植物細(xì)胞工程課件(PPT 253頁(yè))

1、 植物細(xì)胞工程1第1頁(yè)，共253頁(yè)。概 述一、定義植物細(xì)胞工程是一門(mén)以植物組織和細(xì)胞的離體操作為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的新興學(xué)科。根據(jù)生物學(xué)原理及工程學(xué)原理，通過(guò)細(xì)胞、組織、器官培養(yǎng)以及細(xì)胞融合等，定向改造植物細(xì)胞，達(dá)到改良品種、快速繁殖或生產(chǎn)生物產(chǎn)品為人類(lèi)生產(chǎn)名貴藥品及提供服務(wù)的技術(shù)。2第2頁(yè)，共253頁(yè)。二、植物細(xì)胞工程的發(fā)展歷史3第3頁(yè)，共253頁(yè)。德國(guó)植物學(xué)家 Haberlandt 植物細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)始人1902年根據(jù)細(xì)胞學(xué)說(shuō)提出植物體細(xì)胞有再生完整植株的潛在全能性4第4頁(yè)，共253頁(yè)。 1902年，德國(guó)植物學(xué)家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn)。

2、他認(rèn)為，如果每個(gè)細(xì)胞都有植物個(gè)體一樣的性質(zhì)和能力，那么可以通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)，把單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成一個(gè)新個(gè)體。5第5頁(yè)，共253頁(yè)。在此思想指導(dǎo)下，許多科學(xué)家從事組織培養(yǎng)研究。 1904年，德國(guó)植物胚胎學(xué)家Hanning 用蘿卜和辣根的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，提早長(zhǎng)成了小植株，首次獲得胚培養(yǎng)成功。 成熟 發(fā)芽常規(guī)，幼胚 種子 植物 培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 幼胚 植株6第6頁(yè)，共253頁(yè)。 1922年，Knudson 對(duì)蘭花幼胚進(jìn)行培養(yǎng)獲得幼苗，克服了蘭花種子發(fā)芽難的困難。 1925年，Laibach 進(jìn)行亞麻種間雜種幼胚培養(yǎng)，成功地得到了雜種植物。 1934年，White 等用番茄根尖的組織培養(yǎng)，建立了第一個(gè)活躍生

3、長(zhǎng)的無(wú)性繁殖系。 1934年，Gautheret 培養(yǎng)山毛柳、黑楊的形成層組織，獲得愈傷組織形成。7第7頁(yè)，共253頁(yè)。 1937年，White 和Went 等分別發(fā)現(xiàn)B族維生素和吲哚乙酸（IAA）對(duì)培養(yǎng)的離體根生長(zhǎng)具有重要作用。 1937-1938年，Gautheret 在1934年培養(yǎng)山毛柳、黑楊成功獲得愈傷組織的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)柳樹(shù)的培養(yǎng)基中，加入IAA 和B族維生素等，使形成層的生長(zhǎng)大為增加。 1937-1938年，Nobecourt 培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得愈傷組織。將愈傷組織置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可無(wú)限發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。首次從液泡化的薄壁細(xì)胞建立愈傷組織

4、培養(yǎng)物。8第8頁(yè)，共253頁(yè)。 White、Gautheret、Nobecourt 等科學(xué)家被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人。 在此基礎(chǔ)上建立了植物組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，包括無(wú)機(jī)鹽成分、有機(jī)成分和生長(zhǎng)刺激因素。這是隨后創(chuàng)立的各種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)，同時(shí)也建立了植物組織培養(yǎng)的基本方法，成為當(dāng)今各種植物組織培養(yǎng)的技術(shù)基礎(chǔ)。9第9頁(yè)，共253頁(yè)。40年代末開(kāi)始，進(jìn)行從脫分化細(xì)胞組織培養(yǎng)進(jìn)入探討器官再分化的研究。 脫分化 細(xì)胞（組織、器官） 再分化愈傷組織 不定芽 植株 不定根10第10頁(yè)，共253頁(yè)。11第11頁(yè)，共253頁(yè)。12第12頁(yè)，共253頁(yè)。 1958年，Steward 和Shantz以胡蘿卜根的懸浮

5、細(xì)胞誘導(dǎo)分化成完整的小植株，首次獲得植株再生成功。 1960年，Cocking 等用真菌纖維素分離植物原生質(zhì)體獲得成功。 1971年，Takebe 等從煙草原生質(zhì)體得到再生植株，首次獲得原生質(zhì)體植株再生成功。 1972年，Carlson 等通過(guò)兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種植株。 到目前為止，組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞融合已在許多植物上獲得再生成功。13第13頁(yè)，共253頁(yè)。三、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用14第14頁(yè)，共253頁(yè)。（一）、脫毒和快速繁殖 許多植物，特別是無(wú)性繁殖植物，帶有病毒，并直接傳給子代，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和質(zhì)量。一般莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)不帶病毒。所以，利用莖尖培養(yǎng)再生的

