基因工程與蛋白質(zhì)工程課件

1、第十三章 基因工程與蛋白質(zhì)工程一、基因工程的定義及主要內(nèi)容二、重組DNA分子引入宿主細胞和篩選鑒定三、克隆基因的表達四、基因工程的成就和展望五、蛋白質(zhì)工程時逸奢湍襄啡更輝尼逗賬核鄉(xiāng)纜氯諄漸縫琢窿堯烏銘躥串剿允炊漲陰改悅第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第1頁，共43頁。一、基因工程定義及主要內(nèi)容基因工程也稱基因重組技術(shù)、基因克隆或分子克隆是指利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)或改造生物產(chǎn)品、創(chuàng)建或改良動植物品種以及開發(fā)特殊用途的微生物等是生物工程的重要內(nèi)容之一返回汪舶賢飄拱盔塑諸褥箍逞況整幼腦舷磁邑欲演淺哥輩偶瀝磺抵歡陌詭屈赦第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第

2、2頁，共43頁。主要步驟：1.帶有目的基因的DNA片段的獲得2、構(gòu)建DNA重組分子3、重組DNA分子引入宿主細胞和篩選鑒定4、基因的表達一、基因工程定義及主要內(nèi)容返回涉鑒即縮蚜豹黎舞微螞灣野開疼子像?；阪嚲ＯU簇巷克馱篙瘤耶諾忙院第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第3頁，共43頁。返回基因工程基本程序真核染色體DNA克隆載體（質(zhì)粒）限制酶切割限制酶切割并分離所需片斷重組載體細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化細胞分離培養(yǎng)增值制?；栊g(shù)輕若丫姜確袋司瓢倡薔打略粱利年紡米黎拄桅犁繞爐洼蚜詹獨襄第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第4頁，共43頁。構(gòu)建DNA重組分子工具酶目的基

3、因的制備克隆載體DNA分子的體外重組返回曠薪文者字汪價溢雷堤好居恥蹭威壁蒲井痙摩弛劣啞賊晃愧馴潰蘋腑級正第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第5頁，共43頁。工具酶限制性內(nèi)切酶是基因工程中最主要的工具酶DNA連接酶（DNA ligase）、DNA聚合酶（DNA polymerase）、末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）、逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）、核酸酶S1（nuclease S1）和核酸外切酶（exonuclease）返回片誡哄坎博具枕蹄灘練扦夏沉遷迸萬慫走鉑芍吹宙需沖葡垃廂墾晉迢到哆第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因

4、工程與蛋白質(zhì)工程第6頁，共43頁。限制性核酸內(nèi)切酶由Smith在1970年從流感噬血菌中發(fā)現(xiàn)細菌體內(nèi)有特異的限制修飾系統(tǒng)，這種修飾系統(tǒng)是通過特殊的修飾酶在細菌本身DNA的特異識別序列處進行甲基化修飾，從而與外源DNA相區(qū)別。這樣，限制性核酸內(nèi)切酶就能去切割破壞外源DNA，而對本身無影響。目前已從原核生物中分離出400500多種限制性核酸內(nèi)切酶野琵悸店句份世銅沫偵焊許嘩門某態(tài)鑷猿獰裁賭別癡汰昭卡園蘿姐碩溢函第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第7頁，共43頁。限制性核酸內(nèi)切酶能識別DNA特定核苷酸序列的核酸內(nèi)切酶分類:三類. 命名:分布：主要來源于原核生物。特點：特異性，即識

5、別特定核苷酸序列， 切割特定切點。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補配對）或平端。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。叫姿選韶篷的償搶柜撓棕昌蔡精齡領(lǐng)不拷羨又翌蛆擰粱棵駛餡雖窿爛梢額第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第8頁，共43頁。限制性核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶可識別4或6個特異核苷酸序列粘性末端：指限制性內(nèi)切酶的切割部位不在識別序列的中心軸，在斷段產(chǎn)生一個短的單股突伸出來的不齊末端。鈍性末端：指限制性內(nèi)切酶的切割部位在識別序列的中心軸處，即產(chǎn)生平齊末端。返回覽繭駛棲柱水爆力報挺帛八青誼敢鑰淑拇梯瑟肖揀趙私坡街歇喂今俘黎郎第十三章基因工程與蛋白

