動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別

1、 姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)弓細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別【實驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)并掌握動物細胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。了解并掌握用組織塊貼壁培養(yǎng)法和消化細胞培養(yǎng)法進行動物細胞原代培養(yǎng)的實驗方法。了解動物細胞傳代培養(yǎng)的實驗方法。學(xué)習(xí)細胞生死狀態(tài)鑒別的原理及方法。熟悉和掌握各種鑒別細胞生死狀態(tài)方法的判定特征。掌握細胞計數(shù)方法，計算細胞存活率?！緦嶒炘怼浚ㄒ唬┘毎囵B(yǎng)細胞培養(yǎng)指的是在無菌條件卞，把動、植物細胞從組織中取出，在體外模擬體內(nèi)的生理壞境，使離體的細胞在體外生長和繁殖，并且維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。動物細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。從供

2、體獲得組織細胞，在無菌條件卞，用胰蛋白酶消化或機械分散等方法，將動物組織分散成單個細胞開始首次培養(yǎng)長出單層細胞的方法稱為細胞的原代培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)的動物細胞生長增殖達到一定密度，形成致密的單層細胞時，用胰蛋白酶將細胞消化分散成單細胞，從一個容器中以1：2或其他比例轉(zhuǎn)移到另一個容器中擴大培養(yǎng)的方法，稱為細胞的傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的累計次數(shù)就是細胞的培養(yǎng)代數(shù)。高等生物是由多細胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個細胞或某一群細胞在體內(nèi)的功能活動是十分困難的。但如果把活細胞拿到體外培養(yǎng)、増殖并進行觀察和研究，則要方便和簡單得多。被培養(yǎng)的動物細胞是非常好的實驗對彖和實驗研究材料，對體外培養(yǎng)的活細胞進行研究可以

3、幫助人類揭開生老病死的規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老和防治各種疾病的途徑和機制，也可以人為地誘導(dǎo)和改變細胞的遺傳性狀和特性，使其向有利于人類健康長壽的方向發(fā)展。因此動物細胞體外培養(yǎng)技術(shù)是研究細胞分子機制非常重要的實驗手段，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、基因工程等研究領(lǐng)域。（-）細胞生死狀態(tài)的鑒別細胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學(xué)染色法和熒光染色法?；罴毎退劳黾毎谏砑寄芎托再|(zhì)上主要存在以下差異：細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性地通過：而細胞死后，細胞膜受損，其通透性增加。基于此，發(fā)展出了以臺盼藍、伊紅、苯胺黑、赤蘇紅、甲基藍以及熒光染料碘化丙唳

4、或漠化乙唳等為染料鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述染料能使死亡細胞著色，而活細胞不被著色。此外，應(yīng)用植物質(zhì)壁分離的性質(zhì)也可鑒定植物細胞的生死狀態(tài)?；罴毎脑|(zhì)具有選擇透過性，死細胞因其原生質(zhì)的選擇透過性已遭破壞，故與高滲透壓溶液接觸時不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。代謝上的差異：活細胞中新陳代謝作用強，細胞內(nèi)的酶具有較強的活性和還原能力。基于此，發(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA）、熒光素二丙酸酯、熒光素二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述酯化的熒光素親脂性提高，容易被細胞吸收進入，活細胞內(nèi)的酯酶具有較強的活性，可將酯化的熒光素分解而釋放出能姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題

5、目動物細胞培養(yǎng)號細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號發(fā)熒光的熒光素，該物質(zhì)不能自由透過活的細胞膜，枳累在細胞內(nèi)，熒光顯微鏡卜顯示有明亮的綠色或黃綠色熒光：而死亡細胞內(nèi)的酯酶因失去活性，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下顯示不發(fā)光。另外，可用亞甲基藍為染料鑒定酵母細胞的生死狀態(tài)。亞甲基藍是一無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色?；罴毎蚓哂休^強的還原能力，能使亞甲藍從藍色的氧化型變成無色的還原型，故活的酵母細胞在用亞甲基藍染色后顯示無色：死亡酵母細胞或代謝緩慢的衰老酵母細胞，因無還原能力或還原能力極弱，使亞甲藍仍處于氧化態(tài)，故呈現(xiàn)藍色或淡藍色?！緦嶒灢牧稀科鞑模航馄始簟⒔馄受b、培養(yǎng)皿、紗布塊、玻璃漏斗、量筒、

