單克隆抗體與基因工程抗體制備技術(shù)

1、第四章單克隆抗體與基因工程抗體制備技術(shù)本章考點1.概念雜交瘤技術(shù)基本原理雜交瘤抗體的制備技術(shù)基因工程抗體由雜交瘤細胞產(chǎn)牛的針對抗原分子上某一單個抗原決定簇的抗體，稱為單克降抗體。其理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強、且來源容易。傳統(tǒng)的方法是將抗原注入動物，由動物體內(nèi)B細胞產(chǎn)生的抗體。由于多數(shù)天然的抗原分子具有多種抗原決定簇，每一種決定簇可激活具有相應抗原受體的B細胞產(chǎn)生針對某一抗原決定簇的抗體。因此，將抗原注入機體后，刺激多個B細胞克降所產(chǎn)牛的抗體是針對多種抗原決定簇的混合抗體，故稱為多克降抗體（PoAb）。第一節(jié)雜交瘤技術(shù)基本原理單克隆是指利用在細胞融合基礎上的B細胞雜交瘤

2、技術(shù)。雜交瘤技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細胞淋巴細胞）的主要特征是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續(xù)培養(yǎng)，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即具有所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才能具有持續(xù)培養(yǎng)的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克降。一、B細胞雜交瘤技術(shù)細胞的選擇和融合：雜交瘤技術(shù)的目的是制備對抗原特異性的單克隆抗體，所以融合一方必須是經(jīng)過抗原免疫的B細胞，通常選用被免疫動物的脾細胞，脾淋巴細胞的主要特征是抗

3、體分泌功能。融合細胞另一方則要求在培養(yǎng)條件下的永生性，只有腫瘤細胞才是具備這一條件，所以選擇同一體系的骨髓瘤細胞,因多發(fā)性骨髓瘤是B細胞系惡性腫瘤，其特點是穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌免疫球蛋白及細胞因子、融合率高、是次黃嘌吟磷酸核酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾細胞融合對象。選擇培養(yǎng)基的應用：細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有二種關鍵成分：次黃嘌吟（H）、氨甲蝶吟（A）、胸腺嘧啶核苷（T）.所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。次黃嘌吟和胸腺嘧啶核苷是細胞DNA合成的途徑；氨甲蝶吟（A）是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成DNA，而融合作用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選取出的缺乏HGPRT細胞株

4、，不能在該培養(yǎng)基上生長，只有融合細胞具有親代雙方遺傳性能，才能在HAT培養(yǎng)基上長期存活與繁殖。有限稀釋與抗原特異性的選擇：細胞融合是一個隨機的過程，需在融合細胞抗體篩選的基礎上進行特異性篩選。將融合細胞進行充分稀釋，進行克隆化處理，再將陽性細胞進行再次克隆化，應用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標抗原的抗體陽性細胞株進行增殖，再進行冰凍，體外培養(yǎng)或動物腹腔接種。圖13雜交瘤技術(shù)操作主要流程示意圖二、T細胞雜交瘤T細胞雜交瘤可分為小鼠細胞雜交瘤和人T細胞雜交瘤。其基本過程是將激活的細胞與酶缺陷型淋巴瘤細胞融合，通過有限克隆稀釋，獲得特異性表達細胞受體（TCR）或其他功能的雜交瘤細胞。其主要步

5、驟為：淋巴瘤細胞系的選擇要求有以下特征：（1）體外能無限、快速生長。（2）融合率高。（3）不分泌淋巴因子和殺傷功能。（4）缺乏某一特異性的細胞表面抗原或受體。（5）HGPRT酶缺陷型。特異性細胞的制備與活化：主要有可溶性抗原誘導激活的細胞、同種反應性細胞、人的特異性細胞等。T細胞雜交瘤的篩選。三、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)雜交瘤細胞形成后的初期很不穩(wěn)定，為確保單克隆抗體的專一性及避免其他陰性細胞對其生長影響，必須將陽性雜交瘤細胞進行單細胞分離培養(yǎng)，產(chǎn)生單克隆雜交瘤細胞，經(jīng)2一3次檢測均為陽性的雜交瘤單個細胞，才能進行克隆化培養(yǎng)?？寺』囵B(yǎng)后的陽性雜交瘤細胞應及時凍存，最好保存千196C液氮中。

