn)中常采用的壓力為5570Mpa。高壓勻漿法操作參數(shù)少，且易于確定；且樣品損失量少，在間歇處理少量樣品方面效果好，在實驗室和工業(yè)生產(chǎn)中都已得到應用，適用于酵母和大多數(shù)細胞的破碎。對于易造成堵塞的團狀

15、或絲狀真菌以及一些易損傷勻漿閥，質(zhì)地堅硬的亞細胞器一般不適用。2、珠磨法：設備是珠后機，其破碎機理：微生物細胞懸浮液與極細的研磨劑在攪拌漿作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細胞之間和互相剪切、碰撞，促使細胞壁破碎，釋出內(nèi)含物，在珠波分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實現(xiàn)連續(xù)操作破碎中，生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。存在的問題：操作參數(shù)多，一般賃經(jīng)驗估計并且珠子之間的液體損失30左右。三、實驗操作兩種機器的使用過程及步驟。實驗六紅霉素的萃取與精制一、實驗目的（1）學會利用溶劑萃取的方法對微生物藥物的原理與方法進行提純；（2）掌握利用提取紅霉素的步驟和操作要求。二、實驗原理萃取過

16、程是利用混合物質(zhì)各種組分在兩個不相混溶的液相中的溶解度的不同，從而達到分離的目的。紅霉素在堿性條件下，溶于乙酸乙酯中，在酸性條件下溶于水溶液中給，通過這個原理達到分離提純的目的。三、試劑及儀器1.材料2g紅霉素軟膏。2、器材量杯、燒杯、布氏漏斗及抽濾瓶、培養(yǎng)皿、分液漏斗、鐵架臺、剪刀、烘箱等。2.試劑乙酸、乙酸乙酯、飽和食鹽水、異丙醇、乙醇-醋酸鉀溶液（10g醋酸鉀溶于100ml無水乙醇中，現(xiàn)用現(xiàn)配）四、實驗步驟（一）取2g紅霉素軟膏，放入燒杯中，加6ml乙酸丁酯,用乙酸或乙酸丁酯調(diào)pH值為7.28.0，抽濾，得澄清濾液，供下一步萃取用。（二）澄清濾液放入搪瓷缸中用乙酸酸化pH值為3.56.0

17、,加乙酸丁酯分兩次（每次加1020ml）進行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸內(nèi)上下翻動，使濾液和乙酸丁酯能充分混合接觸，然后靜置30min使之分層，用100ml燒杯收集上層萃取液。（三）取上述下相液，加入一定體積的飽和食鹽水，加入乙酸丁酯分兩次萃取，充分混合接觸，待靜置分層后，將上層萃取液（BA液）傾倒出或吸出，轉(zhuǎn)入另一只燒杯中（四）結晶和干燥：取量乙醇-醋酸鉀溶液，緩慢加入上述BA溶液中，帶有沉淀時，攪拌后靜置30min后過濾，得紅霉素晶體，將濕晶體放入燒杯中，加異丙醇30-50ml,攪拌成漿糊狀，然后抽濾，將濕品平鋪培養(yǎng)皿中，真空干燥的干品。五、結果與分析六思考pH的調(diào)節(jié)在提高紅霉素萃取效率方

18、面的重要性。常見的有機溶劑有哪些？紅霉素萃取時為何選用飽和食鹽水？（有兩個作用一是防止乳化，二是降低有機化合物在水中的溶解度。）實驗七薄層色譜法鑒定果汁中的糖一、實驗目的了解薄層色譜法的分離原理，掌握薄層色譜法鑒定果汁中的糖的操作技術。二、實驗原理對多組分的復雜混合物，無論是有機物或無機物，薄層色譜法是有效的分離手段之一。硅膠是常用的吸附劑，使用與酸性和中性物質(zhì)的分離，在一定條件下，硅膠對各種糖分的吸附能力不同。同時，選擇適當?shù)恼归_劑，利用各種糖分的分配系數(shù)的差異，從而達到分離。顯色后得到色譜圖，與在相同條件下已知糖分的色譜圖比較就能鑒定果汁中的糖分。未知物組分的鑒定是通過在同一塊薄層板上分別

