蛇毒鎮(zhèn)痛抗炎課件

1、眼鏡蛇長(zhǎng)鏈和短鏈神經(jīng)毒素(科博肽）新藥開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)1.蛇毒研究概述蛇毒是蛇的毒腺分泌的多種組分構(gòu)成的復(fù)雜的混合物。含有多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其它小分子物質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性。按其生理活性可分為神經(jīng)毒素，細(xì)胞毒素，神經(jīng)生長(zhǎng)因子和類凝血酶等。 美國(guó)制成cobroxin和nyloxin兩種制劑，用于治療頑固性疼痛、惡性腫瘤疼痛和關(guān)節(jié)痛。 我國(guó)有科博肽注射液用于治療疼痛，但由于純度不高（92%），注射部位產(chǎn)生硬結(jié)，銷售量不大。 蛇毒鎮(zhèn)痛藥物開(kāi)發(fā)神經(jīng)毒素（科博肽）：從眼鏡蛇蛇毒中提純的一種多肽（71或62個(gè)氨基酸，有4-5個(gè)二硫鍵）。 是nAChR特別是1、4、7受體亞型的高親和配體，與7-nACh

2、R受體形成復(fù)合物。CTX的Trp-25, Asp-27, Phe-29, Arg-33, Arg-36 and Phe-65能和7-以及肌肉型nAChR結(jié)合。 長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素（CTX）：腹腔內(nèi)注射：30, 45, 68 g/kg)腦室(CTX：4.5 g/kg)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(CTX：4.5 g/kg)三種給藥方式以熱板致痛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，和醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，考察CTX的鎮(zhèn)痛作用和部位。 一、眼鏡蛇神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛作用研究在熱板實(shí)驗(yàn)和小鼠扭體實(shí)驗(yàn)中，CTX(30, 45, 68 g/kg，i.p)能分別劑量依賴性地提高小鼠痛閾和降低小鼠扭體次數(shù)。鎮(zhèn)痛作用在給藥后3小時(shí)達(dá)到頂峰。腦室內(nèi)和腹膜內(nèi)注射

3、也能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。提示CTX可能通過(guò)中樞起鎮(zhèn)痛作用。 Icv 4.5 ugPAG 4.5 ug采用5%福爾馬林足皮下注射的方式造成大鼠炎性疼痛模型，CTX（34,45ugkg-1, i.p.）降低大鼠痛級(jí)均數(shù).眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素(Cobrotoxin)：含64-83個(gè)氨基酸，其分子量為6946左右。 序列：mktllltllv vtivcldlgy tlechnqqss qtptttgcsg getncykkrw rdhrgyrter gcgcpsvkng ieinccttdr cnn，短鏈神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用短鏈神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用Icv 2.4 ugPAG 1.2 ug眼鏡蛇神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)

4、，起效慢，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。其鎮(zhèn)痛部位可能在中樞及外周，對(duì)多種疼痛模型均有效 無(wú)依賴性及快速耐受性，與阿片系統(tǒng)無(wú)關(guān)。 鎮(zhèn)痛作用特點(diǎn)二、蛇毒和科博肽的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用口服蛇毒抑制注射福爾馬林引起的炎癥反應(yīng)口服蛇毒抑制注射雞蛋清引起的炎癥反應(yīng)口服蛇毒抑制注射福爾馬林引起的炎癥反應(yīng)眼鏡蛇毒提高天然免疫力眼鏡蛇毒增強(qiáng)體液免疫眼鏡蛇毒抑制T細(xì)胞眼鏡蛇毒翻轉(zhuǎn)激素誘導(dǎo)的免疫低下口服科博肽延長(zhǎng)同種異體皮片存活時(shí)間口服科博肽降低血清白介素2水平口服科博肽抑制T細(xì)胞增殖口服科博肽CD4/CD8細(xì)胞比值三、蛇毒和科博肽治療自身免疫性疾病研究CTX抗炎鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究藥效研究機(jī)制研究AA大鼠足腫脹測(cè)定繼發(fā)性AA大鼠MWT