6、第二節(jié)單克隆抗體的制備技術(shù)利用雜交瘤技術(shù)制備McAb基本原理是根據(jù)三個原則：（1）淋巴細胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學說；（2）雜交瘤細胞保持雙方親代細胞特性化；（3）然后大量培養(yǎng)增殖，制備所需的McAb。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動物體內(nèi)誘生方法：目前McAb治療用或體外診斷用的多數(shù)尚采用這一方法制備。先在小鼠腹腔注射液體石蠟或福氏不完全佐劑，一周后將雜交瘤細胞懸液注射腹腔，1一2周后，無菌抽取腹水，離心取上清液即可。體外培養(yǎng)法：這是實驗室制備的方法。將雜交瘤細胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待培養(yǎng)液顏色改變或細胞過多開始死亡時，收集上清液，離心去掉碎片及細胞即可。另一種是雜交瘤細胞高密度培養(yǎng)法。二、單克隆抗體的純化及

7、鑒定目前常用的純化方法有鹽析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取等方法。單克隆抗體性質(zhì)鑒定方法如放免測定、補體介導溶血試驗、ELISA、免疫酶、玫瑰花結(jié)形成試驗等，最常用的為ELISA方法，一般先作定性試驗，如陽性，進一步作定量檢測。第三節(jié)單克隆抗體醫(yī)學中的應用單克隆抗體目前全世界已研制成數(shù)以萬計，在生物及醫(yī)學界有著廣泛用途，在醫(yī)學中已經(jīng)用于：1作為診斷試劑，用于診斷各類病原體，目前這是McAb應用最多的領域之一。腫瘤特異性抗原和相關抗原的檢測：用于腫瘤的診斷、分型及定位。檢測淋巴細胞表面標志物，用于區(qū)分細胞亞群和細胞分化階段?？乖⒘砍煞值臋z測及對酶類、激素、維生素、藥物等的檢測。在防治工作中

8、如惡性腫瘤的治療，“生物導彈”的研制等都有廣泛前景。研究工作中用作“探針”，確定大分子生物物質(zhì)在細胞中的分布及位置。用于抗原物質(zhì)的提取及純化。第四節(jié)基因工程抗體技術(shù)由于雜交瘤單克隆抗體為異源性蛋白，應用于人時易產(chǎn)生抗小鼠抗體，基因工程抗體通過基因工程技術(shù)改造現(xiàn)有優(yōu)良的鼠單克隆抗體基因。盡量減少抗體中鼠源成分，保留原有抗體特異性，從而創(chuàng)造出一種新型抗體。一、人源化抗體人源化抗體主要指鼠源單克隆抗體以基因克隆及DNA重組技術(shù)改造，重新表達的抗體，其大部分氨基酸序列為人源序列取代，基本保留親本鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了其異源性，有利應用于人體。人-鼠嵌合抗體此抗體為通過基因工程技術(shù)，將人

9、IgGC區(qū)與鼠IgV區(qū)連接，導入細胞內(nèi)表達制備而成的抗體?？贵w的表面修飾，使Fv表面人源化。二、小分子抗體此為分子量小，具有抗原結(jié)合功能的分子片段，包括Fab,Fv,單鏈抗體，單區(qū)抗體等。此種抗體分子量小，可在大腸桿菌等原核細胞表達，在人體內(nèi)穿透力強，有利于疾病的治療。三、抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到多樣性生物功能的融合蛋白，如：1含F(xiàn)v段的抗體融合蛋白：將Fv與某些毒素、酶、細胞因子基因拼連，通過這些抗體的引導，可將其生物活性物質(zhì)導向靶細胞特定部位，所謂“生物導彈”。2嵌合受體：將ScFv與某些細胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表達于細胞表面，稱為嵌合受體，由于其介導

