《基因工程作業(yè)》word版

1、 基因工程的載體和工具酶【教學(xué)時數(shù)】9小時【教學(xué)目錄與學(xué)時分配】2.1 載體（6） 質(zhì)粒載體 噬菌體載體 其他載體 穿梭載體與表達載體 2.2 工具酶（3） 限制性內(nèi)切核酸酶 DNA聚合酶和Klenow大片段 DNA連接酶 堿性磷酸酶2.2.5末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶【教學(xué)目的】讓學(xué)生掌握什么是基因工程的載體，有哪些典型的基因工程載體，哪些常用的基因工程工具酶，什么情況下使用工具酶等基本常識?！窘虒W(xué)重點】常用基因工程載體的結(jié)構(gòu)、工具酶的用途?！窘虒W(xué)難點】基因工程載體的結(jié)構(gòu)和使用【教學(xué)方式】多媒體講解結(jié)合啟發(fā)討論式教學(xué)第一節(jié) 載體一、質(zhì)粒載體（3）【教學(xué)重點】質(zhì)粒載體的構(gòu)建與標(biāo)記基因；克隆質(zhì)粒載體的

2、克隆過程【教學(xué)難點】質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)【教學(xué)過程與內(nèi)容】載體是指運載外源DNA有效的進入受體細胞內(nèi)的工具。載體同外源DNA在體外重組成DNA重組分子，在進入受體后形成一個復(fù)制子，即形成在細胞內(nèi)能獨自進行自我復(fù)制的遺傳因子。作為載體必須滿足的條件：有多種限制性內(nèi)切酶的切點，但每一種酶最好只有一個切點；外源DNA插入以后載體在受體細胞中自我復(fù)制；有便于選擇的標(biāo)記基因；具有促進外源DNA表達的調(diào)控區(qū)。 質(zhì)粒載體質(zhì)粒是在許多種細菌中發(fā)現(xiàn)的染色體外的遺傳因子。它是閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主復(fù)制，但要利用寄主細胞復(fù)制染色體的同一組酶系。有某些基因，如抗藥性基因，對寄主的生長是有利的

3、。質(zhì)粒的復(fù)制分松弛型和嚴謹型兩種。松弛型質(zhì)粒是指質(zhì)粒的復(fù)制跟細菌染色體的復(fù)制不同步，一般在一個菌體內(nèi)能復(fù)制10-200 拷貝；嚴謹型質(zhì)粒是指質(zhì)粒復(fù)制跟細菌染色體同步，一般含有1-10 拷貝。一、質(zhì)粒的基本特性1質(zhì)粒的復(fù)制 通常一個質(zhì)粒含有一個與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)（整個遺傳單位定義為復(fù)制子）。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可決定復(fù)制的方式，如滾環(huán)復(fù)制和 復(fù)制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個來源于 pMB1 質(zhì)?；?ColE1 質(zhì)粒的復(fù)制起始位點。 2質(zhì)粒的拷貝數(shù) 質(zhì)?？截悢?shù)分為嚴謹型與松馳型。嚴謹型質(zhì)粒每個細胞中拷貝數(shù)有限，大約 1 幾個；松

4、馳型質(zhì)?？截悢?shù)較多，可達幾百。 3質(zhì)粒的不相容性 兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及 DNA 限制系統(tǒng)時出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。兩個不相容性質(zhì)粒在同一個細胞中復(fù)制時，在分配到子細胞的過程中會競爭，隨機挑選，微小的差異最終被放大，從而導(dǎo)致在子細胞中只含有其中一種質(zhì)粒。4轉(zhuǎn)移性 質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下，很多質(zhì)粒可以通過稱為細菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。它需要移動基因 mob ，轉(zhuǎn)移基因 tra ，順式因子 bom 及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點 nic。二、標(biāo)記基因（一） 選擇標(biāo)記抗生素抗性

5、基因是目前使用最廣泛的選擇標(biāo)記。1氨芐青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） 氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標(biāo)記，絕大多數(shù)在大腸桿菌中克隆的質(zhì)粒載體帶有該基因。青霉素可抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合并抑制其活性，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進入細菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化 -內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。2四環(huán)素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） 四環(huán)素可與核糖體 30S 亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。四環(huán)素抗性基因編碼一個由

6、399 個氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進入細胞。 pBR322 質(zhì)粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外，還帶有四環(huán)素抗性基因。3氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 氯霉素可與核糖體 50S 亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。cat 基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，一個四聚體細胞質(zhì)蛋白（每個亞基 23kDa）。在乙酰輔酶 A 存在的條件下，該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結(jié)合。4卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 卡那霉素和新霉素