5、測(cè)定繼發(fā)性AA大鼠冷刺激反應(yīng)AA大鼠滑膜形態(tài)學(xué)觀察相關(guān)受體細(xì)胞因子非特異性免疫疼痛信號(hào)分子表達(dá)阿片受體M-AchR42,7-nAChR 致炎因子抑炎因子免疫器官測(cè)定碳粒廓清實(shí)驗(yàn)c-Fos表達(dá)c-Jun表達(dá)對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠藥效和機(jī)制研究 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種進(jìn)行性、系統(tǒng)性，以侵犯骨、關(guān)節(jié)為主的自身免疫性疾病， 發(fā)病率：12。RA定義發(fā)病機(jī)理細(xì)胞因子滑膜病變滑膜水腫、肥厚、增生，血管增生，纖維蛋白原沉淀，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)免疫功能異常溶體酶釋放關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞致炎因子：IL-1,TNF-，IL-2, PGE2, IL-6 抗炎因子：IL-4, IL-10, IL-1R類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究概況治療類風(fēng)濕性關(guān)

6、節(jié)炎藥物研究現(xiàn)狀甾體抗炎免疫藥 改善病情抗風(fēng)濕藥物 非甾體抗炎藥 抑制PGE2水楊酸類、吲哚類、丙酸類、苯乙酸類及噻嗪類 引起胃腸道不良反應(yīng)，凝血障礙，而且不能改變疾病進(jìn)程或關(guān)節(jié)破壞 抑制炎性因子的釋放，并抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖和分化糖皮質(zhì)激素類藥物嚴(yán)重的激素樣副作用影響其臨床應(yīng)用 改善病情并延緩骨關(guān)節(jié)破壞抗瘧藥(如氯喹、羥氯喹)、金制劑、青霉胺、柳氮磺胺吡啶、雷公藤及免疫抑制劑 .藥物發(fā)揮作用慢，臨床癥狀明顯改善需16個(gè)月 長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素（CTX）對(duì)原發(fā)性佐劑關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響 （腹腔注射）*p0.05 vs saline, p0.001 vs normal controlC

7、TX對(duì)繼發(fā)性佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響（腹腔注射） *p0.05, *p0.01, *p0.001 vs saline group. CTX對(duì)繼發(fā)性AA大鼠機(jī)械縮腿閾(MWT)的影響 （腹腔注射）p0.01 vs normal control, *p0.05 vs saline group, *p0.01 vs saline groupCTX對(duì)繼發(fā)性AA大鼠冷刺激反應(yīng)的影響 （腹腔注射） p0.05, p0.01 vs normal control, *p0.01 ,*p0.001 vs saline group 繼發(fā)性AA大鼠滑膜組織HE染色 （腹腔注射）ABCDEFA:Normal C

8、ontromB:SalineC:CTXD:AtropineE:CTX+Atro(0.25mg/kg)F:CTX+Atro(5mg/kg) 繼發(fā)性AA大鼠滑膜組織VG染色 （腹腔注射）ABCDEFA:Normal ContromB:SalineC:CTXD:AtropineE:CTX+Atro(0.25mg/kg)F:CTX+Atro(5mg/kg)短鏈神經(jīng)毒素灌胃或經(jīng)皮膚給藥對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的影響*P0.05，與空白對(duì)照組相比; #P0.01,與正常對(duì)照組相比 短鏈神經(jīng)毒素灌胃或經(jīng)皮膚給藥對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的影響 *P0.05，與空白對(duì)照組相比

9、; #P0.01, #P0.001,與正常對(duì)照組相比短鏈神經(jīng)毒素注射給藥對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的影響*P0.05，*P0.001，與空白對(duì)照組相比 短鏈神經(jīng)毒素注射給藥對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎機(jī)械痛閾的影響*P0.05, *P0.001，與空白對(duì)照組相比鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)于阿司匹林短鏈神經(jīng)毒素注射給藥弗氏完全佐劑致大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的影響短鏈神經(jīng)毒素注射給藥對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎機(jī)械痛閾的影響*P0.05, *P0.001，與空白對(duì)照組相比，# P0.05，#P0.01，與正常對(duì)照組相比 小 結(jié)1. CTX減少福爾馬林致痛大鼠相和相的舔足時(shí)間,減輕大鼠的疼