6、植株，可能不帶病毒，再進(jìn)行大量繁殖生產(chǎn)脫毒苗。脫毒苗用于生產(chǎn)可明顯提高產(chǎn)量、質(zhì)量和商品價(jià)值。目前已在許多植物上得到應(yīng)用，如甘薯、馬鈴薯、草莓、果樹(shù)、花卉等。15第15頁(yè)，共253頁(yè)。 許多名貴植物，之所以名貴，是因?yàn)榉敝诚禂?shù)太低，種子結(jié)實(shí)率低或者不結(jié)種子，而營(yíng)養(yǎng)繁殖又很慢。利用組織培養(yǎng)再生植株，進(jìn)行大量繁殖，可以大大提高繁殖系數(shù)。目前組織培養(yǎng)快速繁殖已在許多植物上應(yīng)用， 最早是蘭花（60年代）。16第16頁(yè)，共253頁(yè)。17第17頁(yè)，共253頁(yè)。18第18頁(yè)，共253頁(yè)。19第19頁(yè)，共253頁(yè)。（二）、細(xì)胞工程育種 1. 利用培養(yǎng)變異，篩選優(yōu)良突變體。 植物離體培養(yǎng)，能夠明顯提高突變率，并且

7、會(huì)有各種各樣的生理和形態(tài)突變，如株高、花色、植株形態(tài)、生育期、耐性等等?？梢詮闹羞x擇優(yōu)良突變體，培育新品種。20第20頁(yè)，共253頁(yè)。 2、利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng)，獲得雜種植株，克服其雜交不親和性。 有些植物遠(yuǎn)緣雜交，能正常受精，但受精胚往往敗育。此種情況下，可以將幼胚在敗育前進(jìn)行離體培養(yǎng)，以獲得緣遠(yuǎn)雜種植株。21第21頁(yè)，共253頁(yè)。 3.利用細(xì)胞融合技術(shù)，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性。 野生種往往有許多優(yōu)良性狀，如抗干旱、抗病蟲(chóng)害、耐澇、耐瘠薄、耐鹽堿、抗凍等特性。但大部分野生種與栽培種雜交不親和，嚴(yán)重影響了野生種優(yōu)良遺傳基因的應(yīng)用。利用細(xì)胞融合，可以克服這種雜交不親和性，獲得體細(xì)胞雜種，使野生種的

8、利用成為可能。22第22頁(yè)，共253頁(yè)。（三）、離體種質(zhì)保存 隨著地球不斷開(kāi)發(fā)、生態(tài)環(huán)境破壞，種植資源日趨枯竭，大量有用基因損失。利用組織培養(yǎng)法，低溫保存（196）或試管保存，為保存和搶救瀕臨滅絕的生物帶來(lái)希望。23第23頁(yè)，共253頁(yè)。（四）、細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì) 利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì)，如藥物、色素、食品添加劑、酶、農(nóng)藥等。24第24頁(yè)，共253頁(yè)。植物細(xì)胞工程：以植物組織細(xì)胞為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物種，或加速繁殖植物個(gè)體，或獲得有用物質(zhì)的過(guò)程。脫分化：離體培養(yǎng)條件下，一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到

9、原始無(wú)分化狀態(tài)或分生組織細(xì)胞狀態(tài)或胚性細(xì)胞的狀態(tài)的過(guò)程。再分化：脫分化后的分生細(xì)胞（愈傷組織）在特定的條件（離體培養(yǎng)）下，重新恢復(fù)細(xì)胞分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進(jìn)一步發(fā)育成完整生物體。細(xì)胞全能性：一個(gè)細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個(gè)體的固有能力。外植體：植物組織培養(yǎng)中用來(lái)進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。愈傷組織：脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無(wú)組織結(jié)構(gòu)、無(wú)明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞分化：是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過(guò)程。25第25頁(yè)，共253頁(yè)。第一節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)特性：

10、植物細(xì)胞較大，有纖維素細(xì)胞壁，細(xì)胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差培養(yǎng)過(guò)程生長(zhǎng)速度緩慢，易污染，需用抗生素細(xì)胞生長(zhǎng)中期及對(duì)數(shù)期，易凝聚成團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較難培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌具有群體效應(yīng)，無(wú)錨地依賴(lài)性和接觸抑制性細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低 細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)與功能全能性26第26頁(yè)，共253頁(yè)。植物細(xì)胞全能性是植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)根據(jù)細(xì)胞學(xué)說(shuō)，德國(guó)植物學(xué)家 Haberlandt （植物細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)始人）1902年提出立體培養(yǎng)的植物體細(xì)胞有通過(guò)胚胎發(fā)生過(guò)程而發(fā)育再生成完整植株的潛在全能性。五十年代，Skoog1958,Steward和Keiraert把培養(yǎng)的胡蘿卜體細(xì)胞誘導(dǎo)

11、成胚狀體，細(xì)胞增生順序通過(guò)原胚期，球形胚期，心形胚期，魚(yú)雷胚期，和子葉期，最后形成完整的植株。證明了細(xì)胞的全能性。（發(fā)育全能性，物質(zhì)代謝的全能性）27第27頁(yè)，共253頁(yè)。器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎發(fā)生一器官發(fā)生（一）概念：離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過(guò)程。（二）發(fā)生方式：有兩種發(fā)生方式（1）直接發(fā)生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過(guò)程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生）（2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過(guò)程。 28第28頁(yè)，共253頁(yè)。二）胚狀體方式(somatic embryo) 指由培