7、是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因?qū)嶋H就是一種編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH（3）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可使這兩種抗生素磷酸化，從而干擾了它們向細胞內(nèi)的主動轉(zhuǎn)移。在細胞中合成的這種酶可以分泌至外周質(zhì)腔，保護宿主不受這些抗生素的影響。（二）篩選標(biāo)記 篩選標(biāo)記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個外源 DNA 片段插入到一個質(zhì)粒載體上時，可通過該標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。1-互補（-complementation） -互補是基于在兩個不同的缺陷 -半乳糖苷酶之間可實現(xiàn)功能互補而建立的。大腸桿菌的乳糖 la

8、c 操縱子中的 lacZ 基因編碼 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因發(fā)生突變，則不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了編碼 -半乳糖苷酶中第 11-41 個氨基酸的 lacZ 基因，無酶學(xué)活性。對于只編碼 N-端 140 個氨基酸的 lacZ 基因 （稱為 lacZ） ，其產(chǎn)物也沒有酶學(xué)活性。但這兩個無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時，可恢復(fù) -半乳糖苷酶的活性，實現(xiàn)基因內(nèi)互補。 在 lacZ 編碼區(qū)上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個堿基對的多克隆位點），不影響 -半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補。但是，若在該 DNA 小片段中再插入一個片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無

9、-互補能力的 -半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZM15 放在 F 質(zhì)粒上, 隨宿主傳代； lacZ 放在載體上, 作為篩選標(biāo)記。 2插入失活 通過插入失活進行篩選的質(zhì)粒主要有 pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，導(dǎo)致 tetr 基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質(zhì)粒DNA的制備與注意事項：細菌的培養(yǎng)：從瓊脂平板上挑取單菌落接入5ml含適合抗生素

10、的LB培養(yǎng)基中，于37搖床中振蕩培養(yǎng)過夜。保種：取80%滅菌甘油300ul加入1ml菌種中冷凍保存。質(zhì)粒提取：（1）1.5ml過夜培養(yǎng)物倒入EP管，5000rpm/10min，棄上清。（2）加入150ul冰預(yù)冷的solution，vortex，使菌分散重懸。（3）加入300ul solution，來回顛倒4-6次，冰上5min。（4）加入225ul solution，來回顛倒4-6次，冰上5min。（5）6000rpm/15min（或12000rpm/5min）。 （6）吸上清移入新EP管，等體積酚/氯仿抽提一次，vortex，12000rpm/15min。（7）吸上清移入新EP管，等體積氯仿

11、抽提，vortex，12000rpm/5min。（8）重復(fù)步驟7）1-2次。（9）吸上清移入新EP管，0.7倍體積異丙醇沉淀，vortex，12000rpm/15min。（10）棄上清，1ml70%酒精洗滌1-2次，12000rpm/5min。（11）棄上清，空氣中干燥。（12）加入10-20ul滅菌ddH2O溶解。（13) 加入適量RNaseA，37溫育。如果要用限制酶酶切DNA，緩沖液和限制酶可與RNaseA同時加入，同時進行反應(yīng)。提質(zhì)粒DNA時,溶液I,II,III的作用:n 溶液I: 溶菌液,含溶菌酶,使細菌壁溶解,裂解細菌; n 溶液II: NaOH-SDS液,強堿使質(zhì)粒DNA和染色

12、體DNA變性, 而SDS使蛋白質(zhì)解聚沉淀. n 溶液III, 酸性高鹽溶液,使質(zhì)粒DNA復(fù)性,但高鹽使染色體DNA變性沉淀,從而使染色體DNA和質(zhì)粒DNA分離.質(zhì)粒DNA的純化n RNA酶去RNAn SDS-蛋白復(fù)合物n 蛋白酶K去蛋白質(zhì)n 酚-氯仿抽提n 純化試劑盒n 紫外分光光度計測A260與A280值：18 或20 SDS的作用n 十二烷基硫酸鈉，離子型表面活性劑n 溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白n 解聚核蛋白n 與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物n 有毒，是一種刺激物，避免吸入粉末酚與氯仿的使用n 酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使

13、蛋白失去水合狀態(tài)而變性，離心后沉淀在下層，而DNA 水溶液在上層。n 雖然酚比氯仿變性效果好些，但酚與水相有一定程度的混溶，而氯仿與水不混溶，所以混合使用酚與氯仿比較好。n 酚要用Tris-HCl緩沖液飽和，并調(diào)PH到8，使DNA更穩(wěn)定，獲得RNA含量較少的DNA樣品。質(zhì)粒DNA沉淀n 二倍體積的無水乙醇與DNA相混合。使乙醇的終含量占67%左右。室溫靜置30分鐘。n 乙醇沉淀時，加NaAc or NaCl至終濃度為01-025M，是為了中和DNA分子在堿性條件下所帶的負電荷，減少DNA分子同性電荷的相斥力。n 06倍體積的異丙醇沉淀，-20C半小時。DNA分離n 瓊脂糖凝膠電泳n 聚丙烯酰胺