6、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、L型注射器、離心管等。上述器材需徹底洗凈、烤干、包裝好，滅菌，備用。超凈工作臺、倒置相差顯微鏡、C02培養(yǎng)箱、普通光學(xué)顯微鏡、離心機、血球計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號筆、解剖板、蓋玻片等。試劑：培養(yǎng)液、PBS液0.4%臺盼藍染液、0.15%伊紅染液材料：小白鼠【實驗步驟】取材取小白鼠一只，采用斷頭法處死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中滅菌3分鐘。取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤內(nèi)，無菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其周鬧的脂肪組織，躡起脾臟用PBS液自上而下沖洗1一2次。轉(zhuǎn)入無菌玻璃培養(yǎng)皿，待用。分離脾細胞用滴管先向上述無菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入PBS液30滴，再用“L

7、”型針頭注射器在皿中吸取PBS液0.2ml,然后將其沿脾長軸方向注射入脾內(nèi)（使脾臟膨脹以利于細胞散開）。用針尖在脾臟上扎眼，并用“L”針頭輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細胞，稍傾斜并靜置1一2分鐘。吸取上述靜置后的脾細胞懸液上清部分放入Eppendorf管，并使量至lml,以3000r/分離12分鐘。培養(yǎng)脾細胞超凈工作臺中取塑料培養(yǎng)皿一個，用“槍（1ml）”加入細胞培養(yǎng)液2ml,并在皿蓋上畫上標(biāo)記，待用。取上述離心后的Eppendorf管，在超凈工作臺內(nèi)開蓋棄去上清液，用“槍（200p1）”吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ml加入棄去上清液的Eppendorf管中

8、,用槍頭吹勻管底的脾細胞，然后吸取200ml脾細胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。臺盼藍法鑒定細胞的生死狀態(tài)（1）試劑配制：用生理鹽水配置0.4%臺盼藍染液，備用。（2）細胞懸液制備：將生長有貼壁型細胞的培養(yǎng)瓶（皿）中的培養(yǎng)液倒入干凈試管中，向培養(yǎng)瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液l-2ml,靜置3-5min,待見到姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號山東大學(xué)實驗報告年月口山東大學(xué)實驗報告年月口 姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號圖1培養(yǎng)

9、液鏡檢結(jié)果（細胞總數(shù)-死亡細胞數(shù)）細胞總數(shù)取老師提供的細胞染色后置于顯微鏡下觀察時，可見視野中有很少的帶有淺藍色的細胞，而透明細胞較多。中方格的位置（相對于視野的位置）死細胞數(shù)活細胞數(shù)細胞總數(shù)左k05353左下15657右上35457右下06060細胞存活率=X100%53+56+54+60=-X100%53+57+57+60=98.24%每亳升液體中細胞的數(shù)二（53+57+57+60）/4*16*10000=9080000注：細胞計數(shù)及存活率的計算結(jié)果均對應(yīng)于老師提供的細胞?！舅伎寂c討論】（一）實驗結(jié)果分析活細胞邊緣較明顯，而使細胞臉維持正常的選擇透過性，染料無法通過，所以呈現(xiàn)透明無色。死細

10、胞由于細胞膜不再具有生物活性，染料從細胞膜通過，將細胞染色，且死細胞的邊緣不明顯。將培養(yǎng)基剛從培養(yǎng)箱拿出來時，培養(yǎng)基的顏色應(yīng)呈現(xiàn)無色（由于細胞的代謝產(chǎn)物為酸性以及培養(yǎng)箱中的二氧化碳濃度較高），過一段時間后漸漸恢復(fù)粉紅色。姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)弓細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號用倒置顯微鏡觀察時，可以看到在黃色的背景下有一些透明的細胞。（-）注意事項在進行方格查數(shù)時要注意：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。實驗涉及的臺盼藍染料有致癌危險，因此滴加染液時要小心，防止濺到皮膚上。動物細胞培養(yǎng)使用的所有器皿、用具、溶液等必須經(jīng)過嚴(yán)格消毒或滅菌處理，才能在超凈工作臺中使用，整個實驗過程都要有