12、養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長(zhǎng)成完整植株。由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個(gè)不同發(fā)育階段：1)外植體細(xì)胞脫分化。外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成 在植物有性生殖中，精子和卵子結(jié)合形成合子，合子進(jìn)一步發(fā)育成胚。但在組織培養(yǎng)條件下胚狀體的發(fā)育過(guò)程是：細(xì)胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細(xì)胞分裂增殖，并依次經(jīng)過(guò)原胚期、球形胚期、心形胚期、魚(yú)雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟的有機(jī)體。我們把由愈傷組織的類(lèi)似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過(guò)程而直接產(chǎn)生類(lèi)似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株 在外觀上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀

13、。29第29頁(yè)，共253頁(yè)。30第30頁(yè)，共253頁(yè)。1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室是細(xì)胞工程研究的主要場(chǎng)所，應(yīng)能滿(mǎn)足清洗、培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)藏、無(wú)菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。31第31頁(yè)，共253頁(yè)。 1基本實(shí)驗(yàn)室 1.1 洗滌間 根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在30-50m2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專(zhuān)用的洗滌水槽，用來(lái)清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置2個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購(gòu)置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1-2個(gè)洗液缸，專(zhuān)門(mén)用于洗滌對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。 地面應(yīng)耐濕并排水良好。 32第32頁(yè)，共253頁(yè)。33第3

14、3頁(yè)，共253頁(yè)。1.2培養(yǎng)基配制間面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有 ：冰箱、天平、微波爐、pH計(jì)、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。34第34頁(yè)，共253頁(yè)。35第35頁(yè)，共253頁(yè)。 1.3消毒間 配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過(guò)濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號(hào)的滅菌鍋。一般實(shí)驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動(dòng)控制壓

15、力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。 如果沒(méi)有條件的話，可以將上述工作間合并成一個(gè)準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。36第36頁(yè)，共253頁(yè)。37第37頁(yè)，共253頁(yè)。 1.4無(wú)菌操作室無(wú)菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門(mén)應(yīng)該與接種室的門(mén)錯(cuò)開(kāi)，兩個(gè)門(mén)也不要同時(shí)開(kāi)啟，以保證無(wú)菌室不因開(kāi)門(mén)和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無(wú)菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過(guò)毒的

16、工作服和拖鞋。 室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。 38第38頁(yè)，共253頁(yè)。39第39頁(yè)，共253頁(yè)。 1.5培養(yǎng)室 為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶(hù)，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。 培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用40W，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在20cm，光照強(qiáng)度為2000-3000lx。40第

17、40頁(yè)，共253頁(yè)。41第41頁(yè)，共253頁(yè)。42第42頁(yè)，共253頁(yè)。2輔助實(shí)驗(yàn)室 2.1鑒定室 細(xì)胞學(xué)鑒定室 其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。 生化分析室 在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。 離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、天平、PCR儀等。43第43頁(yè)，共253頁(yè)。44第44頁(yè)，共253頁(yè)。2.2、溫室為試管苗提供滿(mǎn)足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。45第45頁(yè)，共253頁(yè)。2 實(shí)驗(yàn)基本操作一.洗滌技術(shù)(1)洗滌液的配制46第46頁(yè)，共253

18、頁(yè)。(2)洗滌方法A、新購(gòu)買(mǎi)的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5的去污劑洗刷，再用自來(lái)水洗凈，然后浸泡在12鹽酸溶液中過(guò)夜（不可少于四小時(shí)），再用自來(lái)水沖洗，最后用無(wú)離子水沖洗兩次，在100120烘箱內(nèi)烘干備用。47第47頁(yè)，共253頁(yè)。B、使用過(guò)的玻璃儀器的清洗 先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來(lái)水徹底洗凈去污劑，用無(wú)離子水洗兩次，烘干備用（計(jì)量?jī)x器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。48第48頁(yè)，共253

19、頁(yè)。C、 塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已用的越來(lái)越多。第一次使用塑料器皿時(shí)，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)pH = 1）清洗，接著依次用無(wú)離子水、1 mol/L KOH和無(wú)離子水清洗，然后用103 mol/L EDTA 除去金屬離子的污染，最后用無(wú)離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用0.5的去污劑清洗，然后用自來(lái)水和無(wú)離子水洗凈即可。49第49頁(yè)，共253頁(yè)。D、金屬用品洗滌 金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 E、除菌過(guò)濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，

20、晾干備用。50第50頁(yè)，共253頁(yè)。 二.滅菌（一）、滅菌工作是極其重要的。對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)，首先應(yīng)建立有菌和無(wú)菌的概念有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。 無(wú)菌的范疇：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等） 物理或化學(xué)處理； 火烤后的物體； 健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織 內(nèi)部可能是無(wú)菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但 不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）51第51頁(yè)，共253頁(yè)。（二）、滅菌的方法： 1、 物理方法：干熱、濕熱、過(guò)濾（0.25微米）、紫外燈、超聲波等。 2、化學(xué)方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、