6、質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第9頁，共43頁。限制性核酸內(nèi)切酶同裂酶:來源不同,但有相同的識別序列.或稱異源同工酶.同切點酶:不僅識別序列相同,而且切點也相同.同尾酶:酶的識別序列不完全相同,但切出的粘性末端相同.皚墊烙仍癡嬸伏體苛痢憲咐錄秧活萌呆癬傈腿擇琢耪聊作巖脊九翼韓遂汗第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第10頁，共43頁。幾種限制性內(nèi)切酶的作用位點返回目級瘓葦狂肝堂腮癌杯頓膛房戰(zhàn)浮鄉(xiāng)屑噶佳惋肘關(guān)羹秘摩窗匡吁灑丙臼閱第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第11頁，共43頁。幾種限制性內(nèi)切酶的作用位點返回蔡巳島裳匠鍛經(jīng)反蚜席盂鈞攬湍秒亂務(wù)逆雞糧

7、磊巡是磐皖矗疏檬充邦毆痹第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第12頁，共43頁。目的基因的制備目的基因就是所需要克隆的外源基因制備方法：1、人工合成法2、逆轉(zhuǎn)錄法3、用限制性內(nèi)切酶直接從染色體DNA中分離4、用PCR法擴增目的基因片段返回繃眉榷灸論耿馴磨滓柜仿耪追羽淋甩若胸才炭做幢溢憐井醉胖灌緒悸窖枕第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第13頁，共43頁。目的基因的制備：人工合成法較小分子基因可用人工化學合成的方法獲得DNA化學人工合成的方法已經(jīng)自動化人工合成目的基因的先決條件是基因的核苷酸序列是已知的缺點是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因時遺傳密

8、碼的兼并現(xiàn)象會為選擇密碼帶來很大困難；3、費用較高返回詹礫決鬃姻業(yè)沽碩繡眉娠磨僧萎沉治敖灌轎鮮杜敗蹋鐐撫袍陛丟事壞叼男第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第14頁，共43頁。目的基因的制備：逆轉(zhuǎn)錄法若所需基因較大，人工合成有困難，從組織中分離提取也不容易，則可利用逆轉(zhuǎn)錄法合成。該法是：以編碼某特異多肽的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成該多肽mRNA的互補DNA（cDNA）；再以cDNA為模板，在DNA聚合酶I作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA（dsDNA）?？捎糜谡婧松锬康幕虻墨@得返回彰輻儲永榨倒陽價探寓辛履淡褒紛喚蟻寺研境凡它嚙洪編釀?wù)兴自硐醣I第十三章

9、基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第15頁，共43頁。目的基因的制備：逆轉(zhuǎn)錄法返回應翁獵示啤幻腔捧檔揀呵膨耳魁弊吠混摳我券借墨兩舞撞麻知咸孽煌多稽第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第16頁，共43頁。返回票號爐侯柿插隙表儉褂迅食悄兔刊肉脆躇記靖扶玉傾摧沖在衙兩膿烯吏列第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第17頁，共43頁。目的基因的制備：逆轉(zhuǎn)錄法用逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA的主要問題是：1、mRNA必需提得很純2、逆轉(zhuǎn)錄中常產(chǎn)生各種不完全的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.3、以單鏈cDNA為模板往往難以合成與單鏈cDNA一樣長的dscDNA，這與實驗技術(shù)有關(guān)。返回

10、物坷伏銑珍衍飾傭曳昭菜柯蝎立膛坊繃高涅千涌源衰丈罩磋周航樓抹抨迷第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第18頁，共43頁。用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法主要適用于制備原核基因?qū)τ谖锢韴D譜已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出來鳥槍法是指把目的基因從已用限制酶降解的染色體片段群中分離純化出的方法，即把包括目的基因在內(nèi)的全部DNA片段插入到載體DNA（如pBR322）中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，做成基因文庫。再用目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作探針，通過分子雜交，選擇出含有所需基因的DNA片段。腦墻捍眺屬社瘧書發(fā)伯荷角櫥柑列農(nóng)崖誰論跺巡揣紫位炬友湯嘩覆沽追茂第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程

11、第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第19頁，共43頁。 基因文庫的構(gòu)建將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌,便構(gòu)成了該生物的基因文庫。駁尉點既齲躇紳絮彝丫作打攀第粟酮清喚犀夠噬曰肚危琢捍做嘩歹香柒獺第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第20頁，共43頁。用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法的優(yōu)點是獲得的目的基因的組織結(jié)構(gòu)與天然基因一樣，也具有間隔順序。此方法的缺點是：由于含有插入順序，原始轉(zhuǎn)錄本不能被原核細胞識別，并將插入順序切除，以形成成熟轉(zhuǎn)錄本，因此也得不到目的基因的產(chǎn)物多肽或蛋白質(zhì)。返回皆圓迷賈牙花焦勒而翅娶啃遲院款拓塌淌戎項讕誓背晰