11、無菌操作的概念，避免細胞被污染。在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈后，實驗操作應(yīng)在火焰的附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼后要待其冷卻才能夾取組織，經(jīng)過培養(yǎng)液的用具不能長時河燒灼，以免燒焦形成碳膜。超凈工作臺內(nèi)吸取溶液用的的各種吸管等不能混用，以免相互污染。在超凈工作臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能敞開暴露過久，以免溶液蒸發(fā)和pH變化。器皿、離心管培養(yǎng)瓶等在離開超凈工作臺前必須將蓋子或橡皮塞蓋緊，以防止細胞污染或溶液漏出。（三）反思與總結(jié)做實驗的時候由于顯微鏡的光線問題，死細胞的顏色有時不太明顯，在觀察的時候需要注意。將脾加入到培養(yǎng)基后，準(zhǔn)備將其加入到培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，檢測一下培養(yǎng)基中是否有氣泡

12、，若有氣泡的話，則應(yīng)除去后再放置。用注射器的針頭對小白鼠的脾進行穿孔時要小心操作，既不能刺得太狠將脾弄破，也不能刺得太輕使得到的脾細胞過少。注意進行無菌實驗操作的規(guī)范，身體只有消過毒的部分才可進入超凈工作臺，防止身體的其他部分將細菌帶入。注意用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)基中細胞的正確方法。（四）思考題為什么要學(xué)習(xí)細胞生死狀態(tài)鑒別的方法？試說明其實際應(yīng)用意義。答：在細胞培養(yǎng)的實驗室操作以及制造生物制劑時，有時需要確定某舟細胞的生存狀態(tài)，以便進行下一步操作，因此選擇恰當(dāng)?shù)募毎罓顟B(tài)鑒別的方法是十分重要的。各種細胞生死狀態(tài)方法的原理和判定特征是什么？答：原理主要是基于細胞膜的選擇透過性和代謝上的差異。鑒別

13、方法主要是化學(xué)染色法和熒光染色法?；瘜W(xué)染色法：活細胞的細胞臉是一層選擇透過性膜，只允許物質(zhì)選擇性地通過，而細胞死后，細胞膜受損，其通透性增加。因此一些化學(xué)染料能使死亡細胞著色，而活細胞不著色。熒光染色法：活細胞中新陳代謝作用強，一些酯化的熒光素親脂性提高，容易被細胞吸入，活細胞的酶有較強的活性，將其分解成能發(fā)熒光的熒光素該物質(zhì)不能自由透過細胞膜，積累在細胞內(nèi)，顯微鏡卜顯示有明顯的熒光：而死細胞內(nèi)的新陳代謝停止，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下不發(fā)光。除此之外，鑒別植物細胞的死活還可以采用其質(zhì)壁分離性質(zhì)，將植物細胞放入高滲溶液中，觀察其是否發(fā)生質(zhì)壁分離。若發(fā)生，則為活細胞；若不發(fā)生，則為死細胞

14、?；罴毎?、壞死細胞和凋亡細胞的形態(tài)特征是什么？它們的主要區(qū)別有哪些？姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號答：活細胞的外形較規(guī)則，細胞膜的邊緣明顯，細胞中能夠清晰地看到細胞核。壞死細胞的特點是：細胞質(zhì)膜和核被膜破裂，細胞骨架和核纖層解體。細胞質(zhì)溢出，影響到周禺細胞，發(fā)生炎癥反應(yīng)。細胞凋亡的特點：細胞質(zhì)凝縮，細胞萎縮，細胞骨架解體，核纖層分解，核被膜破裂，核DNA分解成片段，出現(xiàn)梯形電泳圖。細胞壞死指的是細胞收到物理、化學(xué)因素的損傷，如機械損傷、毒物、微生物、輻射等，引起的細胞死亡。而凋亡是“細胞的程序性死亡”，是個體發(fā)育、存活必需的正常秩序的一部分。細胞