19、點上標準樣品和未知樣品，通過比較斑點的比移值來定性鑒定。其中比移值Rf計算公式為：Rf=原點至斑點中心的距離/原點至展開劑前沿的距離由于在相同條件下，物質(zhì)的Rf值是一定的，因而比移值Rf可以進行物質(zhì)的定性分析。分離之后，可以用適當?shù)姆椒ǘ繙y定，如刮下有色斑點。將被測物浸取后用比色法測定其含量，或用薄層掃描儀掃描直接測出被測物的含量。三、實驗器材層析缸（筒）（lOcmxlOcm）；微量注射器，若僅作定性鑒定，則可用玻璃毛細管來替代；薄層板：用10 x10cm玻璃板制作硅膠板、可剪截型薄層層析板（10cmx10cm，0.2-0.25mm鋁基硅膠G板，天津市天河醫(yī)療有限公司）；吸附劑：硅膠G（青島

20、海洋化工有限公司生產(chǎn)，200260目，化學純）展開劑1：正丁醇：丙酮：水=4：3：1顯色劑1：苯胺一二苯胺磷酸（臨用時配制：2g二苯胺、2ml苯胺、20ml85%磷酸，與200ml丙酮混溶）顯色劑2：:把10ml硫酸緩慢倒入90rnl乙醇中混合冷卻，制得10%的硫酸溶液標準糖溶液：麥芽糖、果汁、蜂蜜、果糖、葡萄糖，分別溶于10異丙醇中，使其濃度為100mg/ml新鮮果汁、蜂蜜、無水乙醇四、實驗步驟（1）制作薄層板將玻璃板洗凈至不掛水，晾干后置于干燥潔凈處備用。將10g硅膠G加適量的水（約25mL）,在研缽中用研杵向一個方向研磨制成均勻的有適當粘稠度的膠漿，立即傾倒于玻璃板中央，迅速振蕩，使硅膠

21、層厚度均勻。涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干，并在105C溫度下活化30min后，貯于干燥器中備用。硅膠層的厚度約為0.1mm,使用前用氯仿-甲醇（8:2）預洗，在105C溫度下加熱干燥1ho（2）點樣在10 x10cm的硅膠G薄板上離底邊2cm處用鉛筆劃線，用微量注射器或玻璃毛細管點樣（新鮮果汁及標準糖液），各斑點之間相距2cm且每個斑點的直徑不超過2mm，每個樣品點4次，每次點樣后用冷風吹干或間隔一定時間使其自然干燥。在板上標出起始線和欲展開的前沿線，一般展開距離為7cm以上。（3）展開把點樣后的薄層板在紅外燈烘干（若無紅外燈，則在空氣中晾干），將配好的展開劑倒入展開缸中，使展開劑在缸

22、中的深度至少有l(wèi)cm深，蓋上蓋子，混合均勻。等數(shù)分鐘后讓溶劑在展開缸中飽和后，再將已點好樣的晾干的薄層板迅速的放入缸內(nèi)，盡量不破壞缸內(nèi)的氣氛，蓋上蓋子。讓薄層板的下部浸入展開劑溶液中約0.5cm以上（但注意不要讓點樣的斑點浸入到展開劑的溶液中，以免被溶液浸洗下來）；由于吸附劑的毛細管作用，展開劑和斑點不斷向上遷移，直到展開劑前沿到事先預定好的刻度線后（一般完成一次展開過程需要2530分鐘），可取出薄層板,。在紅外燈下將展開劑蒸發(fā)（或在空氣中晾干，此過程大約需15分鐘）。（4）顯色在通風櫥中，在薄層板上噴霧顯色，隨即在100C下烘烤1020min,注意觀察各種糖的顏色和計算Rf,并以此鑒定果汁中

23、的糖分。五、結果與討論1計算出果汁中所含糖的Rf；實驗結果如下：從左往右樣品分別為：麥芽糖、葡萄糖、果糖、果汁、蜂蜜。名稱麥芽糖葡萄糖果糖果汁蜂蜜原點至斑點中心的距離cm5.05.35.14.35.5原點至展開劑前沿的距離cm7.57.77.97.87.9Rf0.6670.6880.6450.5510.696討論：從上表可以看出各種物質(zhì)的Rf值不同，計算出的Rf值中，果汁的Rf值與果糖的Rf值最接近，故果汁中最有可能含有果糖。在點樣時，樣品點過大，可能會導致樣品色譜變寬；果汁色譜顏色深，其原因可能是樣品濃度過高;實驗八透析法脫鹽一、實驗目的學會透析的基本原理和操作。二、實驗原理蛋白質(zhì)是大分子物