14、凝膠電泳n 氯化銫密度梯度離心DNA濃度檢測n gn EB-標(biāo)準DNA濃度比較: 1 ngn 紫外分光光度計測A260: 0.1-1 ideal, 0.05-1.5 accepted n 純度:分光光度計不但能確定核酸的濃度，還可以通過A260/A280估計核酸純度。純DNA其比值為1.8，純RNA為2.0。如比值高于1.8，說明DNA樣品中含RNA，而樣品中的酚和蛋白質(zhì)將會導(dǎo)致比值降低。在紫外透射儀下看DNA時，DNA亮度與哪些因素有關(guān)？n DNA濃度n DNA大小n 波長n 純度n EB量等有關(guān) 四、質(zhì)粒載體的種類（一）克隆載體 克隆載體主要用于擴增或保存 DNA 片段，是最簡單的載體。1

15、pBR322 pBR322質(zhì)粒的大小為 4361bp ， GenBank 注冊號為 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多個單一位點，具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr），其質(zhì)粒復(fù)制區(qū)來自 pMB1。目前使用廣泛的多質(zhì)粒載體幾乎都是由此發(fā)展而來的。利用四環(huán)素抗性基因內(nèi)部的 BamH 位點來插入外源 DNA 片段，可通過插入失活進行篩選。 pBR322 質(zhì)?？寺⊥庠椿虻倪^程，見幻燈片課件中的圖。2pUC18 和 pUC19 pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注

16、冊號為 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而來，其中 lacZ （MSC）來自 M13mp18/19。 這兩個質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣 的，只是多克隆位點的排列方向相反。這些質(zhì)粒缺乏控制拷貝數(shù)的 rop 基因，因此其拷貝數(shù)達 500-700 。 pUC 系列載體含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細胞中可表現(xiàn) -互補作用。因此在多克隆位點中插入了外源片段后，可通過 -互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。 （二）穿梭載體穿梭載體是指具有多個復(fù)制子能在兩個以上的不同宿主細胞復(fù)制和繁殖的載體。(三)表達載體 表達載體是指能將

17、目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生產(chǎn)的載體.表達載體的三個系統(tǒng):DNA復(fù)制及質(zhì)粒DNA的篩選: 有DNA復(fù)制起點ori, 及Amp, Tet抗性基因目的基因的轉(zhuǎn)錄:這一系統(tǒng)包括啟動子,抑制物基因和轉(zhuǎn)錄終止子.啟動子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.蛋白質(zhì)的翻譯:包括核糖體識別位點SD,翻譯起始密碼子和終止密碼子.表達載體又分為完整蛋白表達載體和融合蛋白表達載體兩類。 該類載體是在常規(guī)克隆載體的基礎(chǔ)上衍生而來的，主要增添了強啟動子，以及有利于表達產(chǎn)物分泌、分離或純化的元件。 【思考題】1. 質(zhì)粒的克隆過程如何？2. 質(zhì)?？寺∑未笮∈嵌嗌伲?. 質(zhì)粒的克隆表現(xiàn)形式是什么？ 第一節(jié)

18、載體二、 噬菌體載體與其他類型載體（3）【教學(xué)重點】噬菌體載體的改建；柯斯載體與人工染色體的結(jié)構(gòu)組成特點【教學(xué)難點】噬菌體與其他載體的克隆過程【教學(xué)過程與內(nèi)容】（一） 噬菌體l噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進入溶源狀態(tài)，也可進入裂解循環(huán)。 l 噬菌體基因組為長度約為 50kb 的雙鏈 DNA 分子，實際大小為 48502bp （GenBank 注冊號為：J02459 或 M17233）。在噬菌體顆粒內(nèi)，基因組 DNA 呈線性，其兩端的 5 末端帶有 12 個堿基的互補單鏈粘性末端，叫COS位點。 12 個堿基的序列為 5-GGGCGGCGACCT-3。當(dāng) l 噬菌體 DNA

19、 進入宿主細胞后，COS位點兩端互補單鏈通過堿基配對形成環(huán)狀 DNA 分子，而后在宿主細胞的 DNA 連接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封閉的環(huán)狀 DNA 分子，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的模板。同時COS位點也是噬菌體包裝蛋白的識別位點，包裝范圍在35kb51kb。l噬菌體的基因組可分為3個區(qū)域：右側(cè)的DNA復(fù)制與調(diào)控及裂解相關(guān)區(qū)域，左側(cè)是頭部蛋白和尾部蛋白基因區(qū)域，中間為非必需區(qū)，可被外源基因取代。野生型 噬菌體基因組 DNA 為 48kb ，若用外源 DNA 片段完全替換可取代區(qū)，外源 DNA 片段的大小將在 9-23kb 范圍內(nèi)。 噬菌體的選擇標(biāo)記：lacZ 基因lacZ基因也可用于 噬菌體載體

