薄層色譜法介紹和其應(yīng)用

1、薄層色譜法介紹和其應(yīng)用第一章 概 述第二章 薄層色譜法的分類和原理第三章 薄層色譜法實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第四章 薄層色譜法在中草藥方面的 應(yīng)用目 錄 第一章 概 述 薄層色譜法 指以適宜的固定相涂布于玻璃板、鋁箔片或聚酯薄膜上使成一均勻的薄層，將供試品與相應(yīng)的對(duì)照物點(diǎn)于薄層板的一端，以適宜的溶劑置展開容器中展開，使供試品中所含的相應(yīng)成分分離，采用適合的顯色劑或顯色方法顯色，將供試品色譜與對(duì)照物色譜相比較，或采用薄層掃描儀掃描，以進(jìn)行鑒別、檢查，或含量測定的方法。薄層色譜法 薄層色譜法（Thin Layer chromatography，TLC）是 20 世紀(jì) 50 年代發(fā)展起來的一種平面色譜技術(shù)；至

2、20 世紀(jì) 60 年代后，對(duì)薄層色譜法在使用器材的規(guī)格、操作方法及術(shù)語使用的 標(biāo)準(zhǔn)化等方面進(jìn)行了大量的工作，使該方法日趨成熟和完善。迄今幾十年來， TLC已在醫(yī)藥、濫用毒品檢測、農(nóng)藥、食品、化工、環(huán)保等多方面有了廣泛的應(yīng)用。 薄層色譜技術(shù)產(chǎn)生和發(fā)展可分為以下3個(gè)階段： 起步階段 推廣普及階段 發(fā)展提高階段1938年 N. A. Izmailor和 M. S. Schraiber首次在顯微鏡載玻片上涂布的氧化鋁薄層分離了多種植物酊劑中的成分，標(biāo)志著薄層色譜法的誕生。薄層色譜法具有設(shè)備簡單、操作方便、分離速度快等優(yōu)點(diǎn)，從而發(fā)展很快，并在中草藥的定性定量分析中得到了廣泛應(yīng)用。80年代以來，高效薄層板

3、的出現(xiàn)以及薄層自動(dòng)化儀器的使用，極大地提高了薄層分析結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。有的學(xué)者稱之為現(xiàn)代薄層色譜技術(shù)（Modern TLC)或儀器化薄層色譜技術(shù)（Instrumental planar chromatography)。第二章 薄層色譜法的分類和原理根據(jù)原理分類：薄層色譜法吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜其他薄層色譜吸附色譜： 吸附色譜是利用被分離物質(zhì)在吸附劑上被吸附的能力不同，當(dāng)用展開劑展開時(shí)，不同的物質(zhì)因吸附和解吸附能力的不同而造成的遷移不同，從而達(dá)到分離的目的，是薄層色譜上最常用的方法。常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、硅藻土等。 分配色譜: 分配色譜是利用被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不

4、同使組分分離。常以硅膠、硅藻土、纖維素等作載 體，它們吸附一定量的水分或其它溶劑 (如: 緩沖液、 酸液、甲酰胺、丙二醇等)作固定相，再用與固定相不相混溶的展開劑展開, 被分離物質(zhì)在兩相之間不斷地進(jìn)行分配, 從而達(dá)到分離。 離子交換色譜: 離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離。常用的有離子交換纖維制成的薄層板，用于分離某些親水性強(qiáng)、能成離子態(tài)的物質(zhì)。凝膠色譜： 葡聚糖凝膠的分離原理是葡聚糖凝膠在吸水后形成凝膠粒子，在其交聯(lián)的骨架中有許多一定大小的網(wǎng)眼。網(wǎng)眼大，大分子物質(zhì)能進(jìn)入網(wǎng)眼內(nèi)；網(wǎng)眼小，只有小分子物質(zhì)才能進(jìn)入網(wǎng)眼；而超過一定限度的大分子物質(zhì)，就被排阻在凝膠粒