24、質(zhì)，它不能透過透析膜，而小分子物質(zhì)可以自由透過。在分離提純蛋白質(zhì)的過程中，常利用透析的方法使蛋白質(zhì)與其中夾雜的小分子物質(zhì)分開。三、試劑及儀器1.儀器透析管或玻璃紙、燒杯、玻璃棒、電磁攪拌器、試管及試管架。2.試劑蛋白質(zhì)的氯化鈉溶液（3個去黃的雞蛋蛋清與700ml水及300ml飽和氯化鈉溶液混合后，用數(shù)層干紗布過濾）。1%硝酸銀溶液、10%硝酸溶液、10%氫氧化鈉溶液、1%硫酸銅溶液。四、實驗步驟用蛋白質(zhì)溶液做雙縮脲反應（加10%氫氧化鈉溶液約1ml,振蕩搖勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，振蕩，觀察出現(xiàn)的粉紅顏色）。2透析袋的預處理。將適當大小和長度的透析袋放在50%乙醇中煮沸1h（或浸泡一段時間）

25、，再用10g/L的碳酸鈉溶液和1mmol/L的EDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水洗滌2-3次，結扎袋的一端。向火棉膠制成的透析管中轉(zhuǎn)入10-15ml蛋白質(zhì)溶液并放在盛有蒸餾水的燒杯中，或用玻璃紙裝入蛋白質(zhì)溶液后扎成袋形，系于一橫放在燒杯的玻璃棒上。約1h后，從燒杯中取出1-2ml水，加10%硝酸溶液數(shù)滴使呈酸性，再加入1%硝酸銀溶液1-2滴，檢查氯離子的存在。從燒杯中另取水1-2ml,做雙縮脲反應，檢查是否有蛋白質(zhì)存在。不斷更換燒杯中的蒸餾水，并用電磁攪拌器不斷攪拌蒸餾水以加速透析過程。數(shù)小時后從燒杯的水中不能再檢出氯離子時，停止透析并檢查透析袋內(nèi)容物是否有蛋白質(zhì)和氯離子的存在。（此時應觀察到透析

26、袋中球蛋白沉淀的出現(xiàn)，因為球蛋白不溶于純水）。五、結果與分析從氯離子和雙縮脲反應檢查結果，評價透析的效果。實驗九等電點法沉析法分離牛乳中酪蛋白一、實驗目的1、學會牛乳中制備酪蛋白的原理和方法2、等電點沉析法的基本操作技術二、實驗原理蛋白質(zhì)在溶液中有兩性電離現(xiàn)象。假設某一溶液中含有一種蛋白質(zhì)。當pI=pH時該蛋白質(zhì)極性基團解離的正負離子數(shù)相等，凈電荷為0此時的該溶液的是pH值是該蛋白質(zhì)的pI值。某一蛋白質(zhì)的pI大小是特定的，與該蛋白質(zhì)結構有關，而與環(huán)境pH無關。在此時，蛋白質(zhì)之間的靜電排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白質(zhì)在pH值等于其等電點的溶液中溶解度下降的原理進行沉淀分級的方法稱為等電點沉淀(

27、isoelectricprecipitation)。三、試劑及儀器1.材料鮮牛奶2.試劑醋酸鈉、優(yōu)級純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.2mol/lPH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液3、器具燒杯100m1、玻璃棒、滴管、量筒、離心機、水浴鍋、布氏漏斗、表面皿、抽濾瓶四、實驗步驟1、將牛奶30ml及醋酸-醋酸鈉緩沖液30ml分別水浴加熱40攝氏度左右，用8層紗布過濾牛奶。2、量取加熱后牛奶20ml,在攪拌下加入加熱后的醋酸-醋酸鈉緩沖液20ml,調(diào)節(jié)PH到4.7.3、將混合液冷卻到室溫，3500r/min離心15min,棄去上清液，得酪蛋白粗品。4、水洗沉淀3次，3500r/min離心10min.棄