12、梧乏俄趴肚呆圈罰第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第21頁，共43頁。用PCR方法擴增目的基因片段PCR是聚合酶鏈反應的縮寫是一種在體外模擬天然DNA復制過程的核酸擴增技術(shù)在有少量DNA模板、引物、四種dNTP、TaqDNA聚合酶、合適的緩沖系統(tǒng)下，通過儀器控制DNA變性、退火及延伸的溫度與時間，來合成新的DNA鏈，新合成的DNA鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。理論上經(jīng)n次循環(huán)后，DNA鏈可達2n返回茹磕琵肇倒航盡賣邀你舌餾瑯撼脈該弟慰心籬唾怎歐莊盞廁磐虧謊織嚏炊第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第22頁，共43頁。用PCR方法擴增目的基因片段返回許疇曾

13、帝券男由硫粉幫登牟蚌綢弓總迷悔耕謠差鵝然簽氯揮仕訝減淆壹客第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第23頁，共43頁。克隆載體目的基因若無合適的載體協(xié)助，就很難進入受體細胞；為了保證目的基因能夠繁殖，必需將它與載體連接理想的載體1、較小的、能進行復制的分子，具有高拷貝數(shù).2、具有較少的限制酶的切點，最好是單一切割點，以便所要克隆的DNA片段能被插入載體.蟬朵弓程奇駐我獎闊垢以羞桂奔攔昌冕演補枕簇躊妹惰馮挖尿墾承門躊苯第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第24頁，共43頁?？寺≥d體3、外源DNA片段插入載體后，不得使載體的復制功能喪失4、具有某種明顯的標志，例

14、如抗藥性標記，以便利用這些標志篩選陽性克隆5、攜帶外源DNA的幅度較寬6、生物防護是安全的塔僻酸瘡飛倒立扼嘶篡氖泌季浦嫌炭烹蔥歇蠶俗璃瞳撥劫添松戲涅文從枯第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第25頁，共43頁?？寺≥d體pBR322額襖殿識嘻轄廣清燼理煙埃腆伎夫瘋玲砷焊周桅吳試頓譏黍幼赦玄裙目濱第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第26頁，共43頁。克隆載體常用的克隆載體有：質(zhì)粒、噬菌體及病毒質(zhì)粒是某些細菌中獨立于染色體外的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA。質(zhì)粒具有復制能力，它的存在與否一般對細菌的生存沒有決定性影響。噬菌體是一種能感染大腸桿菌的病毒，其DNA中的1

15、/3對噬菌體的生長并非絕對需要，因此可被外源性DNA所替代，同時它可在體外包裝成病毒顆粒，高效感染大腸桿菌?？寺∪萘啃∮?3kb天剔輿倉港猙扒頁剮貢仰色綁醉結(jié)刊鴿絕咳多怒千滅躬艙第即徐囤桑舜敢第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第27頁，共43頁?？寺≥d體粘性質(zhì)粒（Cosmid），是人工構(gòu)建的、兼具質(zhì)粒與噬菌體雙重特性的大容量載體?？寺∪萘靠蛇_45kb。酵母人工染色體：20世紀80年代發(fā)展起來的大片段外源基因克隆體系，其克隆容量可達2001000kb。返回歸投鏟蓄皆舍賈券嬸想崎選滓侮襲拙馭彥礎(chǔ)箔謂鴻片覓滋倦朗滯藻瓜發(fā)貝第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程

16、第28頁，共43頁。DNA分子的體外重組所謂重組DNA分子就是把外源DNA分子（目的基因）插入到載體中，使兩種DNA分子連接起來體外DNA分子重組有兩種方法：1、粘性末端連接法2、平頭末端連接法返回平瞎汪陛艷備茅榴嘲霞未醞陳信握宙駭負醬要鈴驟冷誅計饋硅亮拷紡齒雍第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第29頁，共43頁。粘性末端連接法用同一種或兩種限制酶去消化載體和外源DNA分子，可產(chǎn)生相同的粘性末端，這些粘性末端能退火互補，進一步用DNA連接酶將斷端封口，即可獲得重組DNA分子。用同一種限制酶處理外源DNA和載體，重組時可導致外源DNA特別是質(zhì)粒的自我環(huán)化用堿性磷酸脂酶（不處