20、，通過插入或替換載體中的 -半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通過噬菌斑的顏色，篩選重組噬菌體。噬菌體載體的類型：噬菌體載體有兩種類型：插入型和置換型。插入型噬菌體是由于改建后的噬菌體較野生型短，所以可插入外源DNA。而且缺失的片段越長，插入的片段越大。置換型噬菌體基因組分三個區(qū)域：左側(cè)區(qū)域包括外殼蛋白基因，約20kb；中間區(qū)域18kb，為不重要的替換區(qū)，可被外源基因替換；右側(cè)區(qū)域含有復(fù)制及裂解基因，約12kb。 DNA與外源DNA之和必須在39-53kb之間，所以可插入7-21kb的外源DNA片段。 （二）單鏈M13噬菌體：M13絲狀噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，其基因組為單

21、鏈環(huán)狀DNA分子，全長6.5 kb。M13 感染宿主菌以后，單鏈DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制形式的DNA，當(dāng)復(fù)制200-300拷貝以后，又只合成單鏈DNA，最后包裝成單鏈噬菌體粒子。 M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由 6407 的堿基組成 （GenBank 注冊號為 V00604） ?；蚪M 90% 以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有 11 個編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個堿基。較大的間隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達和 DNA 合成的元件。M13單鏈噬菌體主要用于需要單鏈DNA做模板時，如DNA測序。M13噬菌體基因組中主要含有與復(fù)制有關(guān)的遺傳信息，只有一段由5

22、07個核苷酸組成的序列可被替換，因此M13噬菌體載體只能插入約300-400bp的外源片段。 (三) 柯斯質(zhì)粒載體：1978年由Collins和 Hohn改建的一種新型的大腸桿菌克隆載體，用正常的質(zhì)粒與噬菌體的cos位點構(gòu)成。一般長為4-6kb。含有Ampr和Tetr抗性基因。其上的cos位點可識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度上相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA片段的長度可大于40 kb，從而大大增加了載體的攜帶能力。粘粒的結(jié)構(gòu)特征和用途 粘粒（cosmid）實際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos 序列的

23、質(zhì)粒。粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點（colE1），抗性標(biāo)記（ampr）， cos 位點，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用來克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可達 45kb 。粘粒載體的工作原理 粘粒克隆的主要原理類似 l 噬菌體載體。在外源片段與載體連接時，粘粒載體相當(dāng)于 l 噬菌體載體的左右臂，cos 位點通過粘端退火后，再與外源片段相間連接成多聯(lián)體。當(dāng)多聯(lián)體與 l 噬菌體包裝蛋白混合時， l 噬菌體 A 基因蛋白的末端酶功能將切割兩個 cos 位點，并將兩個同方向 cos 位點之間的片段包裝到 l 噬菌體顆粒中去。這些噬菌體顆粒感染大腸桿菌時，線狀的

24、重組 DNA 就象 l 噬菌體 DNA 一樣被注入細胞并通過 cos 位點環(huán)化，這樣形成的環(huán)化分子含有完整的粘粒載體，可象質(zhì)粒一樣復(fù)制并使其宿主獲得抗藥性。因而，帶有重組粘粒的細菌可用含適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基挑選。通過這種方式，就將外源 DNA 片段通過粘粒載體克隆到大腸桿菌中了。 與 l 噬菌體載體不同的是，外源片段克隆在粘粒載體中是以大腸桿菌菌落的形式表現(xiàn)出來的，而不是噬菌斑。這樣所得到的菌落的總和就構(gòu)成了基因文庫。 （四） 其他載體-人工微小染色體：隨著基因工程應(yīng)用的深入，越來越需要克隆大片段的外源DNA，而且也需要逐步把外源基因轉(zhuǎn)入真核生物體內(nèi)，而前面提及的載體顯然不能滿足需要，于是構(gòu)建人