15、凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件卞，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存壞境而主動爭取的一種死亡過程。在動物細胞培養(yǎng)操作過程中，應(yīng)如何加強無菌操作的觀念以避免細胞污染？答：動物細胞培養(yǎng)使用的所有器皿、用具、溶液等必須經(jīng)過嚴(yán)格消毒或除菌處理，才能進超凈工作臺中使用整個實驗過程都要有無菌操作概念，避免細胞被污染。組織塊貼壁培養(yǎng)時，為什么要將貼有組織塊的培養(yǎng)瓶先翻轉(zhuǎn)過來培養(yǎng)？翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶的時間不宜過長，為什么？答：為了使組織塊略干燥能牢固粘于瓶壁上。時間過長，則組織粘得太緊，不方便培養(yǎng)。皮膚組織塊培養(yǎng)時，要

16、靜置培養(yǎng)并盡量減少晃動培養(yǎng)瓶，為什么？答：晃動培養(yǎng)瓶可能會影響細胞的生長，使剛生成的細胞膜破裂。加入培養(yǎng)液后，即可終止胰蛋白酶的消化作用，為什么？答：加入培養(yǎng)液后，細胞獲得了足夠的養(yǎng)分，也就解除了接觸抑制的狀態(tài)，因此胰蛋白酶的消化作用終止。在細胞傳代時，將原培養(yǎng)液倒去后用D-Hanks工作液洗滌細胞2遍，再加胰蛋白酶，為什么？答：D-Hank*s是常見的平衡鹽溶液之一，它是組織基本用液之一、在細胞傳代時，要確保傳代細胞的細胞的滲透壓與培養(yǎng)液保持一致，因此需要用D-Hanks工作液洗滌，起到過度作用。【作業(yè)】（一）抑制腫瘤細胞増殖藥物的篩選方法。MTT法（1）接種細胞：用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)

17、液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul.（2）培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）。（3）呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配）20ul.繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMS0,振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。（4）比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。熒光染色法第一種方法是定量的確定熒光強度，然后來半定量的說明細胞活著的數(shù)

18、目。山東大學(xué)實驗報告年月口山東大學(xué)實驗報告年月口 姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號第二種方法是取多視野拍攝熒光照片(細胞應(yīng)該在培養(yǎng)皿上貼壁),然后用軟件ImageJ來數(shù)出細胞數(shù)量，這樣取平均數(shù)。WST-1法方法體外培養(yǎng)人鼻咽癌細胞至對數(shù)生長期.加入待檢抗癌藥物。繼續(xù)培養(yǎng)48h后每組各取6孔加入一定量的WST-1試劑，然后測定0D5：。值，計算細胞相對增殖度RGR1,每組再各取6孔，加入5g/L結(jié)晶紫羅蘭染色3min后，加入10g/L十二烷基磺酸鈉，測定0D588值。巢蛋白法提供腫瘤的特定細胞株和培養(yǎng)條件鑒定上述腫瘤細胞株表達巢蛋白的表達加入待篩選的

19、藥物培養(yǎng)48小時或更長的時間，檢測巢蛋白的表達，檢測結(jié)果與b步驟的結(jié)果進行比較，如果出現(xiàn)巢蛋白表達卜調(diào)的情形，該待選藥物成為抑制腫瘤增殖和/或促進細胞凋亡的先導(dǎo)藥物。誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡的藥物的篩選方法。方法：利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進入細胞，篩選穩(wěn)定表達E2F-1的細胞克隆，通過North亡rnblotting法和Westernblotting法鑒定陽性細胞克隆中E2F1的表達水平以及相應(yīng)PAC1的表達水平；應(yīng)用熒光素酶法檢測E2F-1蛋白對PAC1啟動子序列的轉(zhuǎn)錄激活水平，并借助體內(nèi)ChromatinIP法和體外EMSA法分析E2F1轉(zhuǎn)錄因子與PAC1啟動子之間的特異性結(jié)合作用。分別應(yīng)用Wes