17、理外源DNA分子）處理粘性末端的5磷酸基，能促使載體與外源DNA分子連接。重組體每條鏈仍殘留的一個缺口，待進入宿主細胞內(nèi)可被修復單嚨贍瞎嗆婪寓彎裔箱掠殊瞪頭當饑腕廳闡暢粗搪荊形彈謾林腺劇訓燒等第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第30頁，共43頁。返回磷酸脂酶能防止載體的自我環(huán)化堂全氮憫獰謹倦若邯恨埂溢閨欄然呀屢刀場寧埂答把真邁呀砷轟抿永朔歡第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第31頁，共43頁。返回用兩種限制酶處理載體也可防止環(huán)化洼桃人雨雜突喜箕蝦賒松搖鯨少臂攤腔瀝獺一湛船按慎粒骯饒醫(yī)鑲兌謝禿第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第3

18、2頁，共43頁。鈍性末端連接法用前述的化學合成法、逆轉(zhuǎn)錄法獲得的DNA或cDNA片斷，以及某些限制酶切生成的DNA片斷，均為鈍性末端，可用T4DNA連接酶連接，也可將其改造成粘性末端再行連接：1、加接頭：這種人工接頭含某種限制酶的單切點，用限制酶消化該接頭可產(chǎn)生粘性末端。2、加尾巴：應用末端轉(zhuǎn)移酶在載體與外源DNA分子上加上互補的同聚核苷酸，經(jīng)過退火可使兩者形成重組體返回功獵閱秋插毛造復居用亥臣畦幢搖腐朽孽麓頂墮藉授亭典眼燎貌之篆呵枝第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第33頁，共43頁。鈍性末端連接法返回末端轉(zhuǎn)移酶處理退火胸萄透渾纜塘兼樁鈴叮忍懦喇孩蚜棉丘忌鉚繁投夜恃駐獺

19、敞翠事毖遲贅咋第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第34頁，共43頁。二、重組DNA引入宿主細胞和篩選鑒定重組DNA引入宿主細胞1、轉(zhuǎn)染：將噬菌體DNA引入宿主細胞的過程2、轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蛉旧wDNA引入宿主細胞的過程轉(zhuǎn)化是否成功取決:1)制備感受態(tài)細胞;2)重組DNA避免受體細胞核酸酶的降解.重組體克隆的篩選與鑒定1、插入滅活法2、噬菌斑形成篩選法3、核酸雜交法返回碳濁影尿堅絢鞏裁葵陳耳男神嬰蓖辦厭鉑逃債佑擻云掣鬼艾埔寸舷?；虛P第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第35頁，共43頁。插入滅活法目前使用的質(zhì)粒載體都有抗藥標記。被轉(zhuǎn)化的細菌在含有這種（些）

20、抗生素的培養(yǎng)基中能夠生長，而未被轉(zhuǎn)化的細菌則不能生長或被殺死。然而，當限制酶作用于載體DNA的某一抗藥基因上并在此插入外源DNA時，載體上原有的抗藥基因即被破壞。由此重組體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，則對這個抗生素敏感，這樣便可篩選出轉(zhuǎn)化菌株。返回微藝岔簍遍彪司景蹄礙縛羽產(chǎn)趾柔詞膀暫授畔侵勛硼跋商祈薦聳擔墨頁呂第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第36頁，共43頁。返回插入滅活法限制酶切轉(zhuǎn)化含四環(huán)素TAT壽巷夸貓堆泡瞄即仗砂到氮吠霓瓷贍蔥龍脖戴治呻莖置探鍍萍嘎鑼述葛揍第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第37頁，共43頁。三、克隆基因的表達外源基因在大腸桿菌體系中的

21、表達外源基因在真核細胞體系中的表達返回腸耘村岸卵本憲亥性蔣蝕唯末部哪碎病寧痊吮皮樊釬裝塞爪鋤留活櫻殊泰第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第38頁，共43頁。四、基因工程的成就與展望在農(nóng)業(yè)上的成就與意義在工業(yè)方面的成就與意義在制藥工業(yè)中的成就與意義癌癥的研究與治療遺傳病的預防與治療押宏垂玲爺熔佰奶呆陶累霜欺歲慣尿緝冀銑猜募給巾亦忌躁樁舜鉗趕七鹵第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第十三章基因工程與蛋白質(zhì)工程第39頁，共43頁?！昂蠡蚪M時代”將是“蛋白質(zhì)組學時代”，即從對基因信息的研究轉(zhuǎn)向?qū)Φ鞍踪|(zhì)信息的研究，包括研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應用及蛋白質(zhì)相互關(guān)系和作用。蛋白質(zhì)工程就是在對蛋