25、工微小染色體的設(shè)想提了出來。構(gòu)建人工染色體必須包括染色體的4個基本要素，即基因，復(fù)制起點，著絲粒和端粒結(jié)構(gòu)。首先構(gòu)建的是酵母人工微小染色體（YAC）。它含有酵母的標(biāo)記基因leu2，酵母染色體的著絲粒序列CEN3和自主復(fù)制序列ARS1，以及四膜蟲的兩個端粒序列Tr末端。YAC由質(zhì)粒pBR322改建而來，本身為環(huán)狀；但去轉(zhuǎn)化酵母細胞后，在細胞內(nèi)斷開成為線狀的重組DNA分子，可以象天然染色體一樣地復(fù)制和分離。天然的酵母染色體長度為150-1000kb，而YAC長為7-15kb，可以攜帶長度為1-2Mb的外源DNA片段。但是YAC的裝載能力過大也有不利的一面，例如，必須進行亞克隆以及形成“嵌合體”等。

26、因此現(xiàn)在在人類基因組計劃中所使用的新型載體有 BAC（細菌人工染色體）, PAC（PI人工染色體）, MAC（哺乳細胞人工染色體）, Fosmid （一種類似于BAC，來源于大腸桿菌的F因子的載體）等,裝載能力居中（80-200kb），又方便可靠。 1.酵母人工染色體（Yeast artificial chromosomes YACs） 在 YAC 載體中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態(tài)也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體， YAC 載體以環(huán)狀的方式存在，并增加了普通大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制元件和選擇標(biāo)記，以便保存和增殖。 YAC 載體主要是用來構(gòu)建大片段

27、 DNA 文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。當(dāng)用BamH 切割成線狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動染色體的復(fù)制和分配，從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。對于 BamH切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用 EcoR或 Sma 切割抑制基因 sup4 內(nèi)部的位點后形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細胞分裂分配到子細胞中去，達到克隆大片段DNA 的目的

28、。YAC 文庫裝載的 DNA 片段的大小一般可達 200-500kb，有的可達 1Mb 以上，甚至達到 2Mb 。 2. 細菌人工染色體載體（Bacterial artificial chromosomes，BACs） 是基于大腸桿菌的 F 質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。每個環(huán)狀 DNA 分子中攜帶一個抗生素抗性標(biāo)記，一個來源于大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴謹型控制的復(fù)制子 oriS，一個易于 DNA 復(fù)制的由 ATP 驅(qū)動的解旋酶（ （RepE） 以及三個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座（ parA , parB, 和 parC ） 。 BAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體

29、的產(chǎn)生，減小外源基因的表達產(chǎn)物對宿主細胞的毒副作用。 第一代 BAC 載體，不含那些能夠用于區(qū)分攜帶重組子的抗生素抗性細菌菌落與攜帶空載體的細菌菌落的標(biāo)記物。新型的 BAC 載體可以通過互補的原理篩選含有插入片段的重組子，并設(shè)計了用于回收克隆 DNA 的 Not 酶切位點和用于克隆 DNA 測序的 Sp6 啟動子、 T7 啟動子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not 識別序列，位點十分稀少。重組子通過 Not 消化后，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是來源于噬菌體的啟動子，用于插入片段末端測序。 BAC 與 YAC 和 PAC（P

30、1 artificial chromosomes ， P1 人工染色體 ） 相似，沒有包裝限制，因此可接受的基因組 DNA 大小也沒有固定的限制。大多數(shù) BAC 文庫中克隆的平均大小約 120kb ，然而個別的 BAC 重組子中含有的基因組 DNA 最大可達 300kb 。 【思考題】1. 噬菌體的克隆體現(xiàn)形式是什么？2. 粘粒載體的優(yōu)勢是什么？3. 人工染色體構(gòu)建原則是什么？ 第二節(jié) 工具酶（3） 【教學(xué)時數(shù)】3小時【教學(xué)目錄】1 限制性內(nèi)切核酸酶2 DNA聚合酶和Klenow大片段3 DNA連接酶4 堿性磷酸酶5末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶【教學(xué)目的】讓學(xué)生掌握基因工程常用的工具酶有哪些，這些工具

31、酶有什么用途，在什么情況下使用，以及使用有哪些注意事項等基本常識。【教學(xué)重點】限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶的性質(zhì)與使用?！窘虒W(xué)難點】限制性核酸內(nèi)切酶的類型與使用注意事項?！窘虒W(xué)方式】多媒體講解結(jié)合啟發(fā)討論式教學(xué) 【教學(xué)過程與內(nèi)容】第二節(jié) 工具酶在基因工程的操作中，通常要對目的基因或外源DNA片段以及載體DNA進行剪切，修飾加工與連接等操作，這些處理是通過工具酶來完成的。1. 限制性內(nèi)切核酸酶(1) 限制性核酸內(nèi)切酶的概念：限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異性核苷酸序列并由此特異切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的水解酶。是在DNA分子內(nèi)部切割，水解磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。能夠識別特異的DNA堿