5、子的外部而不能進(jìn)入網(wǎng)眼。如同按照分子大小過篩一樣，所以稱為分子篩。用于高分子的非離子化合物的分離，如蛋白質(zhì)及核酸等。其他薄層色譜 絡(luò)合薄層色譜法 AgNO3 微乳薄層色譜法 以微乳液為流動(dòng)相 膠束薄層色譜法應(yīng)用一定濃度的表面活性劑溶液 所形成的膠束溶液作為流動(dòng)相 反相薄層色譜法 利用化學(xué)鍵合反應(yīng)，將烴基硅烷鍵 合到硅膠表面，制成非極性固定 相，用極性較大的液體作流動(dòng)相手性固定相法 光學(xué)活性的天然高分子纖維素，纖維素衍生物等第三章 薄層色譜法實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用特點(diǎn)：1、分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中； 2、靈敏度高； 3、展開時(shí)間短； 4、試樣預(yù)處理簡單； 5、上樣量大； 6、儀器簡單操作方便薄層色譜法薄層固

6、定相 、薄層點(diǎn)樣、薄層展 開、顯色、記錄薄層色譜法薄層固定相按照固定相的種類，薄層板可分為正相薄層板（如硅膠薄層板、聚酰胺薄層板）、反相薄層板（如C18鍵合相薄層板）等。硅膠薄層板是目前使用最廣的薄層板，有硅膠G板、硅膠GF254板、硅膠H板和硅膠HF254板等規(guī)格。高效薄層板（HPTLC，High Performance TLC）所使用的固定相較普通薄層板平均粒度小，顆粒分布范圍窄，因此在相對(duì)短的展開距離中可以達(dá)到更好的分離效果。薄層固定相TLCHPTLC平均粒度（m）10-153-7顆粒分布（m）寬窄點(diǎn)樣量（l）大小展距（cm）10-155-8分離時(shí)間（min）30-2003-20檢出限：

7、可見光（ng）100-100010-100 熒光（ng）1-1000.1-10傳統(tǒng)薄層板與高效薄層板的比較薄層固定相 HPTLC與普通TLC的差別A: HPTLC Silica gel 60（Merck）B:硅膠G預(yù)制板(青島海洋化工廠) 展開劑: 氯仿-甲醇-水（15：5：1），10以下放置后的下層溶液顯色: 10%硫酸：乙醇， 105加熱約5分鐘檢視: 可見光和紫外光燈（366nm）樣品：1. 華重樓； 2. 華重樓；3.重樓皂苷I； 4. 重樓對(duì)照藥材；5. 滇重樓；6. 滇重樓；7. 滇重樓AB薄層固定相 HPTLC與普通TLC的差別 硅膠預(yù)制薄層板（DC- Fertigplatten

8、 SIL G-25 MN ） 高效硅膠預(yù)制薄層板（ HPTLC-Fertigplatten Nano-DURASIL-20 MN ） 菊苣薄層鑒別圖譜目前國內(nèi)常用的薄層板：青島海洋化工廠(玻璃)山東煙臺(tái)(玻璃)天津斯利達(dá)(鋁箔)快檢板(鋁箔)薄層固定相薄層點(diǎn)樣以使用的器具不同，點(diǎn)樣可分為手動(dòng)和自動(dòng)點(diǎn)樣。手動(dòng)點(diǎn)樣 主要使用的器具有微升毛細(xì)管、微量注射器或配合與之相應(yīng)的手動(dòng)點(diǎn)樣儀等。自動(dòng)點(diǎn)樣 采用半自動(dòng)點(diǎn)樣儀或全自動(dòng)點(diǎn)樣儀，按預(yù)設(shè)程序自動(dòng)點(diǎn)樣。 薄層點(diǎn)樣CAMAG Linomat5 半自動(dòng)點(diǎn)樣儀CAMAG ATS4 全自動(dòng)點(diǎn)樣儀手動(dòng)點(diǎn)樣毛細(xì)管薄層點(diǎn)樣以點(diǎn)樣方式的不同可分為接觸式點(diǎn)樣和噴霧點(diǎn)樣兩種。