10、痛反應(yīng)。 2. CTX抑制原發(fā)性和繼發(fā)性AA大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹，具有顯著的抗炎作用。 3. CTX能提高繼發(fā)性AA大鼠的機(jī)械縮腿閾，并延長(zhǎng)其對(duì)冷刺激潛伏期，提示CTX有鎮(zhèn)痛作用。 5. CTX減少AA大鼠滑膜、血管、膠原蛋白增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而達(dá)到改善滑模病變。眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有明顯的治療作用，能減輕關(guān)節(jié)腫大，疼痛等癥狀，改善關(guān)節(jié)病理改變，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過(guò)口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點(diǎn)。 優(yōu) 點(diǎn)口服科博肽對(duì)慢性腎病的治療作用研究科博肽減少尿蛋白科博肽升高血漿白蛋白科博肽降低血漿球蛋白科博肽改輕腎臟病理變化作用機(jī)制研究阿托品抑制長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用納洛酮對(duì)長(zhǎng)

11、鏈神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛作用沒(méi)有影響阿托品對(duì)抑制短鏈神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用納洛酮對(duì)短鏈神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用沒(méi)有影響阿托品抑制長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素在福爾馬林模型上的鎮(zhèn)痛作用#p0.05 vs CTX group 阿托品部分抑制長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素抑制原發(fā)性AA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的作用p0.01, p0.001, vs normal control.阿托品部分取消長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素抑制繼發(fā)性AA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的作用*p0.05 vs saline group, #p0.05 vs CTX group.阿托品部分對(duì)抗長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素提高繼發(fā)性AA大鼠機(jī)械縮腿閾的作用 p0.01 vs normal control, #p0.05 vs CTX

12、group 阿托品部分對(duì)抗長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素延長(zhǎng)繼發(fā)性AA大鼠冷刺激反應(yīng)潛伏期的作用 p0.05 p0.01 vs normal control , #p0.05 vs CTX group N受體拮抗劑甲基牛扁堿部分取消長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素抑制原發(fā)性AA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的作用p0.001 vs normal control, *p0.05 vs saline group, #p0.05 vs CTX group. N受體拮抗劑甲基牛扁堿部分取消長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素提高原發(fā)性AA大鼠機(jī)械縮腿閾的作用 p0.01 vs normal control, *p0.05 vs saline group, #p0.05 #p0.

13、01 vs CTX group. 炎癥因子的釋放實(shí)驗(yàn) 長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素對(duì)繼發(fā)性AA大鼠血清中PGE2的影響 p0.001 vs normal control, *p0.01 *p0.001 vs saline group.長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素對(duì)繼發(fā)性AA大鼠血清IL-1, TNF-的測(cè)定 p0.01 p0.001 vs normal control, *p0.05 *p0.01 vs saline group.長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素繼發(fā)性AA大鼠血清IL-2，IL-10的測(cè)定 p0.001 vs normal control, *p0.05 *p0.01 vs saline group.神經(jīng)電生理實(shí)驗(yàn)Cobrato

14、xin對(duì)丘腦束旁核神經(jīng)元痛放電的抑制及其機(jī)制的初步分析圖10 i.c.v.三種劑量Cobratoxin對(duì)Pf神經(jīng)元痛放電頻率的影響 i.c.v.三種劑量Cobratoxin對(duì)Pf神經(jīng)元痛放電持續(xù)時(shí)間的影響 （4.5, 1.12, 0.56g/kg) 量效關(guān)系明顯Cobratoxin 對(duì)Pf神經(jīng)元痛放電有明顯的量效關(guān)系，抑制時(shí)間較長(zhǎng)，效果大于嗎啡。而且隨著劑量的加大，抑制時(shí)程相應(yīng)延長(zhǎng)。 i.c.v.阿托品和納洛酮對(duì)Cobratoxin抑制Pf神經(jīng)元痛放電的影響 pCPA預(yù)處理對(duì)Cobratoxin抑制Pf神經(jīng)元痛放電的影響抑制低電壓鈣通道通過(guò)激動(dòng)膽堿能M3，M4受體抑制鈣內(nèi)流電生理研究小結(jié)側(cè)腦室