20、ternblotting法，臺盼藍染色法和TUNEL凋亡檢測法，鑒定高表達E2F1的細胞經(jīng)藥物4-耗苯基維胺脂(4-HPR)處理后其ERK1/2MAPK激酶的水平變化，細胞的生存率變化和凋亡出現(xiàn)的情況：建立高表達PAC1的穩(wěn)定細胞克隆并檢測PAC1本身對ERK1/2MAPK激酶磷酸化水平的影響和對細胞生長的抑制現(xiàn)象；通過小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建表達PAC1-siRNA的穩(wěn)定細胞株，進一步檢測PAC1在E2F-1介導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡反應(yīng)中的作用。利用脂體瞬時轉(zhuǎn)染法構(gòu)建細胞Saos-2/siE2Fl和Saos2/siPACl,應(yīng)用Wresternblotting法比較細胞中經(jīng)4-HPR處理前后E2F1和

21、PAC1的表達水平以及ERK1/2的磷酸化水平，并用臺盼藍染色法檢測細胞在不同劑量的4-HPR處理下存活率的改變規(guī)律：在Saos-2細胞系統(tǒng)中，用Westernblotting法檢測E2F1卜游相關(guān)靶分子，包括p73、加afT、caspase-9和caspase-3的蛋白變化情況；選擇人成纖維細胞株NHF3作為研究對彖，通過檢測細胞在不同劑量或不同時河的4-HPR處理下E2F.1、PAC1和p-ERKl/2的表達及細胞存活率的改變，探討藥物4-HPR對正常細胞的作用：應(yīng)用其他幾種臨床常用的抗腫瘤藥物，如依托泊昔Etoposide(5OpM)、5-氟尿喀唳5FU(30mM)、阿霉素Doxorub

22、icin(1.7pM)和【I弓|I1朵美辛Indomethacin(500pM),與藥物4-HPR進行平行比較，檢測高表達E2F-和PAC1的細胞在不同藥物處理下的存活率。結(jié)果：在細胞MB435/E2F1-C2和MB135/E2F1-C3中有高水平的E2FT轉(zhuǎn)錄和表達，同時PACI的inRNA水平和蛋白水平也隨著E2F-1相應(yīng)升高；熒光素酶法結(jié)果顯示，與對照組的空白質(zhì)粒姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號相比，共轉(zhuǎn)染E2F-1的表達質(zhì)粒和含正常PAC1啟動序列的熒光素酶報告質(zhì)粒可以使檢測到的熒光素酶活性增加約15倍，E2F-1町以通過激活PAC1的啟動

23、子實現(xiàn)對PAC1的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控：體內(nèi)ChromatinIP法和體外EMSA法的結(jié)果證實E2F1轉(zhuǎn)錄因子與PAC1啟動子之問有特異性結(jié)合作用。在抗腫瘤藥物4-HPR作用K，高表達E2F-1可以抑制ERK1/2MAPK激酶的活化并誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡；利用高表達PAC1的細胞進行一系列檢測，結(jié)果顯示PAC1本身也可以通過抑制ERK1/2MAPK激酶信號通路而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；進一步對PACl-siRNA細胞克隆的檢測顯示當(dāng)除去PAC1的作用以后，E2F-1就不能夠抑制ERK1/2激酶的活化，而且E2F-1也不能夠有效地介導(dǎo)4-HPR作用卞的細胞凋亡反應(yīng)，證明PACI是E2F-1凋亡通路中重要的介導(dǎo)

24、者，在E2F-1誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡反應(yīng)中起重要作用。對細胞Saos.2/siE2Fl和Saos-2/siPACl的檢測結(jié)果顯示在降低了內(nèi)源性的E2F-1表達水平或PAC1表達水平后，其對ERK1/2激酶的抑制作用減弱，細胞對藥物4-HPR的敏感性降低：檢測其它一些與E2F-1凋亡功能相關(guān)的靶分子，結(jié)果顯示4-HPR處理后的Saos-2細胞中，并沒有看到這些分子被誘導(dǎo)表達的現(xiàn)彖，證實E2F-1/PAC1途徑是一條特異性的傳遞凋亡信號的通路；將藥物4-HPR應(yīng)用在人正常成纖維細胞NHF3中，結(jié)呆證明正常細胞對該抗腫瘤藥物4-HPR并不敏感：應(yīng)用了其他幾種常用的抗腫瘤藥物后，結(jié)果顯示藥物Etopos