9、接觸式點(diǎn)樣 將吸有樣品溶液的毛細(xì)管或針頭與薄層板表面接觸，從而使樣品在薄層板上形成圓點(diǎn)狀的點(diǎn)。多采用定量毛細(xì)管、微量注射器手動(dòng)點(diǎn)樣，有的儀器也可進(jìn)行自動(dòng)接觸式點(diǎn)樣。噴霧點(diǎn)樣 點(diǎn)樣針針桿勻速緩慢下推，針頭部形成的小液滴被噴頭噴出的氣流吹落到薄層板上，機(jī)械控制薄層板勻速擺動(dòng)，則形成均勻的條帶狀原點(diǎn)。必須采用儀器進(jìn)行。薄層點(diǎn)樣接觸式點(diǎn)樣應(yīng)注意：正確選擇溶解樣品的溶劑原點(diǎn)直徑一般以3mm為宜防止點(diǎn)樣毛細(xì)管損傷薄層表面盡量避免多次點(diǎn)樣防止點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)薄層點(diǎn)樣點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)： 在點(diǎn)樣的同時(shí)，樣品在原點(diǎn)呈環(huán)狀展開，如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將變成空心環(huán)，稱為“點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)”

10、。它會(huì)對(duì)展開造成不良影響。應(yīng)選擇樣品組分溶解度相對(duì)較小的溶劑以避免此現(xiàn)象的產(chǎn)生。薄層點(diǎn)樣噴霧點(diǎn)樣原理針桿點(diǎn)樣針噴頭(氣流)薄層板運(yùn)動(dòng)方向薄層點(diǎn)樣噴霧點(diǎn)樣的優(yōu)點(diǎn)噴霧點(diǎn)樣的優(yōu)點(diǎn)：點(diǎn)樣過程中，點(diǎn)樣器不與薄層板接觸，防止薄層板物理損傷。樣品密集，有利于展開后檢視。減少樣品橫向、縱向擴(kuò)散，樣品斑點(diǎn)窄，展開后分離度提高。自動(dòng)化程度高，樣品溶液不易在針壁上殘留，可提高點(diǎn)樣的準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性。薄層點(diǎn)樣點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)注意選擇適宜的溶劑，溶劑對(duì)樣品的溶解度以及溶液粘度等均會(huì)對(duì)點(diǎn)樣質(zhì)量產(chǎn)生影響。高效薄層板載樣量較普通薄層板小，容易引起過載，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整點(diǎn)樣量。除另有規(guī)定外，點(diǎn)樣基線距底邊10-15mm，高效薄層板一般基線距底

11、邊8-10mm。接觸式點(diǎn)樣原點(diǎn)直徑一般不大于3mm，噴霧式點(diǎn)樣所得條帶寬度一般為5-10mm，高效薄層板條帶寬度一般為4-8mm。點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜，一般不少于8mm，高效薄層板樣品間隔不少于5mm。薄層色譜法基本知識(shí)-操作方法-點(diǎn)樣90手動(dòng)點(diǎn)樣薄層點(diǎn)樣10-15一般8 35-10 單位：mm普通薄層板點(diǎn)樣位置示意圖展開 選擇大小適合的展開容器，將點(diǎn)有樣品的薄層板放入容器內(nèi)的展開劑中，浸入深度以展開劑液面距點(diǎn)樣基線5mm為宜，密閉，展開。一般上行展開8-15cm，高效薄層板上行展開5-8cm。在溶劑前沿達(dá)到預(yù)定展距后，取出薄層板，晾干，待檢測。 展開方式主要有上行展開、下

12、行展開、雙向展開、水平展開、環(huán)形展開等。目前國內(nèi)多采用上行展開。展開邊緣效應(yīng): 薄層展開后，位于薄層板邊緣的樣品斑點(diǎn)比移值較處于中間的斑點(diǎn)大的現(xiàn)象。邊緣效應(yīng)會(huì)使斑點(diǎn)擴(kuò)散變形，從而影響樣品定性結(jié)果的判斷。薄層掃描定量時(shí)，斑點(diǎn)的形狀直接影響到掃描后的峰高和峰寬，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。預(yù)飽和是減少邊緣效應(yīng)的有效辦法。邊緣效應(yīng)示意圖展開預(yù)飽和：可在加入展開劑后使展開容器密閉，放置15-30分鐘，待溶劑蒸汽平衡后，迅速放入點(diǎn)有樣品的薄層板，立即密閉，展開。必要時(shí)可放置適當(dāng)大小的濾紙促使展開缸內(nèi)蒸汽達(dá)到飽和。15-30分鐘展開展開15-30分鐘傾倒展開方法2：在一側(cè)槽內(nèi)加入展開劑，薄層板置另一側(cè)槽內(nèi)，

