1.2基因工程的基本操作順序5

1、1、基因工程至少需要哪三種工具？2、這三種工具分別起什么作用？溫故知新：1.2 基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定問題1一：目的基因的獲取 如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。 1.目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的基因什么是目的基因？2、也可以是具有調(diào)控作用的因子獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、人工合成目的基因已知序列未知序列(一)從基

2、因文庫中獲取目的基因 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫1.基因文庫概念2.基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢? 根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA、基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。(一)從基因文庫中獲取目的基因3.基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)?限制酶一定大小的DNA片段將DNA片段 與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文

3、庫4.cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體 連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA 聚合酶導(dǎo)入受體菌 中儲(chǔ)存反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。cDNA合成過程是：第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA 互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈 降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用 下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。問題2

4、為什么用生物發(fā)育某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄得的DNA只有這種生物的部分基因？某個(gè)時(shí)期的發(fā)育是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果兩種基因文庫的主要區(qū)別如下表（課本P10）文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動(dòng)子無有基因中內(nèi)含子無有基因多少部分基因全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以總結(jié)1、概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng)在生 物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù) 3、條件：2、原理：_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因模板（目的基因）原料(脫氧核苷酸)引物（一小段單鏈DNA）DNA聚合酶（耐高溫）溫度控制4、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。6、結(jié)果

5、 。5、擴(kuò)增形式：指數(shù)形式（2n）在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因7、過程：a、變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作 用下，_斷裂，形成_b、復(fù)性（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物開始進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成與 模板互補(bǔ)的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示細(xì)胞內(nèi)復(fù)制 .VS. PCR擴(kuò)增DNA母鏈4種脫氧核苷酸Taq DNA聚合酶引物（2個(gè)snDNA）溫度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物酶DNA連接酶DNA增殖4）特點(diǎn):半保留復(fù)制

6、邊解旋邊復(fù)制(不用DNA連接酶)半保留復(fù)制全解旋再復(fù)制（三）通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀推測(cè)推測(cè)合成前提：基因比較小、核苷酸序列已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因問題43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_獲取目的基因的三種方法應(yīng)用1、如果知道目的基因兩端的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用_ 2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用_PCR技術(shù)擴(kuò)增化學(xué)方法人工合成從基因文庫獲取的方法二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2組成：目的

7、基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因等啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口四個(gè)黏性末端DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端跟蹤訓(xùn)練(2012年江蘇無錫高二檢測(cè))如圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列有關(guān)基因工程中載體的說法錯(cuò)誤的是()A基因工程的核心步驟是基因表達(dá) 載體構(gòu)建B任何基因表達(dá)載體的構(gòu)建都是一 樣的，沒有差別C圖中啟動(dòng)子位于基因的首端，是

8、 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位D抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo) 記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是 否導(dǎo)入了目的基因B三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉通道法顯微注射法Ca2處理法受體細(xì)胞一般是體細(xì)胞受精卵一般原核細(xì)胞4、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法為什么動(dòng)物細(xì)胞要用受精卵做受體細(xì)胞？全能性受限制（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸

9、子植 物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。 原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)過程：（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞 操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力 ，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。 鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.64um 。 適用：?jiǎn)巫尤~植物基因槍法（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花

10、粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞 特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。 例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（我國）（4）、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物（5）、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞 （改變細(xì)胞壁的通透性）過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合從細(xì)胞器的功能上分析，若通過基因工程生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？【提示】不可以，糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細(xì)胞中，大腸

11、桿菌是原核生物，細(xì)胞中不含有這兩種細(xì)胞器。問題3導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝 入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少，且有的會(huì)攝入載體-載體，目的基因-目的基因類型目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？ 不一定，需要檢測(cè)問題4問題5練習(xí)采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是( ) 將毒素蛋白注射到棉受精卵中將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)人細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵 A、 B、 C、 D、C檢查是否成功分子水平個(gè)體水平：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法DNA分子雜交分子雜交抗原抗體雜交 四、目的基因的檢測(cè)與鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的含有目的基因DNA片段方法DNA分子雜