32、基序列， DNA堿基序列往往呈回文對稱結(jié)構(gòu)；并具有特異切割位點。在 20 世紀 60 年代，人們就注意到 DNA 在感染宿主后會被降解的現(xiàn)象，從而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次從 E.coli K 中分離到限制酶，它有特定的識別位點但沒有特定的切割位點，其中切割位點離識別位點達 1000bp 以上。 1970 年，美國約翰霍布金斯大學(xué)的 H. Smith 于偶然中發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌體 DNA ，其細胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，從而找到 Hind 限制性內(nèi)切酶。 Hin

33、d 限制性內(nèi)切酶位點和切割位點如下： 5 GTPy PuAC 3 3 CAPu PyTG 5 從此以后，發(fā)現(xiàn)的限制酶越來越多，并且許多已經(jīng)在實踐中得到應(yīng)用。 EcoR 是應(yīng)用最廣泛的限制性內(nèi)切酶，酶切位點和切割位點如下： 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5（2）核酸內(nèi)切酶的命名：限制性內(nèi)切酶的命名遵循一定的原則，主要依據(jù)來源來定，涉及宿主的種名、菌株號或生物型。命名時，依次取宿主屬名第一字母，種名頭兩個字母，菌株號，然后再加上序號（羅馬字）。物種屬名第一個字母（大寫字母）+菌種名前兩個字母（小寫）+菌株第一個字母+羅馬大寫數(shù)字。EcoR I 代表 Escherichia coli（大腸

34、桿菌）R菌株發(fā)現(xiàn)的第一種限制性核酸酶。如 Hind 限制性內(nèi)切酶， Hin 指來源于流感嗜血桿菌， d 表示來自菌株 Rd ， 表示序號。以前在限制性內(nèi)切酶和修飾酶前加 R 或 M ，且菌株號和序號小寫。但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的 R 省略不寫。 1986 年下半年發(fā)現(xiàn) 615 種限制酶和 98 種甲基化酶； 1998 年發(fā)現(xiàn) 10000 種細菌或古細菌中存在 3000 種酶，且酶有 200 多種特異性。到 2005 年 1 月，共發(fā)現(xiàn) 4342 種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 種，包括 型、 型、 型限制酶各有 59 、3612 、10 種，甲基化指導(dǎo)的限制酶有 3 種，商業(yè)化的

35、限制酶有 588 種，在 型限制酶中共有 221 種特異性。（3）限制性核酸內(nèi)切酶的分類：根據(jù)酶的亞單位組成、識別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)至少可分為三類。 I類：識別特異順序，序列外隨機切割?；蚬こ讨胁挥?。II類：識別特異順序，序列內(nèi)特異切割，回文結(jié)構(gòu)?；蚬こ讨谐Ｓ?。III類：識別特異順序，序列外特異切割，非回文結(jié)構(gòu)。基因工程中特殊時候使用。 型（type ）限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達 93% 。 型酶相對來說最簡單，它們識別回文對稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割 DNA ，產(chǎn)生帶 3- 羥基和 5- 磷酸基團的 DNA 產(chǎn)物，需 Mg2+ 的存在才能發(fā)揮活性，相

36、應(yīng)的修飾酶只需 SAM 。識別序列主要為 4-6bp ，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。 型限制酶一般是同源二聚體（homodimer），由兩個彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個亞單位作用在 DNA 鏈的兩個互補位點上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。 在 型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，造成一個切口，這類限制酶也稱切口酶 （nicking enzyme），如 N.BstNBI 。在基因操作中，一般所說的限制酶

37、或修飾酶，除非特指，均指 型系統(tǒng)中的種類。II類限制性核酸酶特點：1. 內(nèi)切酶活性與甲基化酶活性分開；2. 需要Mg2+激活，但無需ATP輔助因子；3. 特異識別，識別序列一般4-6bp長，偶爾7bp；4. 識別順序往往有回文結(jié)構(gòu)；5. 特異切割：切口有平切和錯切兩種類型。（4）限制酶產(chǎn)生的末端A限制酶產(chǎn)生匹配粘端（matched ends） 識別位點為回文對稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。若在對稱軸 5 側(cè)切割底物， DNA 雙鏈交錯斷開產(chǎn)生 5 突出粘性末端，如EcoR ；若在 3-側(cè)切割，

38、則產(chǎn)生 3 突出粘性末端，如Kpn 。 NNGAATTCNN EcoR NNG AATTCNN NNCTTAAGNN NNCTTAA GNNB限制酶產(chǎn)生平頭末端（Blunt end） 在回文對稱軸上同時切割 DNA 的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端，如 Hae（GGCC）和 EcoRV（GATATC）。產(chǎn)生平末端的 DNA 可任意連接，但連接效率較粘性末端低。C同裂酶（isoschizomer） 同裂酶（同切點酶）：來源不同，識別順序相同或相近，切割序列相同，產(chǎn)生相同或不同的粘性末端?；蛘哒f：不同來源的限制酶可以切割相同的序列。 n Sau3A I : 5-GATC-3n 3-CTAG-5n BamH