13、密閉容器，放置15-30分鐘，再迅速將薄層板放入裝有薄層板的展開槽內(nèi)，密閉，展開；或放置到規(guī)定時(shí)間后，保持容器密閉，小心傾斜展開容器，使展開劑進(jìn)入到放置有薄層板的槽內(nèi)，放平展開容器，展開。展開 此外還有薄層自動(dòng)展開儀，可將薄層板按預(yù)定程序單次或多次展開，提高薄層展開的重現(xiàn)性。CAMAG AMD2型自動(dòng)多級(jí)展開儀分離度（resolution，R）定義式：R=2d/（W1+W2）=2L0（Rf2-Rf1）/（W1+W2）相鄰兩峰分開的距離是平均峰寬（W1+W2）/2的幾倍基線分離：基本分離：R最佳分離：W1W2d薄層掃描圖l0顯色 薄層色譜可針對(duì)不同的樣品采用不同的顯色方法和顯色劑進(jìn)行顯色，從而可

14、專門針對(duì)某一類化合物進(jìn)行檢視，或?qū)ψ贤夂涂梢姽庀聼o吸收的化合物檢視。極大地提高了薄層檢視的專屬性與靈敏度。這是薄層色譜法靈活性的一個(gè)集中體現(xiàn)。顯色的方法有：噴霧顯色 、浸漬顯色 以及蒸汽熏蒸顯色等。 顯色顯色方法1、有色化合物直接定位2、無色紫外吸收紫外燈檢出斑點(diǎn)有熒光熒光板上有暗斑顯色劑定位噴霧顯色蒸氣顯色：碘-生物堿、氨基酸衍生物、 肽類、脂類及皂苷噴霧后加熱顯色顯色劑：通用有碘、硫酸動(dòng)畫顯色噴霧顯色 多用玻璃噴瓶或其它專用的噴霧設(shè)備，噴霧形成的霧滴應(yīng)細(xì)小并且均勻。浸漬顯色 多在盛有顯色劑的展開缸中進(jìn)行。蒸汽熏蒸顯色 可在密閉的展開缸、干燥器等容器中進(jìn)行。 顯色顯色是導(dǎo)致薄層掃描定量結(jié)果精

15、密度下降的一個(gè)重要原因，在操作時(shí)應(yīng)特別注意。噴霧顯色時(shí)應(yīng)確保噴出的霧滴大小均勻。薄層板上的的顯色劑也應(yīng)確保均勻。浸漬顯色應(yīng)防止顯色溶液溶解樣品所造成的樣品損失和色譜斑點(diǎn)變形。如薄層板需加熱，可使用烘箱或?qū)Ｓ玫谋蛹訜崤_(tái)。應(yīng)注意加熱的均勻。 常用顯色劑及其使用方法10%硫酸乙醇溶液 為通用型顯色劑。具有一定的腐蝕性。顯色后置105下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在可見光或紫外光365nm下檢視。10%三氯化鋁乙醇溶液 主要針對(duì)黃酮類成分顯色。一般顯色后置紫外光365nm下檢視。碘化鉍鉀試液 主要針對(duì)生物堿類成分顯色。茚三酮試液 針對(duì)氨基酸類化合物顯色。該試劑如接觸人皮膚，會(huì)使其染色，使用使應(yīng)注意避免與皮膚

16、接觸。 顯色設(shè)備 噴霧顯色：噴瓶浸漬顯色：層析缸蒸汽熏蒸顯色：層析缸，密閉容器顯色薄層加熱臺(tái)電動(dòng)噴瓶自動(dòng)浸板器顯色Desaga Chromajet DS20Desaga Chromajet DS20全自動(dòng)定量控制噴霧系統(tǒng)自動(dòng)定量噴霧可控制噴霧區(qū)域、噴霧速度以及噴霧劑用量有利與提高噴霧的重現(xiàn)性節(jié)約溶劑，環(huán)境污染小記錄 可使用膠片照相機(jī)、攝像頭以及數(shù)碼相機(jī)等設(shè)備拍攝色譜結(jié)果，以光學(xué)照片或電子圖形文件保存。在紫外光下拍攝時(shí)，光源發(fā)出的紫外光會(huì)干擾攝像設(shè)備感光，導(dǎo)致拍攝結(jié)果與肉眼觀察存在一定的色差，應(yīng)使用適當(dāng)濾光片濾除紫外光?？梢姽庀逻M(jìn)行檢視的薄層板也可采用電腦掃描儀記錄薄層色譜結(jié)果。 記錄由暗箱及攝