21、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等 52第52頁(yè)，共253頁(yè)。（1）干熱滅菌適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：150 、40min或120 、120min，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160 、90120min53第53頁(yè)，共253頁(yè)。（2）濕熱滅菌適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。121 維持2030min注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到0時(shí)，才能開(kāi)蓋54第54頁(yè)，共253頁(yè)。（3）過(guò)濾滅菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GA3、玉米素等），就需要過(guò)濾滅菌。另外酶、血清等也需要過(guò)濾滅菌 滅菌方法：將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注

22、射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.22-0.45微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至50左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝55第55頁(yè)，共253頁(yè)。（4）射線滅菌主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間20-30min。注意：關(guān)燈后5min后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)關(guān)燈后要打開(kāi)風(fēng)機(jī)。56第56頁(yè)，共253頁(yè)。（5）火焰灼燒滅菌用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。57第57頁(yè)，共253頁(yè)。（6）消毒劑適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較消 毒 劑使用濃度(%)消毒時(shí)間(min.)效 果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅1020

23、530好易氯化汞0.11215最好最難過(guò)氧化氫1012515較好最易抗菌素450mgl-13060較好較難次氯酸鈣/納9 10530好易58第58頁(yè)，共253頁(yè)。注意： （1）實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚一般用 7075% 酒精（2）升汞為劇毒藥品，一則使用時(shí)注意別濺到皮膚上，二則使用后要進(jìn)行處理，不能直接導(dǎo)入下水道。 升汞處理方法： 升汞Na2S絮狀沉淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止）FeSO4（中和過(guò)多的Na2S ） 59第59頁(yè)，共253頁(yè)。長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲醛、高錳酸鉀熏蒸。 甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計(jì)算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱(chēng)好

24、的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)(最好在碗或杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗)，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門(mén)。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。 60第60頁(yè)，共253頁(yè)。甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持4小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2小時(shí)進(jìn)行。 對(duì)有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸61第6

25、1頁(yè)，共253頁(yè)。人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。 物品因素 器皿和用具 培養(yǎng)皿：洗熱壓 玻璃器皿：洗干熱（干熱箱）或晾干 接種用具：用CCL4布擦濕布擦 泡75%95%酒精燒 培養(yǎng)基：濕熱 培養(yǎng)材料 外部細(xì)菌：用水沖洗化學(xué)藥劑處理 內(nèi)部細(xì)菌 莖尖培養(yǎng) 加抗生素：青霉素、利福平 操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺(tái) 用化學(xué)試劑薰蒸 污染來(lái)源 三、無(wú)菌操作技術(shù)62第62頁(yè)，共253頁(yè)。1、實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備2、用75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺(tái)面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。3、關(guān)紫外燈

26、、打開(kāi)風(fēng)機(jī)，過(guò)5-10min進(jìn)入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無(wú)菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒(méi)有特別情況，盡量不要下工作臺(tái)）63第63頁(yè)，共253頁(yè)。4、用7075的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過(guò)度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過(guò)火焰不能時(shí)間太長(zhǎng)。64第64頁(yè)，共253頁(yè)。5、取流水沖洗（至少30min）過(guò)的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無(wú)菌水沖洗34次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他

27、處理。65第65頁(yè)，共253頁(yè)。6、打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。7、用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。66第66頁(yè)，共253頁(yè)。注意（1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（2）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。 （3）為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過(guò)早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過(guò)早開(kāi)瓶；用過(guò)之后如

28、不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)。 67第67頁(yè)，共253頁(yè)。（5）吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。（7）手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開(kāi)放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。68第68頁(yè)，共253頁(yè)。接種時(shí)在近火焰處打開(kāi)瓶口，使瓶?jī)A斜，以免空氣中微生物落入瓶中 正 確 錯(cuò) 誤 69第69頁(yè)，共253頁(yè)。整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速正 確 錯(cuò) 誤 70第70頁(yè)，共253頁(yè)。接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸

29、空要求 防止操作帶來(lái)的污染 正 確 錯(cuò) 誤 71第71頁(yè)，共253頁(yè)。接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正 確 錯(cuò) 誤 72第72頁(yè)，共253頁(yè)。瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正 確 錯(cuò) 誤 73第73頁(yè)，共253頁(yè)。接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生74第74頁(yè)，共253頁(yè)。種子和分生組織：培養(yǎng)時(shí)通常將其貼放在培養(yǎng)基表面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足正 確 錯(cuò) 誤 75第75頁(yè)，共253頁(yè)。接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中正 確 錯(cuò) 誤 76第76頁(yè)，共253頁(yè)。 四、外植體的選擇與處理技術(shù)用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來(lái)源：一是生長(zhǎng)在自然環(huán)境

