免疫組化操作詳解

1、免疫組化操作詳解洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠 等除去，同時(shí)使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整，便于組織吸附,然后置于清水中清洗，除 去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4 （大約沖一個(gè)小時(shí)左右），再將載玻片浸泡于酒精之中，然后放到 架子上，置于37C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)的組織 帶負(fù)電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于 石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成 固態(tài)。切片：將包埋好的組織從模具上取下

2、來，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過調(diào)節(jié)上下左 右來來使組織和切割方向一致，然后調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5 pm,如果比較難切，則可以適當(dāng) 調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40C溫 水中。撈組織：當(dāng)組織載玻片置于40C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受 熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，最好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí)，一般取載玻片 的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織， 做對(duì)照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候最好方向一致，以便觀察，再將 撈出來的載玻片置于架子上

3、，放入37C溫箱中烘干。脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80% 酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個(gè)試劑中放 10min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話，就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，一般為12-15min.抗原修復(fù)：脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性 的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了 使抗原的位點(diǎn)暴露出來。血清

4、封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中 5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來，然 后放入37C溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍（900plPBS： 100pl血清封閉液）。加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加 一抗，如果做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4C冰箱中保存過夜。加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS 后加上二抗，然后置于37C溫箱中半小時(shí)。10.加SABC:將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5m

5、in，擦干組織周圍的PBS 后加上SABC,然后置于37C溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990plPBS： 10plSABC）。加顯色劑：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS 后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻， 再加1滴顯色劑C，搖勻）A： DAB B： H2O2 C：磷酸緩沖液復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織 為半分鐘，植物組織3-5min。脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90% 酒精-95%酒精-100%酒

6、精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯 中，搬到通風(fēng)柜中。14.封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)， 然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。1、載玻片的處理：抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的 正常進(jìn)行，可選用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對(duì)已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：APES:現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20

7、30秒鐘， 取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此 載玻片撈片時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留廣2分鐘， 然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時(shí)，裝盒備用。Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液 中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為 非玻璃制品。2、常用酶消化：2.1胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%0.

8、1%，消化時(shí)間為37C、1040分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi) 抗原的顯示。2.2胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時(shí)間為37C、30180分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗 原的顯示，如：Laminin （層粘蛋白），Collagen IV （IV型膠原）等。2.3皂素（Saponin）： 一般使用濃度為210 g/ml的saponin溶液，消化時(shí)間為室溫孵育 30分鐘。3、抗原熱修復(fù)：可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)。 抗原熱修復(fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以0.01M枸櫞 酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請(qǐng)選用我公司提供的

9、ZLI-9064枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配 制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 0.1，如因蒸餾水本身 造成的pH值偏差，請(qǐng)自行調(diào)整。3.1石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2 分鐘X3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液 體溫度保持在92C98C之間并持續(xù)1015分鐘（注意：無(wú)論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請(qǐng)根 據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求。取出容器，室溫冷卻 1020分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型） PB

10、S洗，下接免疫組化染色步驟。3.2石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液 （工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液 面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱56分鐘后），計(jì)時(shí)12分鐘，然后將壓 力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分 鐘X3，下接免疫組化染色步驟。3.3石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工 作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小 容器的溫度到達(dá)92C98C起

11、開始計(jì)時(shí)1520分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻2030分鐘，蒸餾 水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。4、免疫組化染色步驟：（以美國(guó)ZYMED公司SP試劑盒為例）石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育510分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，（如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）。510%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比 例稀釋的一抗或一抗工作液，37C孵育12小時(shí)或4C過夜。PBS沖洗，5分鐘X3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37C孵育1030分鐘；或滴加第 二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37C或室溫孵育1030分鐘。PBS沖洗，5分鐘X3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37C孵育1030分鐘；或第二代 辣根