17、像設(shè)備組成。暗箱 配備可見光、254nm和365nm紫外光光源以及相應(yīng)的濾光片。攝像設(shè)備 有膠片照相機(jī)、攝像頭以及數(shù)碼相機(jī)等。其中數(shù)碼相機(jī)以低廉的價(jià)格、清晰的成像，以及與計(jì)算機(jī)的接口便利等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為應(yīng)用的主流。記錄CAMAG Reporstar 3 薄層照相系統(tǒng)CAMAG Reporstar 3 薄層照相系統(tǒng)由暗箱和數(shù)碼相機(jī)組成。可提供可見光以及366、254nm的紫外光。采用WinCats工作站控制，可以滿足GLP要求。記錄可見光366nm展開劑：氯仿-甲醇-水 30：10：1固定相：硅膠G預(yù)制板顯色劑：2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液 樣品：制劑及柴胡對(duì)照藥材定性和定量分析利用Rf值

18、定性（或相對(duì)比移值Rr）Rf值+斑點(diǎn)顏色特征（原位化學(xué)反應(yīng)）多種展開劑體系展開進(jìn)行驗(yàn)證與其他技術(shù)聯(lián)用（一）定 性（二）定量1. 洗脫定量： 薄層分離取下斑點(diǎn)洗脫離心 取上清液進(jìn)行測定2. 原位直接測定 測定方法：目視、測面積、薄層掃描薄層掃描法島津-9301PCCAMAG Scanner 3概述 薄層掃描法 是指用一束一定波長、一定強(qiáng)度的紫外或可見光對(duì)薄層板進(jìn)行掃描，測定薄層板上的樣品斑點(diǎn)對(duì)光的吸收強(qiáng)度或斑點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，所得到圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)可用于藥品的鑒別、檢查及含量測定。Kubelka-Munk方程是薄層掃描法定量的依據(jù)。 概述薄層掃描法的分類及一般原理按照掃描方式的不同，薄層

19、掃描法可分為吸收法與熒光法。薄層掃描法吸收式測定可采用反射法以及透射法兩種方式進(jìn)行掃描。透射法大多用于凝膠色譜的掃描，非透明界質(zhì)薄層板的掃描主要為反射式吸收法或熒光法掃描。概述薄層掃描法的分類及一般原理反射法測定透射法測定概述薄層掃描法的分類及一般原理 薄層掃描可使用單波長和雙波長進(jìn)行測定。單波長薄層掃描適合于分離度好，背景干擾少的薄層。雙波長薄層掃描時(shí)用測定波長和參比波長分別掃描薄層板，測定樣品斑點(diǎn)在兩波長下的吸收度之差。雙波長掃描可減少分離度欠佳的兩組分間的相互干擾，減少薄層板的背景干擾，操作時(shí)應(yīng)選擇待測斑點(diǎn)吸收較小或無吸收的波長作為參比波長。 在CAMAG Scanner 3型儀器中雙波

20、長掃描又稱為背景校正模式（Background Correction)。概述薄層掃描法的分類及一般原理雙波長測定對(duì)薄層掃描背景的影響概述薄層掃描法的分類及一般原理參比波長測定波長雙波長測定對(duì)薄層掃描背景的影響概述薄層掃描法的分類及一般原理 根據(jù)掃描時(shí)光束的軌跡不同，薄層掃描又可分為線性掃描和鋸齒掃描。 線性掃描時(shí)一般采用一束比待測斑點(diǎn)略寬的狹窄光帶沿展開方向做單向等速掃描，它適于形狀較規(guī)則斑點(diǎn)的掃描。 鋸齒掃描使用的微小正方形光束在沿展開方向運(yùn)動(dòng)的同時(shí)，在垂直于展開方向也進(jìn)行往復(fù)掃描，掃描過程中光束的運(yùn)動(dòng)軌跡呈鋸齒形或矩形，它對(duì)于形狀不規(guī)則或濃度分布不均勻的斑點(diǎn)掃描重復(fù)性較好，但掃描速度較慢。