30、下的植物；二是在溫室控制環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物；三是無(wú)菌環(huán)境下已經(jīng)過(guò)離體培養(yǎng)的植物。77第77頁(yè)，共253頁(yè)。 （一）、外植體的選擇 1、選擇優(yōu)良的基因型 試驗(yàn)首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料，并且品種一定要可靠?；ɑ堋⒂^賞植物的快繁，也應(yīng)選擇有價(jià)值的植物。 2、取材 從生長(zhǎng)旺盛、健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株上取材。母柱代謝旺盛期切取的外植體再生能力強(qiáng)，試驗(yàn)容易成功。 78第78頁(yè)，共253頁(yè)。3、外植體大小選擇 因外植體不同而不同。如利用莖尖培養(yǎng)，莖尖大小對(duì)脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。（

31、以后具體講） 4、選擇外植體的時(shí)期 外植體的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)往往與該物種的生長(zhǎng)規(guī)律（生物鐘）有關(guān)。因此，最好在植物生長(zhǎng)的最適宜時(shí)期取材培養(yǎng)。會(huì)得到較好的結(jié)果。79第79頁(yè)，共253頁(yè)。 （二）、外植體的處理 1、取材母株的預(yù)處理 人工管理，促進(jìn)母株生長(zhǎng)旺盛、代謝活躍，從其上取材培養(yǎng)，容易成功。 2、外植體休眠的處理 有些植物的種子、幼胚、或芽，存在休眠。為了打破休眠，可利用低溫處理，或赤霉素等化學(xué)物質(zhì)處理。因植物不同處理溫度和時(shí)間有所不同。 80第80頁(yè)，共253頁(yè)。3、 組織內(nèi)生菌的 處理 （1）加入抗生素，注意抗生素的用量，高濃度容易造成培養(yǎng)物的死亡 （2）取生長(zhǎng)期旺盛的生長(zhǎng)點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的外

32、植體。 （3）取被內(nèi)生菌污染的培養(yǎng)物的 莖尖不停的轉(zhuǎn)接。81第81頁(yè)，共253頁(yè)。 3.培養(yǎng)基的成分及其配制 一、培養(yǎng)基的成分及其作用 （一）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 培養(yǎng)的植物組織、器官、細(xì)胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無(wú)機(jī)化學(xué)物質(zhì)，除了C、H、O之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量營(yíng)養(yǎng)元素。82第82頁(yè)，共253頁(yè)。大量元素 培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括N, P, K, Ca, Mg, S。培養(yǎng)基中加入量最多的是N，N一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供83第83頁(yè)，共253頁(yè)。微量元素 微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所需的微量

33、元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co，Cl其他一些化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微量元素的用量不能過(guò)多，多會(huì)引起生長(zhǎng)抑制等毒害現(xiàn)象。84第84頁(yè)，共253頁(yè)。（二）.有機(jī)化合物有機(jī)物質(zhì)包括維生素類(lèi)物質(zhì)、氨基酸類(lèi)物質(zhì)、糖類(lèi)物質(zhì)和一些其它的有機(jī)添加物 1、維生素類(lèi)物質(zhì) 維生素類(lèi)物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。 硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素，而鹽酸吡哆醇（VB6）促進(jìn)根的生長(zhǎng)，煙酸（VB3，又稱(chēng)維生素PP）促進(jìn)胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12）、葉酸（VBc），Vc等。 85第85頁(yè)，共

34、253頁(yè)。2、AA類(lèi)物質(zhì)絕大多數(shù)AA適量時(shí)對(duì)培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng)。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物組織培養(yǎng)中，有時(shí)也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。86第86頁(yè)，共253頁(yè)。3、糖類(lèi)糖在培養(yǎng)基的作用： 1）、為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架 2）、為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量 3）、維持滲透壓蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。87第87頁(yè)，共253頁(yè)。4、其它有機(jī)物質(zhì)1）肌醇（環(huán)己六醇） 肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽(yáng)離子結(jié)合或形成磷脂，參與細(xì)胞膜的組成。利于胚和芽的形成2）天然有機(jī)物一些天然的有機(jī)物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮

35、汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用。88第88頁(yè)，共253頁(yè)。植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物，而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)。 無(wú)機(jī)元素和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動(dòng)，只有加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化。（三）、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)89第89頁(yè)，共253頁(yè)。 1、生長(zhǎng)素類(lèi)：1）吲哚類(lèi)：IAA（吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 、IPA（吲哚丙酸）2）萘酸類(lèi)： NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸類(lèi)：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（ 2,4,5-三氯苯氧乙酸）、 2,4,5

36、-TP（ 2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強(qiáng)的生長(zhǎng)素。90第90頁(yè)，共253頁(yè)。 生長(zhǎng)素的生理作用1、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂2、誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力3、形成愈傷組織，促進(jìn)生根4、與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)、胚狀體的誘導(dǎo)。91第91頁(yè)，共253頁(yè)。A：NAA 0mg/L，芽（少），根（無(wú)） B：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（無(wú)），愈傷組織（少量） C：NAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量A B C 92第92頁(yè)，共253頁(yè)。2、細(xì)胞分裂素 是一類(lèi)腺嘌呤衍生物。主要有激動(dòng)素（