15、注射Cobratoxin能劑量依賴性的抑制丘腦束旁核神經(jīng)元的痛誘發(fā)放電；側(cè)腦室注射阿托品能阻斷該抑制效應(yīng)；對(duì)氯苯丙氨酸預(yù)處理能部分阻斷該抑制效應(yīng)。結(jié)合測(cè)痛的行為學(xué)結(jié)果提示：Cobratoxin的鎮(zhèn)痛效應(yīng)是通過(guò)中樞M型膽堿受體介導(dǎo)的，且中樞5-羥色胺能系統(tǒng)也部分參與了Cobratoxin的鎮(zhèn)痛作用。申報(bào)重大專項(xiàng)的基礎(chǔ)科博肽純度98%以上申報(bào)重大專項(xiàng)的基礎(chǔ)口腔速溶藥膜申報(bào)重大專項(xiàng)的基礎(chǔ)口腔粘膜吸收科博肽科博肽在胃液中穩(wěn)定申報(bào)重大專項(xiàng)的基礎(chǔ)藥效確切：免疫調(diào)節(jié)抗炎鎮(zhèn)痛抑制炎癥因子減輕關(guān)節(jié)損傷申報(bào)重大專項(xiàng)的基礎(chǔ)毒副作用小急毒：蛇毒腹腔注射700 g/kg,口服102 mg/kg,科博肽腹腔注射70 g/

16、kg，口服待測(cè)。慢毒：蛇毒12個(gè)月灌胃沒(méi)有毒性反應(yīng)。申報(bào)重大專項(xiàng)的基礎(chǔ)知識(shí)產(chǎn)權(quán)（授權(quán)發(fā)明專利）：1.眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素（cobrotoxin）在制備治療關(guān)節(jié)炎藥物中的用途。中國(guó)發(fā)明專利。第一發(fā)明人，專利號(hào)：200910144909.3。國(guó)際PTC專利申請(qǐng)中。2. 眼鏡蛇毒物理改性方法和在制備鎮(zhèn)痛和免疫抑制藥中的應(yīng)用。中國(guó)發(fā)明專利，第一發(fā)明人，專利號(hào): 201110065634.1。3. 膽堿能M3、M4受體激動(dòng)劑在制備新型鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。中國(guó)發(fā)明專利，第二發(fā)明人，專利號(hào): 201110072563.8。申報(bào)重大專項(xiàng)的基礎(chǔ)申報(bào)中的發(fā)明專利：1. 眼睛蛇神經(jīng)毒素（cobrotoxin）在制備免疫

17、抑制藥物中的用途。中國(guó)發(fā)明專利，第一發(fā)明人，申請(qǐng)?zhí)? 20101017466.9。2.眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素（cobrotoxin）在制備鞘內(nèi)鎮(zhèn)痛藥中的用途。中國(guó)發(fā)明專利，第一發(fā)明人，申請(qǐng)?zhí)? 201110072186.8。3.物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。中國(guó)發(fā)明專利，第一發(fā)明人，申請(qǐng)?zhí)枺?0111036196.X。4.中華眼鏡蛇毒在制備治療糖尿病和糖尿病腎病并發(fā)癥中的用途。中國(guó)發(fā)明專利，第一發(fā)明人，申請(qǐng)?zhí)枺?01210001035.8。5.物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療肺肺纖維化藥物中的用途。中國(guó)發(fā)明專利，第一發(fā)明人，申請(qǐng)?zhí)?01110443384.0。6. 眼鏡蛇毒在制備治療急