28、去上清液。5、沉淀中加入乙醇20ml，攪拌片亥I。將渾濁液轉(zhuǎn)到布氏漏斗中抽濾。用乙醇-乙醚混合液洗滌兩次，最后用乙醚洗滌兩次，抽干。6、將沉淀攤開到表面皿上，風干的酪蛋白純品。7、計算：含量=酪蛋白g/100ml牛奶收率=測得含量/理論含量理論含量為3.5g/100ml牛乳五、結果實驗十柱層析分離色素一、【實驗目的】1了解柱層析的分類，掌握各種柱層析的原理。2熟練掌握吸附層析的原理和操作技術。二、【實驗原理】葉綠體色素是植物吸收太陽光能進行光合作用的重要物質(zhì)，主要有葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。從植物葉片中提取和分離葉綠體色素是對其認識和了解的前提。利用葉綠體色素能溶于有機溶劑的特

29、性，可用95%乙醇或無水乙醇提取。分離色素的方法有多種，如紙層析、柱層析等。柱層析法是色譜法中的一種，它是根據(jù)混合物中各組分對固定相的吸附能力，以及對洗脫劑（即移動相）的溶解度不同將各組分分離。常用的柱色譜有吸附色柱譜和分配柱色譜兩類。吸附柱色譜通常是在玻璃管中填入表面積很大，經(jīng)過活化的多孔性物質(zhì)或粉狀固體作為吸附劑（如氧化鋁或硅膠），當混合物的溶液流經(jīng)吸附柱時，就被吸附在柱的上端，然后從柱頂加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶劑中的溶解度也不同，因此各組分隨溶劑以不同速度下移，形成色帶。繼續(xù)用溶劑洗脫，吸附能力最弱的組分就隨溶劑首先流出，整個層析過程進行反

30、復的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱層析法可以分別收集各組分，并逐個鑒定。本實驗是把三氧化二鋁填入玻璃管中（壓成柱狀）作為吸附劑，將葉綠體色素的石油醚提取液傾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的種類不同，被吸附的強弱不同，就在吸附柱上排列成為不同的色層，再利用吸附劑在不同溶劑中有不同的吸附力，用不同的溶劑進行洗脫，從而達到葉綠體主要的4種色素（葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、胡蘿卜素）的分離。三、【實驗材料】原料：新鮮的菠菜葉石英砂3.丙酮4.石油醚（60-90C）7.水硫酸鈉8洗脫液：丙酮：石油醚=1：9蒸餾裝置，脫脂棉，天平，燒杯，過濾試管，鐵架臺試劑：1無水乙醇或95%乙醇2三氧化二鋁6飽和

31、氯化鈉溶液器材：層析柱（IX30cm）,研缽，漏斗，玻璃棒，錐形瓶，分液漏斗四、【實驗操作】1色素的提?。?0克菠菜，加少許石英砂，再加20毫升無水乙醇研磨成漿，脫脂棉過濾，保存濾液，濾渣再用無水乙醇提取一次，合并濾液，濾渣再加入30毫升石油醚提取一次，過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,再加入40毫升飽和氯化鈉溶液震蕩，棄去下層溶液，再分別加入20毫升水震蕩洗滌幾次，直至下層無色，保留上層溶液，轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入無水硫酸鈉干燥5分鐘，備用.樣品的濃縮：將提取液放入蒸餾燒瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液體5-8毫升左右，以備加樣使用。層析拄的制備：15克堿性三氧化二鋁加入30毫升石油醚攪拌，浸

32、泡10min.。在層析拄內(nèi)加入一團棉花在底部，再加入石英砂0.5cm以上，然后用石油醚半充滿柱子，再將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi)，倒時應該緩慢，重復使用下面的石油醚，直到裝完。用石油醚洗柱內(nèi)壁，頂部加一小團棉花，然后再填入石英砂0.5厘米高。樣品的分離層析：吸附層析分離色素打開層析拄下部開關，向拄內(nèi)加入2毫升濃縮液，至液體沒入砂內(nèi)，再加入石油醚沖洗拄壁，液體浸入砂內(nèi)，加洗脫液開始層析，可以看到不同色帶如圖片1，直至第一條色帶洗脫完畢，在拄下面用試管接收第一條色帶的洗脫液，如圖片2。五、【實驗結果】實臉結果如下圖:圖一層析柱中出現(xiàn)黃色蒂圖二提取岀的節(jié)邑陰蓼卜素六、結果分析：洗脫過程中，首先有一條