21、概述薄層掃描法的分類及一般原理線性掃描鋸齒掃描概述薄層掃描法的分類及一般原理線性掃描速度較快，但對(duì)形狀不規(guī)則斑點(diǎn)掃描結(jié)果容易產(chǎn)生誤差。CAMAG的儀器即采用線性掃描，在操作時(shí)應(yīng)注意保證展開后斑點(diǎn)的均勻性。只有好的薄層色譜結(jié)果才能有好的掃描定量結(jié)果。鋸齒掃描對(duì)于形狀不規(guī)則或濃度分布不均勻的斑點(diǎn)掃描重復(fù)性較好，但掃描速度較慢。島津的CS-9301PC等儀器即可以采用此種掃描方式進(jìn)行掃描。概述薄層掃描定量原理 在采用反射式吸收法測定時(shí)，入射光照射到薄層板上，一部分光透射過薄層板，一部分光發(fā)生反射，此外還有大量的散射光。因此，薄層掃描定量不遵從于Lambert-Beer定律，其樣品量與反射光強(qiáng)度符合K

22、ubelka-Munk方程：(1-R)2其中R為反射光強(qiáng)，為樣品吸收系數(shù)C為樣品濃度，S為薄層板散射系數(shù)儀器 薄層掃描儀主要由光源、單色器、薄層板臺(tái)、檢測器以及工作站組成。光源 主要有鎢燈、氘燈、汞燈和氙燈等。其中汞燈為線光源，可發(fā)射特征輻射光譜。單色器 用來提供一定波長的單色光。其結(jié)構(gòu)與一般的紫外分光光度計(jì)類似，通常由入射狹縫、出射狹縫、平行光裝置、色散元件等組成。薄層掃描儀多采用光柵為其色散元件。儀器 薄層板臺(tái) 掃描時(shí)薄層板固定于薄層板臺(tái)上，薄層板臺(tái)可橫向及縱向移動(dòng)，以完成對(duì)整塊薄層板的掃描。檢測器 多采用光電倍增管。此外還有監(jiān)測入射光能量的參比光電倍增管，以減少入射光強(qiáng)度變化對(duì)掃描結(jié)果的

23、影響。工作站 可設(shè)定儀器參數(shù)，接收并存儲(chǔ)掃描結(jié)果，進(jìn)行積分和其它計(jì)算。 儀器 島津CS-9301型薄層掃描儀光路圖儀器 CAMAG Scanner 3薄層掃描儀光路圖 儀器性能檢定儀器波長準(zhǔn)確度的檢查 可利用汞燈的特征譜線光譜對(duì)儀器的波長準(zhǔn)確度進(jìn)行檢查。選取汞燈，在200-700nm波長范圍內(nèi)以熒光方式掃描吸收?qǐng)D譜，圖譜中的峰位與汞燈的譜線中相應(yīng)波長的差即為儀器波長精確度。汞燈譜線的已知波長為，。在CAMAG等儀器的工作站中有專用的儀器檢定軟件，按要求操作即可自動(dòng)進(jìn)行儀器波長準(zhǔn)確度等檢查。其結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。 儀器重復(fù)性誤差的測定 對(duì)薄層板上同一斑點(diǎn)重復(fù)多次掃描，計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。取脫水穿心蓮

24、內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1ml含1mg的溶液。取1ul點(diǎn)至空白薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇（4：3：）為展開劑展開，取出，晾干，雙波長法掃描，連續(xù)掃描10次，掃描波長：S=263nm，R=370nm，以峰面積積分值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，鋸齒狀掃描應(yīng)1.5%，線性掃描應(yīng) 2.0%。系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 按各品種項(xiàng)下要求對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)，包括檢測限、分離度和重復(fù)性，應(yīng)符合規(guī)定。檢測靈敏度 用于限量檢查時(shí)，采用供試品溶液與稀釋若干倍的對(duì)照品溶液在規(guī)定的色譜條件下，于同一塊薄層板上點(diǎn)樣、展開、檢視，后者應(yīng)呈清晰的斑點(diǎn)。分離度 用于鑒別時(shí)，對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜中相應(yīng)的斑點(diǎn)，