39、I: 5-GGATCC-3n 3-CCTAGG-5D同尾酶 同尾酶：來源各異，識別靶序列各不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。 n Bgl II : 5-AGATCT-3n 3-TCTAGA-5n BamH I: 5-GGATCC-3n 3-CCTAGG-5（5）影響限制性核酸內(nèi)切酶切反應(yīng)的因素n DNA的純度(蛋白質(zhì)、酚、氯仿、EDTA、SDS、高濃度的鹽離子等)n DNA的甲基化程度n 酶切消化反應(yīng)的溫度n DNA的分子結(jié)構(gòu)n 限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液ADNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等處理辦法：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶；加大反應(yīng)總體積

40、；延長反應(yīng)時間。B. DNA甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影響 大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoR II等中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoR II等。C 反應(yīng)溫度 反應(yīng)溫度大多數(shù)為 37 ，一部分為 50-65 ，少數(shù) 25-30 。高溫作用酶在 37 下的活性會下降，多數(shù)僅為最適條件下的 10-50% 。如 Taq 限制酶（正常反應(yīng)溫度為 65），在 37 只有在

41、65 活性的 10% ；Apo（正常反應(yīng)溫度為 50）， 37 只有在 50 時活性的 50% 。銷售商在產(chǎn)品說明中都會標(biāo)明最佳反應(yīng)溫度。D 酶切反應(yīng)的緩沖液：常規(guī)緩沖液一般包括提供穩(wěn)定 pH 值的緩沖劑、 Mg+ 、 DTT（二硫蘇糖醇）以及 BSA（小牛血請白蛋白）。 pH 經(jīng)常為 7.0-7.9（在 25 時），用 Tris-HCl 或乙酸調(diào)節(jié)； Mg+ 作為酶的活性中心，由 MgCl2和 MgAc 提供； 濃度常為 10mM ；DTT 濃度常為 1mM 。有時緩沖液中還要加入 100mg/ml BSA ，但只是少數(shù)反應(yīng)需要。不同的酶對離子強度的要求差異很大，并依次將限制酶緩沖液按離子強

42、度的差異分為高、中、低三種類型，離子強度以 NaCl 來滿足，濃度分別為 100mM 、50mM 和 0mM 。 要對 DNA 進行雙酶切時，如何選擇緩沖液是相當(dāng)重要的。一方面可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液；若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量 NaCl 和第二種酶；或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA 可純化或不純化）。 2. DNA連接酶DNA連接酶負責(zé)雙鏈DNA中相鄰3-OH與5-磷酸基團之間的磷酸二酯鍵的形成。只能連接切口（nick or nike），不能連接缺口（gap）。最常用T4連接酶。最適連接溫度37。C，實際操作4-16。C。DNA連接酶既可以進行粘接（連接粘性末

43、端），也可以進行端接（連接平頭末端），但粘接的效果比端接的效果要好許多倍。從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多.提高平頭末端連接效率的方法包括：（1）加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接） （2）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會 （3）加入10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用 （4）加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200 mMDNA連接酶的反應(yīng)條件：Tris-HCl 50 100 mM pH 7.5MgCl2 10 mMATP 0.5 1 mMDTT 5

44、 mMVolume 10 20 mlT T 4 15 4 16 hr1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15 反應(yīng) 1 小時，完全連接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量。T4 DNA 連接酶（T4 DNA ligase）： T4 DNA 連接酶的分子量為 68kDa ，催化 DNA 5 磷酸基與 3 羥基之間形成磷酸二酯鍵。反應(yīng)底物為粘端、切口、平端的 RNA （但效率低）或 DNA 。低濃度的聚乙二醇 PEG （一般為 10%）和單價陽離子（150-200mM NaCl）可以提高平端連接速率。 連接反應(yīng)條件需要 ATP ，若在 16 反應(yīng)，大約需 4 小時；若

45、在 4 反應(yīng)，則需反應(yīng)過夜。3. DNA聚合酶和Klenow大片段真核細胞有 4 種 DNA 聚合酶, DNA 聚合酶 a 位于細胞核內(nèi)，也許是復(fù)合物，有催化細胞增生的作用； DNA 聚合酶 b 是小分子蛋白質(zhì)（4.4kDa），曾從小牛胸腺中提出，與細胞增生無關(guān)； DNA 聚合酶 g 為 100kDa ，利用 RNA 為模板的效率比利用 DNA 為模板的效率高；其它的還有線粒體 DNA 聚合酶，可以催化線粒體 DNA 的合成。 原核細胞有三種 DNA 聚合酶，都與 DNA 鏈的延長有關(guān)。聚合酶 是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈 DNA 的延長；聚合酶 則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)；聚合酶 在細