37、6-糠基氨基嘌呤KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6芐基氨基嘌呤。 功能： 1、促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化 2、誘導(dǎo)芽的分化 3、促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長(zhǎng) 4、抑制衰老 93第93頁(yè)，共253頁(yè)。A B A：BA(0mg/L) ，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）B：BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）94第94頁(yè)，共253頁(yè)。控制植物細(xì)胞分化分裂素/生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的一個(gè)重要條件 比例高時(shí)產(chǎn)生芽,比例低時(shí)產(chǎn)生根 95第95頁(yè)，共253頁(yè)。 3、赤霉素（GA3）生理作用：1、誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長(zhǎng)，對(duì)矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有

38、效，對(duì)根無(wú)效2、對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長(zhǎng)素有協(xié)同作用。IAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。4、對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用注：不耐熱，應(yīng)采用過(guò)濾滅菌加入96第96頁(yè)，共253頁(yè)。97第97頁(yè)，共253頁(yè)。 4、脫落酸（ABA）生理作用：1、抑制蛋白質(zhì)的合成2、抵消和抑制生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、GA的作用3、誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落 98第98頁(yè)，共253頁(yè)。以上四種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類(lèi)用的多，后兩類(lèi)只是補(bǔ)充，對(duì)某些植物有利、對(duì)某些植物不僅沒(méi)有利，還有害，實(shí)際工作中要具體分析。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，

39、濃度很低，一般用ppm表示 1ppm=1mg/L99第99頁(yè)，共253頁(yè)。 （四）固化劑和懸浮劑1、固化劑 瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)及某些作物的花藥培養(yǎng)） 瓊脂的用量一般在4-10g/L，所購(gòu)回的瓊脂要先試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。2、懸浮劑Ficoll（聚蔗糖）100第100頁(yè)，共253頁(yè)。 二、培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的種類(lèi)（根據(jù)無(wú)機(jī)鹽的濃度）：1、高無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基 鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類(lèi)齊全，比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及

40、原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基。(Murashige and Skoog)101第101頁(yè)，共253頁(yè)。2、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基 硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的VB1。主要適合與木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基。102第102頁(yè)，共253頁(yè)。3、中等無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類(lèi)減少，但含量較MS的高，維生素種類(lèi)比MS多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有Nitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基。103第103頁(yè)，共253頁(yè)。4、低無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基大量元素含量大幅度降低而且種類(lèi)

41、減少，有機(jī)含量相對(duì)也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。104第104頁(yè)，共253頁(yè)。根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)基分為初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基是指用來(lái)第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基是指用來(lái)接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。 105第105頁(yè)，共253頁(yè)。根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。106第106頁(yè)，共253頁(yè)。4、根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基（就是通常稱(chēng)呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培養(yǎng)基就

42、是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%107第107頁(yè)，共253頁(yè)。 培養(yǎng)基的篩選：1.無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分：一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇?？梢詤⒖记叭说慕?jīng)驗(yàn)，例如：MS是廣譜性培養(yǎng)基，N6用于單子葉植物的培養(yǎng)。豆科多用B5培養(yǎng)基。2、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：必須進(jìn)行篩選試驗(yàn)。總體原則-當(dāng)誘導(dǎo)愈傷組織形成時(shí)，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素相對(duì)平衡；誘導(dǎo)芽分化時(shí)，細(xì)胞分裂素水平應(yīng)高于生長(zhǎng)素，誘導(dǎo)根則要低。3、有機(jī)成分要根據(jù)培養(yǎng)類(lèi)型考慮，如進(jìn)行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復(fù)雜有機(jī)成分，而進(jìn)行細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)

43、則要加108第108頁(yè)，共253頁(yè)。 三、培養(yǎng)基的配制 （一）、貯備液（母液）的配制 為什么要配制母液？ 1）、方便 2）、準(zhǔn)確（有些成分量太?。?以MS培養(yǎng)基配制為例：109第109頁(yè)，共253頁(yè)。1、大量元素母液的配制各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大10倍，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到1000ml的容量瓶中，即為10倍的大量元素母液。倒入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1L培養(yǎng)基取此液100ml。 110第110頁(yè)，共253頁(yè)。注意：(1) 某些無(wú)機(jī)成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用

44、純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級(jí)較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等離子錯(cuò)開(kāi)混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。(2)CaCl22H2O要在最后單獨(dú)加入，在溶解CaCl22H2O時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其溢出。111第111頁(yè)，共253頁(yè)。、微量元素母液的配制MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別是CuSO45H2O、CoCl26H2O，因此在配制中分微量、配制。按照表2

45、，表3配方，用感量為0.0001g的分析天平稱(chēng)量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制1L培養(yǎng)基，取微量10ml，微量ml112第112頁(yè)，共253頁(yè)。113第113頁(yè)，共253頁(yè)。3、鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來(lái)方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時(shí)，配制1L取此液10ml。114第114頁(yè)，共253頁(yè)。在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過(guò)短，會(huì)造成Fe S 04和Na2EDTA鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，