10、的殺傷效應不受MHC限制，在過繼性免疫治療中有潛在應用價值。含F(xiàn)c的抗體融合蛋白：CD4分子細胞膜外部分與Fc融合后由真核細胞表達。此融合蛋白能競爭結(jié)合HIV，阻斷HIV對敏感細胞的感染；還可介導ADCC及CDC，可通過胎盤。四、雙特異性抗體雙特異性不同的兩個小分子抗體連接在一起可得到雙特異性抗體。雙特異性抗體能同時結(jié)合兩種抗原，因而可介導標記物與靶抗原結(jié)合或某些效應因子定位于靶細胞，在免疫學檢測中可簡化操作步驟，提高檢驗質(zhì)量；應用雙特異性抗體介導的藥物殺傷效應可用于腫瘤等的治療。五、抗體庫技術(shù)抗體庫技術(shù)是指基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到質(zhì)粒表達載體，通過大腸桿菌直

11、接表達有功能的抗體分子片段，最后篩選到特異的可變區(qū)基因，現(xiàn)有組合抗體庫技術(shù)及菌體抗體庫技術(shù)。習題26制備單克隆抗體常選用小鼠的哪類細胞作為飼養(yǎng)細胞A中性粒細胞K細胞肥大細胞成纖維細胞腹腔細胞粹答疑編號500734040101正確答案E習題27目前實驗室常用的克隆化方法是顯微鏡操作法有限稀釋法軟瓊脂平板法流式細胞儀篩選法免疫法需答疑編號500734040102正確答案B答案解析將融合細胞進行充分稀釋，進行克隆化處理，再將陽性細胞進行再次克隆化。習題28能在HAT培養(yǎng)基生長繁殖的細胞是A小鼠脾細胞小鼠骨髓瘤細胞飼養(yǎng)細胞雜交瘤細胞免疫活性細胞需答疑編號500734040103正確答案D答案解析細胞融

12、合的選擇培養(yǎng)基中有三種關鍵成分：次黃嘌吟（H）、氨甲蝶吟（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。只有融合細胞具有親代雙方遺傳性能，才能在HAT培養(yǎng)基上長期存活與繁殖，而骨髓瘤細胞是次黃嘌吟磷酸核酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）的缺陷株，不能生長。第五章凝集反應本章考點1.概述直接凝集反應間接凝集反應第一節(jié)概述細菌、紅細胞等顆?？乖?，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，它們與相應抗體（或抗原）在適當電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱凝集反應。凝集反應分為兩個階段：抗原抗體的特異性結(jié)合；出現(xiàn)可見的顆粒凝聚。凝集反應的特點：凝集試驗是一個定性的檢測方法，即根據(jù)凝集

13、現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陰性或陽性也可以進行半定量檢測，即將抗體作一系列稀釋，與抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集的最高稀釋倍數(shù)作為其效價或滴度由于凝集反應靈敏度高、方法簡便，因而在臨床檢驗中被廣泛應用。第二節(jié)直接凝集反應直接凝集反應：其原理是細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原，在適當?shù)碾娊赓|(zhì)參與下可直接與相應抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱直接凝集反應。參加凝集反應的抗原稱凝集原，抗體則稱為凝集素。從方法上來講有玻片法和試管法兩類。玻片法凝集主要用于抗原的定性分析，短時間便能觀察結(jié)果，一般用來鑒定菌種或分型；也用于人類AB0血型的測定。試管凝集反應是用定量抗原懸液與一系列遞度倍比稀釋的待檢血清混合，保溫靜置后，根據(jù)每管內(nèi)顆粒

14、凝集的程度，以判斷待檢血清中有無相應抗體及其效價，可以用來協(xié)助臨床診斷或流行病原調(diào)查研究。例如Wida1反應、Well-Felix反應、輸血時也常用于受體和供體兩者間的交叉配血試驗。第三節(jié)間接凝集反應間接凝集反應是將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小的顆粒載體表面，然后與相應抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應。根據(jù)致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反應的方式，間接凝集反應分為4類：正向間接凝集反應；反向間接凝集反應；間接凝集抑制反應；協(xié)同凝集反應。圖14（正向）間接凝集反應（查抗體）拔佯雀Si圖15（反向）間接凝集反應（查抗原）拉怎益十頓程臨:賈首