25、均應(yīng)顯示為清晰分離的斑點(diǎn)。用限量檢查或含量測定時(shí)，要求待測斑點(diǎn)與相鄰斑點(diǎn)之間有較好的分離度。 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)分離度（R）的計(jì)算公式為： R=2(d2-d1)/(W1-W2) d2為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的間距 d1為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的間距 W1及W2為相鄰兩峰各自的峰寬除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于。系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 重復(fù)性 系指同一薄層板上同一樣品溶液相同濃度的的斑點(diǎn)，掃描結(jié)果的差異。如薄層板展開后直接掃描，在同一薄層板上平行點(diǎn)樣的待測成分斑點(diǎn)（不少于4個(gè)點(diǎn)）的峰面積測量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于3.0%；如需顯色后掃描，其標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。 薄層掃描定量方法 反射式吸收法測定時(shí)，Ku

26、belka-Munk方程是定量的依據(jù)，樣品量與反射光強(qiáng)度不呈直線的線性關(guān)系。但是在一個(gè)較窄的范圍內(nèi)，曲線可近似為一條直線，從而采用外標(biāo)一點(diǎn)法或兩點(diǎn)法定量測定。如在測定范圍內(nèi)工作曲線直線回歸線性關(guān)系較差，可根據(jù)不同儀器采用不同方法進(jìn)行校正。 在島津CS系列薄層掃描儀上，有線性補(bǔ)償器（Linarizer），它可依據(jù)Kubelka-Munk方程用電路系統(tǒng)將的曲線校正為直線后用于定量。 CAMAG等薄層掃描儀則可使用二次方程曲線表達(dá)樣品量與反射光強(qiáng)度之間的關(guān)系，進(jìn)行定量測定。 薄層掃描定量方法含量測定時(shí)供試品溶液和對(duì)照品溶液應(yīng)交叉點(diǎn)于同一薄層板上，供試品點(diǎn)樣不得少于4個(gè)，對(duì)照品每一濃度不得少于2個(gè)。其

27、計(jì)算結(jié)果如薄層板展開后直接掃描，不同樣品溶液計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于3.0%；如需顯色后掃描，其標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。 注意事項(xiàng)除另有規(guī)定外，薄層掃描定量應(yīng)使用預(yù)制薄層板。薄層色譜分析的各個(gè)步驟如點(diǎn)樣、展開等，均會(huì)影響薄層掃描結(jié)果的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性，因此在實(shí)驗(yàn)的各個(gè)步驟均應(yīng)嚴(yán)格操作。掃描時(shí)應(yīng)沿展開方向自下而上進(jìn)行掃描，不能橫向掃描。測定記錄中應(yīng)包含薄層掃描圖，積分結(jié)果，工作曲線及回歸方程和相關(guān)系數(shù)，及測定結(jié)果計(jì)算方法。第四章 薄層色譜法在中草藥方面的應(yīng)用中草藥成分復(fù)雜，中藥復(fù)方制劑中化學(xué)成分更復(fù)雜，自薄層色譜采用以來，為分析中藥及其制劑提供了有效的方法。在這方面，我國藥物分析工作者作了大量

28、的工作。主要應(yīng)用在：中藥材品種的真?zhèn)舞b別中藥及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中藥資源調(diào)查和質(zhì)量評(píng)價(jià)中藥的安全性檢測（非法添加）某些中藥的指紋圖譜中藥的快速檢驗(yàn)利用被鑒別化合物薄層色譜中的Rf值、斑點(diǎn)顏色及原位光譜掃描可作為藥物的鑒別方法之一，因?yàn)榉椒焖佟⒑啽阋仔?，故?yīng)用廣泛，在各國藥典中普遍采用，我國藥典，特別是一部中更是大量應(yīng)用了薄層色譜法用于中藥材及其制劑的鑒別和部分含量測定。 中國藥典一部 1995年版 2000年版 2005年版 417 602 1523 在2005版藥典中修訂的內(nèi)容2005版藥典中對(duì)薄層色譜法作出了詳細(xì)的規(guī)定，主要有以下的修訂內(nèi)容：明確除另有規(guī)定外，薄層掃描含量測定應(yīng)使用預(yù)制