33、黃色的色帶圈沿著層析柱下移，色帶圈的各個方向的移動速度并不是完全相同，原因在于層析柱的制作過程并不完全均一，使層析柱內(nèi)部不均勻，以至于色帶各方向的移動速度不同。最后收集得到亮黃色的胡蘿卜素。七、【注意事項】1、萃取時不要劇烈振蕩，以防止發(fā)生乳化現(xiàn)象。2、為了保持柱子的均一性，使整個吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必要的，否則當柱中溶劑或溶液流干時，就會使柱身干裂，影響滲透和顯色的均一性。因此要保證整個裝樣過程中溶劑要高于三氧化二鋁的表面。3、在吸附劑上端加入脫脂棉（或濾紙）是使加樣品時不致把吸附劑沖起；在吸附柱下端加脫脂棉（或沙子）可以防止吸附劑細粒流出。4、層析柱填裝緊密與否，對分離效果很有影響，

34、若各部分松緊不勻，會影響滲透速度和顯色的均勻。6、洗脫流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠，色素分離不開；也不要過慢，使柱裝得太松，導致層析過程中，凝膠床高度下降，色素洗脫很慢。因此應控制洗脫流速，以每分鐘6080滴為宜。7、樣品一定要足夠濃縮，加樣量不要過大，過大，分離條帶過寬，如果層析拄不夠長,各組分不易分開，易同時洗脫下來；加樣量過少，色帶不是很清楚，不易觀察，效果不好。8、層析柱粗細必須均勻，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇。一般來說，細長的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時，會發(fā)生“管壁效應”即柱管中心部分的組份移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長

35、，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。八、【實驗小結】在該柱層析分離色素實驗中，我了解了柱層析技術的相應方法和原理，學會了層析柱的制作和準備，進一步了解綠葉中色素的組成及各色素的顏色和性質(zhì)、洗脫液的配比、層析柱的制作及洗脫液的流速是本實驗成功與否的三大關鍵因素。知識拓展：1、溶劑的選擇：（1）吸附劑要求較純，否則會影響樣品的吸附和洗脫。（2）溶劑和吸附劑不能起化學反應。（3）溶劑的極性應比樣品小，如果大了，樣品不宜被吸附劑吸附。（4）溶劑對樣品的溶解度不能太大，否則影響吸附，但也不能太小，溶液的體積增加，易使色譜分散。（5）可使用混合溶劑，如有的組分含有較多的極

36、性基團，在極性小的溶劑中溶解度太小。也可選用極性大的溶劑溶解，然后加入一定量的非極性溶劑。這樣既降低了極性，又減少了溶液的體積。2、洗脫劑的選擇：樣品吸附在氧化鋁柱上后，用合適的溶劑進行洗脫，這種溶劑稱為洗脫劑。如果原來用于溶解樣品的溶劑沖洗柱不能達到分離的目的，可以改用其他溶劑，一般極性較強的溶劑影響樣品和氧化鋁之間的吸附，容易將樣品洗脫下來，達不到分離的目的。因此常用一系列極性漸次增強的溶劑，既先使用極性最弱的溶劑，然后加入不同比例的極性溶劑配成洗脫溶劑。常用的洗脫溶劑的極性按如下次序遞增。己烷和石油醚V環(huán)己烷V四氯化碳V三氯乙烯V二硫化碳V甲苯V二氯甲烷V氯仿V乙醚V乙酸乙酯V丙酮V丙醇

37、V乙醇V甲醇V水V吡啶V乙酸。實驗十活性炭吸附分離色素實驗一、實驗目的了解吸附的基本原理；掌握活性炭、木炭的靜態(tài)和動態(tài)吸附的基本操作技術。二、實驗原理活性炭具有較大的比表面，在水溶液中比一般固態(tài)物質(zhì)吸附能力強很多，故可以吸附許多物質(zhì)的分子及離子，本實驗用活性炭、木炭靜態(tài)和動態(tài)吸附溶液中的色素。三、實驗儀器離心機、大燒杯(三500ml)、燒杯(250ml)、高精度pH試紙、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。四、材料和試劑1材料胡蘿卜或紅心蘿卜8kg、活性炭粉8kg、脫脂棉1包。2試劑石蕊試劑500m1、濃硝酸500ml高錳酸鉀400g；組織搗碎機、燒杯、U形管、漏斗、直通管、導管、漏斗架、膠塞、玻璃管