25、ide5-Fu和Doxorubicin并沒有引起高表達E2FT和PAC1的細胞出現(xiàn)明顯的凋亡，而藥物Indomethacin處理后可以引起高表達E2F1和PAC1的細胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，這種表現(xiàn)與使用藥物4-HPR后類似。結(jié)論：PAC1是E2F-1的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶分子。E2F-1可以通過PAC1抑制ERK1/2激酶的活化并誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。E2F-l/PACl/MAPKs通路是E2F-1介導(dǎo)I、的一條特異性的凋亡信號通路，藥物4-HPR通過該通路對腫瘤細胞有特異性殺傷作用，對正常細胞的毒副作用較小，具有臨床應(yīng)用價值。（三）細胞凍存和復(fù)蘇的方法細胞凍存（1）概述目前，細胞凍存最常用的技術(shù)是

26、液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。如細胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體臉由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞臉上的類脂蛋白復(fù)合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內(nèi)容物丟失。如果細胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細胞內(nèi)水分，減少細胞內(nèi)冰

27、晶的形成。采用甘油或二甲基亞楓作保護劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度人，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號（2）細胞凍存操作步驟細胞：選對數(shù)生長期細胞，收集細胞24小時前換液一次。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中

28、離心（1000r/min,10分鐘）。制液：去上清液，加入含20%小牛血清的完全培養(yǎng)基，于4C預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻,細胞濃度為3X1061X107/mL之間分裝:將上述細胞分裝于安甑或?qū)Ｓ美鋬鏊芰瞎苤校碴笛b11.5mL在火焰噴燈上対II,封II處要完全封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細胞名稱和凍存口期，同時作好登記（口期、細胞種類及代次、凍存支數(shù)）。封II：用塑料瓶時擰緊瓶II即可；如用火焰封閉瓶II后，仔細檢查，定要封嚴(yán)，必要時可浸入藍色液中觀察，為安全起見，把瓶縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發(fā)生爆炸傷人；紗袋一

29、端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細胞名稱，凍存口期，以便口后查找。凍存：置于液氮容器頸II處存放過夜，次口轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安甑置入4C冰箱中23小時，再移至冰箱冷凍室內(nèi)34小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時，最后沉入液氮中。細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，最好取出一只安甑細胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。（3）常用冷凍設(shè)備和材料常用的細胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規(guī)格有35L3和50L3兩種。使用時要注意：一般兩周需充液氮一次，至少一個月充氮一次。液氮溫度達-196C,使用時注意勿讓液氮濺到皮膚上，以免

30、引起凍傷。液氮容器為雙層結(jié)構(gòu)，中間為真空層，瓶II有雙層焊接處，防止焊接部裂開。在裝入液氮時，要注意緩慢小心，并用厚紙卷筒或特制漏斗作引導(dǎo)，使液氮直達瓶底，如有專用液氮灌注裝置則更好。若為初次使用，加液氮時更要緩慢，以免溫度驟降而使容器損壞。細胞凍存時常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%20%的血清培養(yǎng)液，DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（121C蒸汽高壓消毒），2mL安甑（或?qū)Ｓ眉毎麅龃婀埽?、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。復(fù)蘇方法（1）細胞復(fù)蘇的原則在實際操作中，凍存細胞要進行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細

31、胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。（2）主要操作步驟從液氮罐中取出安剖；有時因安剖未封嚴(yán)，浸入了液氮，取出后因安剖內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸，因此應(yīng)帶有防護眼睛和手套。姓名系年級組別同組者科目細胞生物學(xué)實驗題目動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別學(xué)號迅速放入盛有36C37C水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其完全融化。剪開紗布II袋，取出安剖，用70%酒精擦拭消毒后，凈化臺上打開蓋，用吸管吸出細胞懸液，裝入離心管中，再補加10ml培養(yǎng)液，吹打使細胞懸浮。低速離心（5001000轉(zhuǎn)/分）5-10分鐘，去除上清液后再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心。加入培養(yǎng)液適當(dāng)桶釋，接種濃度1X109/L,再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次口更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。觀察生長情況。若細胞密度較