29、板。對(duì)點(diǎn)樣位置和斑點(diǎn)大小做出了詳細(xì)的規(guī)定，并對(duì)條帶狀點(diǎn)樣以及高效薄層板的點(diǎn)樣做出了具體規(guī)定。將薄層記錄作為一個(gè)薄層操作的一部分單獨(dú)列出。表明薄層記錄的重要性。在2005版藥典中修訂的內(nèi)容在方法中提出了系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)，并規(guī)定應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，使其達(dá)到規(guī)定的檢測靈敏度、分離度和重復(fù)性要求。 對(duì)計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行了修改，規(guī)定如薄層板展開后直接掃描，不同樣品溶液計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于3.0%；如需顯色后掃描，其標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。明確規(guī)定掃描時(shí)應(yīng)沿展開方向掃描，不可橫向掃描。直接對(duì)照； 三七膠囊以三七總皂苷為參照物 噴10%硫酸乙醇溶液，105或熱風(fēng)加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色

30、譜中，在與對(duì)照物色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色的斑點(diǎn)。 1 21：三七膠囊；2：三七總皂苷對(duì)照物.雙黃連口服液中黃芩苷薄層鑒別采用蘆丁為參比物。先置紫外燈（365nm）下直接觀察，供試品色譜在與蘆丁參照物色譜相應(yīng)位置附近，應(yīng)顯相同顏色的斑點(diǎn)；再噴1%三氯化鋁乙醇溶液，紫外燈（365nm）下觀察，蘆丁斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S綠色，上述供試品斑點(diǎn)不變色。 1 2 1 2 紫外光(365nm)下直接觀察 1%三氯化鋁乙醇溶液顯色 紫外光(365nm)下觀察圖 1 雙黃連口服液樣品 2 蘆丁對(duì)照品雙黃連口服液中黃芩苷薄層鑒別采用蘆丁為參比物。先置紫外燈（365nm）下直接觀察，供試品色譜在與蘆丁參照物色譜相應(yīng)位置

31、附近，應(yīng)顯相同顏色的斑點(diǎn)；再噴1%三氯化鋁乙醇溶液，紫外燈（365nm）下觀察，蘆丁斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S綠色，上述供試品斑點(diǎn)不變色。 1 2 3 1 2 3紫外光(365nm)下直接觀察 1%三氯化鋁乙醇溶液顯色紫外 光(365nm)下觀察圖1 雙黃連口服液樣品 2 蘆丁對(duì)照品 3黃芩苷對(duì)照品應(yīng)用實(shí)例不同條件下檢視可以避免一些假陽性結(jié)果產(chǎn)生可見光365nm展開劑：氯仿-甲醇-水 30：10：1固定相：硅膠G預(yù)制板顯色劑：2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液 樣品：制劑及柴胡對(duì)照藥材 制備薄層色譜旋轉(zhuǎn)薄層加壓薄層薄層原位水解 用于苷類成分的水解, 鑒定糖的種類, 可 進(jìn)行單相或雙相展開，輔助苷類成分的結(jié)

32、構(gòu)鑒定。常用展開劑1、對(duì)展開劑的要求 對(duì)被測組分有良好的溶解性 有良好的分離效果 斑點(diǎn)圓整不拖尾 被測組分Rf值最好在，組分較多，最好在 展開劑不能和被測組分發(fā)生反應(yīng) 沸點(diǎn)適中，粘度較小石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)正己烷-乙酸乙酯-甲醇(6.4:3.6:0.5), 氨蒸氣飽和乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水 氯仿-甲醇系統(tǒng)氯仿-甲醇-水 (65:35:10)下層氯仿-甲醇-水 (2.5:1:0.5)氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水 (15:40:22:10) 正丁醇-冰醋酸-水 (4:1:5)薄層板及其處理薄層板表面應(yīng)均勻、平整、光滑，無麻點(diǎn)、無氣泡、無破損及污染。薄層板放置過久被雜質(zhì)污染，可用氯仿、甲醇或二者的混合溶劑展開預(yù)洗。改性薄層板可在自制薄層板時(shí)加入改性劑，或用改性劑浸漬薄層板制備。薄層板使用前可于110下活化30分鐘，置干燥器或密閉容器中保存?zhèn)溆?。預(yù)洗后的薄層板也應(yīng)重新活化。Camag Linomat-5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀操作Linomat 5 半自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣方式 噴霧點(diǎn)樣可使用的點(diǎn)樣針體積 100，500ul可使用的薄層板大小 1010，1020，2010，2020cm軟件 WinCats薄