38、、橡皮圈等。四、實驗步驟K護性炭祁總吸時去淒捋石邀禳整希救在小堤和札暢潔性炭粉衛(wèi)題然后攪樣k劍一故人過憧器中過罠用刃-奩輛或試笛收集沙腸椀斷色_話性拱動豈吸！附越蘿卜色璨逝深紐色威地痹曹，色據(jù)含値畫的紅旌葩蠻卜劃碎打慕”過36得告胡夢卜色索的辭液。猶后中段全孫用活件就裝陽閒的上如翩.儷旗亂塞裝上站，不而餌加-i囉導齡為聊液出口，其驗前將迎鑾邀凰匱定于鐵操蝕上.祀玄有題h建蠱的蒂潅故厶需井中.現(xiàn)猱下匝樓登益申收欒劍的辭溝畝說*4一水烹:吸附苗話醸鉀U塑闿中敏人約旳蓉積附小換木炭兩管拄脂棉-用-莫驗吋從左營rrfcad怖筒掘耘邯聖液木煲世常上菠兀潭制H：島一規(guī)型若呼上懇祓面頸邑L匾蠱-鼠化氮氣琴歌

39、輛貝帶帝惟形飆.以削竭攤牢_支小試嚀.小試哲中有_畫沿副毋，閾珀詵當瞇后立即吊丸蚩磋瓶申，許和中弋悴的櫬暫哲明眾時e將心試骨轉(zhuǎn)移氧另一惟甲蟲同時船第一蠱加塞，第一-腸也同萍濫區(qū)后舉出機堊，庖即抵小試魯連同刈中設齢隹謖人大水杯中”吐聯(lián)液若M可棄去rLnJl杷睨第的傑盾說干網(wǎng)啦注意事項：、活性炭使用前一定要經(jīng)過處理，增強他的吸附活性，實驗前要將木炭或活性炭放在坩堝里烘烤，充分進行解吸。、選用有色液體不要太濃，否則吸附不干凈可能會出現(xiàn)色帶，得不到無色清液（3）、榨取的胡蘿卜汁在活性炭脫色前，應進行過濾前處理，避免汁液過黏影響吸附效果。（4）、所用錐形瓶在實驗前應該是干燥的。六、結論七、思考1、木炭和

40、活性炭那種吸附劑的吸附效果好？2、實驗中第一步和第二步用同樣的胡蘿卜色素和活性炭，哪步吸附效果顯著？實驗十二卵磷脂制備一、目的要求懲悉從蛋黃中制備卵請脂的曉理；皐握駆磷脂制備的基李操作及莞定技術。二、實驗原理利用卵隣脂可溶于乙醇的性質(zhì)，舟即黃溶于乙醇卵磷脂從卵黃中轉(zhuǎn)移到乙醇溶液中,可分離提取岀來，而蛋白質(zhì)等某些雜質(zhì)從況淀物中除去卜但由于乙舞溶劑抽提時，其他脂質(zhì)也一起被推提，如甘油三薛、當醇等利用弗磷脂不給于丙酮的性質(zhì)，用丙朗從粧卵磷脂溶液中沉淀璘脂，能使卵磷脂與其他脂質(zhì)和膽固醇分離開來一，無機鹽和卵磷脂可性成絡伶物沉淀,因此可利用金屬鹽:沉淀劑將卵磷脂從溶液中分亀出來，由此除去壷白質(zhì)、脂肪等雜