46、Fe S 04會(huì)結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)e S 04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20 - 30 min)，調(diào)pH值至5 .5，室溫放置冷卻后，再冷藏。115第115頁(yè)，共253頁(yè)。4、有機(jī)母液的配制MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱(chēng)量時(shí)用電子分析天平。并貯存在棕色無(wú)菌瓶中 。配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。116第116頁(yè)，共253頁(yè)。 5、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制一般植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以0.5

47、mg/ml為好，需要注意的是：（）配制生長(zhǎng)素類(lèi)，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無(wú)水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。（）細(xì)胞分裂素，例如KT，應(yīng)先用少量95%乙醇或無(wú)水乙醇加34滴1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/L HCl溶解，再用蒸餾水定容。（）GA3以95%酒精溶解（不耐高溫，過(guò)濾滅菌）保存在棕色試劑瓶中。117第117頁(yè)，共253頁(yè)。注意：所有母液都要貼上標(biāo)簽，注明名稱(chēng)、配制倍數(shù)、日期，所有的母液都應(yīng)保存在04冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。118第118頁(yè)，共253頁(yè)。在培養(yǎng)

48、基的配制過(guò)程中，常需要用氫氧化鉀或氫氧化鈉和鹽酸來(lái)來(lái)調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度：（ 1 ）、1摩爾/升KOH液的配制:稱(chēng)取57.1克KOH,加蒸餾水至1000毫升. （ 2）、1摩爾/升NaOH液的配制:稱(chēng)取40克NaOH,加蒸餾水至1000毫升. （ 3）、1摩爾/升HCL液的配制:取濃鹽酸(比重1.19)、82.5毫升加蒸餾水至1000毫升.配制時(shí)先將濃鹽酸緩緩加入約800毫升的蒸餾水中,然后用蒸餾水補(bǔ)足至1000毫升. 119第119頁(yè)，共253頁(yè)。 （二）、培養(yǎng)基的配制 1、計(jì)量 根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計(jì)算需要吸取母液的量，計(jì)算公式：吸取量 ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）1000

49、ml/母液濃度（mg/L）。2、移液取醫(yī)用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計(jì)算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。120第120頁(yè)，共253頁(yè)。注意 （1）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2次。（2）量取母液時(shí)，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。121第121頁(yè)，共253頁(yè)。3、稱(chēng)取瓊脂蔗糖備用4、融化用搪瓷量杯量取600700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。 122第122頁(yè)，共253頁(yè)。5、混合將融化的瓊

50、脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來(lái)回混合幾次。6、調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙(5.47.0)測(cè)培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達(dá)到要求為止(在調(diào)制時(shí)要比目標(biāo)pH值偏高0.20.5個(gè)單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過(guò)程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會(huì)下降0.20.5個(gè)單位左右)。123第123頁(yè)，共253頁(yè)。7、分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/51/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝2030瓶。8、包扎用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，

51、扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫(xiě)上培養(yǎng)基的代號(hào)。9、培養(yǎng)基的滅菌124第124頁(yè)，共253頁(yè)。4 培養(yǎng)條件的選擇 培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組織125第125頁(yè)，共253頁(yè)。一.光照的影響 培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光周期等方面： 光周期：黑暗與光照交替的時(shí)間 光 量：光照強(qiáng)度 光 質(zhì)：光的波長(zhǎng)126第126頁(yè)，共253頁(yè)。1、光周期對(duì)植物細(xì)胞脫分化和再分化的效應(yīng)例1：黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥，其胚狀體的分化與幼植物的 生長(zhǎng)，同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多例2：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條

52、 件下才能分化成根例3：對(duì)日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成 根結(jié)論：光周期的需要與否，應(yīng)根據(jù)植物種類(lèi)、培養(yǎng)的目的來(lái)決定127第127頁(yè)，共253頁(yè)。 離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 愈傷組織誘導(dǎo)階段，一般采用三種做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類(lèi)不同做法不同，多數(shù)植物適合全暗或周期性光照， 器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。128第128頁(yè)，共253頁(yè)。 2、光量的影響 光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植物體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來(lái)說(shuō)，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照

53、強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。離體培養(yǎng)條件下常用的光量，一般為1000-4000lx（勒克斯）。離體培養(yǎng)中通常難以達(dá)到4000lx，一般光量在2000-3000lx。光照強(qiáng)度的高低直接影響器官分化的頻率。 高光量可以降低植物體內(nèi)生長(zhǎng)素水平，低光量使植物體內(nèi)生長(zhǎng)素素水平較高，容易生根129第129頁(yè)，共253頁(yè)。 3、光質(zhì)的影響 光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，2周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。 離體培養(yǎng)條件下，一般用日光燈進(jìn)行光照