46、胞中存在的數(shù)目不多，是促進 DNA 鏈延長的主要酶。（1）E.coli DNA 聚合酶 的活性 E.coli DNA 聚合酶 為單鏈多肽（109kDa），有三種活性。 5-3 DNA 聚合酶活性。反應(yīng)底物為單鏈 DNA 及引物（帶 3-OH 基）或 5 突出的雙鏈 DNA 。 5-3 外切核酸酶活性。反應(yīng)底物是雙鏈 DNA 或 DNA:RNA 雜交體，它可從 5 端降解雙鏈 DNA ，也降解 RNA:DNA 中的 RNA（RNase H 活性）。 3-5 外切酶活性。反應(yīng)底物是帶 3-OH 的雙鏈 DNA 或單鏈 DNA ，其活性從 3-OH 端降解 DNA ，可被 5-3 聚合活性封閉，也可

47、被帶 5 磷酸的 dNMP 所抑制。 交換（置換）反應(yīng)。如果只有一種 dNTP 存在， 3-5 外切活性將從 3-OH 端降解 DNA ，然后在該位置發(fā)生一系列連續(xù)的合成和外切反應(yīng)，直到露出與該 dNTP 互補的堿基。 總之，在沒有 dNTP 的情況下，外切活性占主導(dǎo)地位，而當(dāng)存在足夠的 dNTP 時，外切活性和合成活性將處在動態(tài)平衡中，結(jié)果使得雙鏈 DNA 成為平末端。2E.coli DNA 聚合酶 的用途 利用E.coli DNA 聚合酶 的 5-3 外切核酸酶活性，可用切口平移法（nick translation ）標(biāo)記 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反應(yīng)。 用于 cDNA

48、 克隆中的第二鏈，即單純的 DNA 聚合活性。但由于具有 5-3 外切活性，現(xiàn)在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反轉(zhuǎn)錄酶。 對 3 突出端的 DNA 作末端標(biāo)記（交換或置換反應(yīng)），但是此反應(yīng)用 T4 或 T7 DNA 聚合酶效果會更好 （2）Klenow片斷Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去 5-3 外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3-5 外切活性不受影響。也稱為 Klenow 片段（Klenow fragment），或 E.coli DNA 聚合酶 大片段（E.coli DNA polyme

49、rase large fragment）。它也可以通過基因工程得到，分子量為 76kDa 。 Klenow DNA 聚合酶的活性與E.coli DNA 聚合酶 的活性是一致的。由于沒有 5-3 外切活性，使用范圍進一步擴大。 補平 3 凹端 DNA 。使用單純的 DNA 合成活性。注意要加足夠的 dNTP ；如果使用帶標(biāo)記的 dNTP ，則可對 DNA 進行末端標(biāo)記。 抹平 DNA 3 凸端。在 3-5 外切活性作用下，可切除突出的 3 凸端。注意必須加足量 dNTP ，否則外切活性不會停止。但由于 T4 和 T7 DNA 聚合酶具更強的 3-5 外切活性，現(xiàn)在已經(jīng)取代了 Klenow DNA

50、 聚合酶的這一作用。 通過置換反應(yīng)對 DNA 進行末端標(biāo)記。但是該作用也已經(jīng)被 T4 或 T7 DNA 聚合酶代替；它還可以在補平 3 凹端的過程中進行標(biāo)記。 在 cDNA 克隆中合成第二鏈。 隨機引物標(biāo)記。 應(yīng)用于 Sanger 雙脫氧鏈末端終止法的 DNA 測序（已經(jīng)被 T7 DNA 聚合酶取代）。 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈 DNA 。 （3）逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈以及雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈。 以mRNA為模板合成scDNA。 需要模板，引物，底物 用于cDNA 文庫構(gòu)建等4. 單鏈核酸酶S1 降解單鏈DNA或單鏈RNA, 但對雙鏈不起作用。 用于降解雙鏈cDNA發(fā)夾結(jié)構(gòu) 單鏈酶法獲取目的基因 降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍。降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍。5. 堿性磷酸酯酶分子克隆中使用的磷酸酶主要來源于牛小腸堿性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase），簡稱 CIP 或 CIAP ，也有來自細菌的堿性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase, BAP）。它們均能催化除去 DNA 或 RNA 5 磷酸的反應(yīng)。通過去除 5 磷酸基團，可用于防止 DNA 片段自身連接，或標(biāo)記（5 端）前