41、質(zhì).再用適當常劑萃陋出無機鹽和其他磷脂雜質(zhì)，這聲町大大握高卵璘脂純度三“實驗用品L材対新鮮雞蛋、卵磷脂常照品、GF254硅膠板。2,試劑氯化鋅落販、2佻三氯甲烷溶痕、無水乙蒔、密嚅乙醇、0.1%乙癖、丙酮(冰、甲醉利碘*.3.鬆具離心機，鉅轉(zhuǎn)聶發(fā)儀、布式漏斗、抽;慮叛、克空干嫌筠、層析缸、紫外分光光嗖計、四、實驗過程機按室溫下,脫適呈的雞蛋卵黃用2榕于卵黃體機曲處筑乙醉迎行捉取混合攪拌，輻心分離(3000r/mint5mm),將沉淀物重復擬瑕3次，回收上清液；然后、戚壓蒸幣(45%；)至近干冋少童石油脫洗下粘壁的黃色油狀物質(zhì)；加人內(nèi)酮，抽濾，分離出沉旋物，真空卡煥(40弋.30min),得到淡

42、黃色的粗陽磷脂*稱重，：臍制取一定重的陽璘脂粗品+用無水乙障溶解，洱到綃10%乙醇粗提液*汕入棚當亍卵瞬脂質(zhì)童的10%的氯化罷K陷液，室溫據(jù)拌0上h；分離沉泄副，加人適顯冰丙團2弋)冼溫攪拌lh,再用丙酮疫研洗，靑到丙覩擾液.為近無色止，得到白色蠟狀的精卵磷驗：十燥；3+螯定:薄屈色譜甘析nol/L的氣処化鈉辭踱週pH毎加1熱恬性契曲t加迪巧lin眥色*抽謹，濾液扎菠，掘水邊析12h.遙析液取代水禍鍛貓至原1/3.摘臥.乙醇沅扳皓艘加3倍罐站卷乙酢，攪拌均旬后,離心UQOOm佝)】5mi叫沉淀.FR無水乙弊詵漲2EJo乙惟洗朶E緩.此以T克空干嫌得銀尊藩稱相品、稱販粧別1)取坦品1扱證于100

43、ml止中.榕解后炭心除去不濬物；CTAH至鳳淀宣全匸搖勻fB2h.離心(3OOOr/min)ISmiTi.沉炭用和覽熱水熱嶄3罠加IfWmldnwH氯化鈉琳液于軸弋辭離仆,離心(300W血h)I5min,上清喪扎堂流水透折嘰適折我80弋燉紅抑3倍按站作乙那攪勻，離心(iOOGr/minjI5min,沉還用無水乙?guī)?、乙觀琢50逞以匸慮空干燥-得冊品漲耳囊塘、堊軸殆藝展和唱址測定多新的罄定玻透靳液EL,加人H-疾鬧落液2-器酹引諧于9珈乙翻2滴*抿旬，特試裁傾斜，沿試管堰緩銀仙人啟臨酸1-弘L(如碾動)，觀察硫腹涇與曲湃鮫界面處戯色変化取透折液敢網(wǎng)液點于謔紙L65%印萃股乙御溶液架色觀察辰版*;取

44、透析懣灤縮液2曲加人2噸LTAB液2-斗癇，觀痙現(xiàn)魚。(2)總的含就爹將在液疏趣中水斛后，世一爭悅水生哎龜軽淇衍生物，導恿前作用乖成藍色牝含枸“詵吁比世測定，按密操柞捲勻_,置沸煤潯中Minim齡卻后-以筮-=笹為空白620rim分扯比也”計算.更糧會邑”址刑沁L2s岸島fniL)爭島禪解訊0trffftSjW(?.；0.5ml.MJniLS.DmLQ,!5iii1.銀耳爹糊紙層析屜幵鋼：正丙聲：我氨?K：水二航：旳：幾點樺；霧簪朮譜鞍抽訊：(1)朝品；C2)帝6L樨？F：I3gm吹于=染色；0.5甲笨胺乙婷液.染色，汨略乙醉謂洗*站果：祚圖，汁算此Hor五*注意事項菊促反腹的軸剛、逛度應控制好a在制備全流程中痕時刻注意混度,不能趨過顋六、思灣題的加人復合酶敘諷右佃作用？CTAB曙含法與乙醉筑析蟄分離銀耳參糖有何異同？為何在制備全流程屮應肘刻注意濕度不能超過8護0?實驗十四硫酸銨分級鹽析分離血清中的主要蛋白質(zhì)（選做）一、實驗目的（3