15、*0疥圖16間接凝集抑制試驗（查抗原）（上圖為標本中含有待測抗原，下圖為標本中無待測抗原，注意凝集說明標本中沒有待測抗原）間接凝集反應適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測。以載體來分，常用的為紅細胞、膠乳顆粒及明膠顆粒等。常用的試驗有：間接血凝試驗：其原理是將抗原（或）抗體包被于紅細胞表面，成為致敏載體，然后與相應的抗體（或抗原）結(jié)合，從而使紅細胞被動地凝聚在一起，出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象。間接血凝試驗可分為三類：紅細胞包被抗原，用以檢測抗體的血凝，稱為正向間接血凝反應（PHA）;紅細胞包被抗體，用以檢測抗原的血凝反應，稱為反向間接血凝反應（RPHA）;先將可溶性抗原（或抗體）與相應的抗體（或抗原）混合

16、然后再加入抗原（或抗體）致敏的紅細胞，則能抑制原先的血凝現(xiàn)象稱為正向（或反向）間接血凝抑制試驗。間接血凝抑制試驗可用于檢測抗體、自身抗體、變態(tài)反應性抗體也可測定抗原。間接血凝試驗：紅細胞沉積于管底；1+：紅細胞沉積于管底，周圍有散在少量凝集；2+：紅細胞形成片層凝集，面積較小，邊緣較松散；3+：紅細胞形成片層凝集，面積多于2+；4+：紅細胞形成片層凝集，均勻布滿孔底，或邊緣皺縮如花邊狀。膠乳凝集試驗：膠乳凝集試驗也是一種間接凝集試驗，所用載體為聚苯乙烯膠乳，是一種直徑約為0.8“m大小的圓形顆粒，帶有負電荷，可物理性吸附蛋白分子，但這種結(jié)合牢固性差。膠乳凝集試驗分試管法和玻片法兩種。膠乳凝集試

17、驗用于檢測抗溶血素0、RF等。明膠凝集試驗：將全病毒抗原及重組抗原吸附在粉紅色明膠顆粒上，來檢測相應抗體。間接凝集反應具有快速、敏感、操作簡便、無需特殊的實驗設備等特點，而且能用于抗原或抗體的測定，因此在臨床檢驗中廣為應用。（1）抗原的檢測：反向間接凝集試驗用于檢測病原體可溶性抗原，也可用于檢測各種蛋白質(zhì)成分。（2）抗體的檢測：可用于檢測細菌、病毒和寄生蟲等感染后產(chǎn)生的抗體，例如間接凝集試驗或明膠顆粒凝集試驗用于檢測抗人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體以診斷艾滋病、乳膠凝集試驗用于檢測抗溶血素O等。第四節(jié)自身紅細胞凝集試驗其基本原理是抗人0型紅細胞的單克隆抗體能與任何種血型的紅細胞結(jié)合，但不引起凝

18、集反應，這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體，可用于檢測標本中的抗原；如與特異性抗原連接，則可用于檢測標本中的抗體。這一試驗與上述血凝試驗的區(qū)別在于反應中的紅細胞是未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細胞，因此反應中的標本為受檢者的全血。自身紅細胞凝集可用于HIV抗體、HBsAg的檢測，靈敏度與間接血凝試驗相仿。第五節(jié)抗人球蛋白參與的血凝試驗抗人球蛋白參與的血凝試驗，稱Coombs試驗，是檢測抗紅細胞不完全抗體的一種很有用的方法。包括直接Coombs試驗和間接Coombs試驗，分別檢測紅細胞上的不完全抗體和游離在血清中的不完全抗體。Coombs試驗除廣泛應用于血液病的檢測，如自身免疫性溶血性貧血、藥物

19、誘導的溶血、新生兒溶血癥等。還可采用專一特異性的抗球蛋白的血清如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗補體血清等，分析結(jié)合于紅細胞上的不完全抗體的免疫球蛋白亞類。不堂金拭律it球査白憂佯嗦聘鯨圖18Coombs試驗（上圖為直接試驗，下圖為間接試驗）習題29ABO血型鑒定最常采用的方法是A正向間接凝集反應B反向間接凝集反應玻片凝集法試管凝集法E間接凝集抑制反應粹答疑編號500734050101正確答案C（屬于直接凝集反應）習題30外裴試驗最常采用的方法是A正向間接凝集反應B反向間接凝集反應玻片凝集反應試管凝集法E間接凝集抑制反應粹答疑編號500734050102正確答案D習題31SPA協(xié)同凝集試驗中的抗體類別是IgMIgGIgAIgEIgD需答疑編號50073