54、，光譜成分主要是藍(lán)紫光，波長(zhǎng)為419-467nm。 對(duì)芽分化有效光譜成分為藍(lán)紫光，根分化則受600-680nm所刺激。130第130頁(yè)，共253頁(yè)。二.溫度的影響培養(yǎng)都是在2327之間進(jìn)行，一般采用252。 喜溫性植物：茄科、禾本科、蘭科等。培養(yǎng)溫度一般控制在26-28 冷涼性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培養(yǎng)溫度控制在18-22 或臨界密度)四、影響單細(xì)胞培養(yǎng)的因子相互依賴(lài)植板密度較高時(shí)，與懸浮培養(yǎng)中或愈傷組織中相似的培養(yǎng)基即可；較低時(shí)，則成份非常復(fù)雜，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等化學(xué)不明確物質(zhì)；臨界密度：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)時(shí)，初始植板密度低于某值培養(yǎng)細(xì)胞就不能進(jìn)行分裂和發(fā)育成細(xì)胞團(tuán)

55、，則該值就是臨界密度。初始植板密度應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況而改變，培養(yǎng)基越復(fù)雜則植板細(xì)胞的臨界密度越低，反之則相反。一般要求每毫升在1000個(gè)細(xì)胞以上。208第208頁(yè)，共253頁(yè)。 3、生長(zhǎng)激素加1種細(xì)胞分裂素和幾種氨基酸。臨界密度只需25-30細(xì)胞/毫升。4、pH5、CO2209第209頁(yè)，共253頁(yè)。五、細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1、選擇突變體Question誘變處理的單倍體體細(xì)胞在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)96小時(shí)，有營(yíng)養(yǎng)缺陷的細(xì)胞不能繼續(xù)生長(zhǎng)，只有野生型細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。此時(shí)把BUdR加入培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)36hr， BUdR只能與活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞中的DNA結(jié)合，并使與其結(jié)合的DNA獲得光敏特性，因此當(dāng)把培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)到

56、光下時(shí)，引起在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的那些細(xì)胞DNA嚴(yán)重?fù)p傷，突變細(xì)胞不結(jié)合BUdR。將兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)入完全培養(yǎng)基，只有?細(xì)胞才能繁殖，再經(jīng)過(guò)二倍化處理，可得到純合二倍體突變系。哪種細(xì)胞是突變細(xì)胞？210第210頁(yè)，共253頁(yè)。Production of anthocyanin2、生產(chǎn)天然的植物成分懸浮培養(yǎng)物的某些次生化合物含量有的比植物體高出2-5倍。3、生物轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物給細(xì)胞提供一般情況下植物所不具備的底物化合物；提供植物天然產(chǎn)物的中間體，以期提高天然化合物產(chǎn)量。4、誘導(dǎo)多倍性211第211頁(yè)，共253頁(yè)。分離籬天劍葉肉細(xì)胞的機(jī)械方法葉片消毒勻漿過(guò)濾離心植板75酒精，7次氯酸鈉10ml培養(yǎng)基1.5

57、克1cm2葉片低速，去碎屑，游離細(xì)胞沉降212第212頁(yè)，共253頁(yè)。分離此葉肉細(xì)胞的酶解法葉片消毒無(wú)菌水沖洗，去下表皮4 cm見(jiàn)方小塊2克葉片，20 ml滅過(guò)菌的酶溶液真空泵，去酶25，搖動(dòng)2小時(shí)每30分鐘換酶液，共4次培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，進(jìn)行培養(yǎng)213第213頁(yè)，共253頁(yè)。思考題：如何得到單離細(xì)胞？細(xì)胞培養(yǎng)有哪些方法？如何測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的活力？如何計(jì)量培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目？FDA測(cè)活力的原理是什么？如何獲得同步化的培養(yǎng)細(xì)胞？影響單細(xì)胞培養(yǎng)因素？214第214頁(yè)，共253頁(yè)。4.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)一. 概述 二. 培養(yǎng)系統(tǒng) 三. 植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn) 四.提高細(xì)胞次生代

58、謝產(chǎn)物的途徑 五. 細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)中的有關(guān)技術(shù)問(wèn)題 215第215頁(yè)，共253頁(yè)。IntroductionPrimary metabolites are compounds needed in the basic processes that keep the plant alive, such as carbohydrates, proteins and lipids. Secondary metabolites are compounds produced in plants that are not necessary for the plants basic functions. So

59、me secondary metabolites are produced as chemical defense against microbes and animals. 216第216頁(yè)，共253頁(yè)。Type:Secondary metabolites are used in the pharmaceutical industry, as flavourants and dyes, and in perfumery. Secondary metabolites include terpenes, cardiac glycosides, steroidal compounds, alkal

60、oids and many more.217第217頁(yè)，共253頁(yè)。2植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。 李時(shí)珍（1593）在本草綱目中所開(kāi)列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25的法定藥品來(lái)自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。 產(chǎn)品成分 用途 年銷(xiāo)售額（億美元）長(zhǎng)春花堿（長(zhǎng)春花）治療白血病 1820（美國(guó)）阿嗎靈 循環(huán)系統(tǒng)障礙藥 525（全世界）奎寧（金雞納樹(shù)） 治療瘧疾 510（美國(guó)）致熱素 殺蟲(chóng)劑20（全世界）毛地黃 心臟病藥 2055（美國(guó)） 218第218頁(yè)，共253頁(yè)。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要