膝關節(jié)骨關節(jié)炎研究進展

1、膝關節(jié)骨關節(jié)炎研究進展常見骨性關節(jié)炎表現(xiàn)骨性關節(jié)炎膝內(nèi)翻浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨性關節(jié)炎膝內(nèi)翻浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨關節(jié)炎膝外翻 膝關節(jié)骨性關節(jié)炎（OA)是一種以關節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關節(jié)病。又稱增生性膝關節(jié)炎、老年性膝關節(jié)炎。 臨床上以中老年發(fā)病最常見，女性多于男性。有研究表明，50歲以上約80%，60歲以上約90%，70歲以上幾乎100%罹患該病，特別是近年來隨著生活節(jié)奏的加快，該病的發(fā)生呈日益年輕化的趨勢。臨床對骨關節(jié)炎的認識浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科以往人們稱退行性骨關節(jié)病為骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis OA) ，退行性關節(jié)炎，骨關節(jié)病或增生性關節(jié)炎

2、。 實際上它指的是進行性的關節(jié)軟骨缺失伴隨著關節(jié)軟骨的異常修復和軟骨下骨的重建，許多病例表現(xiàn)為骨贅形成。 臨床對骨關節(jié)炎的認識浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨關節(jié)炎的危險因素 退行性骨關節(jié)病的發(fā)展與年齡因素呈明顯正相關。 1.長期的靜力負重或不負重及不活動(如長期關節(jié)制動)可導致關節(jié)軟骨基質(zhì)降解，最終導致關節(jié)降解。2.有些反復性的活動，如反復的登高、搬運重物、不良的工作姿勢等持續(xù)重復性的運動，顯然可加速骨性關節(jié)炎的進展。 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科3.體育運動可使關節(jié)處于高壓力和扭轉(zhuǎn)負荷下(如美式橄欖球)，可增加關節(jié)退變的危險。4.在具有解剖異常及功能異常的人，退行性骨關節(jié)病

3、的易患性高，疾病發(fā)展快，包括關節(jié)面的斷裂及不平整、關節(jié)發(fā)育不良、對線不良、關節(jié)不穩(wěn)、關節(jié)或肌肉的神經(jīng)支配障礙、肌力或耐力不足骨關節(jié)炎的危險因素骨關節(jié)炎的病理改變 骨性關節(jié)炎最早可見的特征是大部分關節(jié)軟骨淺層的纖維變或撕裂。隨著疾病的進展，越來越多的關節(jié)面變得粗糙不平，纖維化向深層發(fā)展直達軟骨下骨。隨著軟骨裂隙的加深，表層纖維化的軟骨剝脫形成游離體，軟骨變薄，同時基質(zhì)發(fā)生酶解，使軟骨體積減少。最后，軟骨的進行性喪失使軟骨下骨全部暴露。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨節(jié)軟骨 關節(jié)軟骨由細胞外基質(zhì)和高度有序性的橢圓或圓形軟骨細胞組成，厚度約幾個毫米。這些薄層軟骨具有非常好的低摩擦

4、滑動特性，并可緩沖滑膜關節(jié)的負荷，減少了軟骨下骨的應力。關節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科膠原網(wǎng)限制基質(zhì)體積的擴張壓力下糖胺多糖側(cè)鏈距離減小，釋出水分，體積減小；壓力解除后，恢復正常形態(tài)正常關節(jié)及關節(jié)面早期退行性變進展期退行性變終末期退行性變 骨贅可能是軟骨退變和軟骨下骨重塑的表現(xiàn)，但骨贅形成的機制尚不清楚。它們可使關節(jié)活動受限并在關節(jié)活動時引起疼痛。骨贅可在關節(jié)四周發(fā)生。骨贅的形成浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科膝骨性關節(jié)炎的診斷基于病史和體格檢查，x光片上的特征性改變可以確立診斷，但臨床癥狀并不總是與x光片所見相吻合。骨掃描、CT和MRI都有助于早期骨性關節(jié)炎的發(fā)現(xiàn)和察

5、覺關節(jié)的微小改變。骨性關節(jié)炎的診斷基于病史和體格檢查，x光片上的特征性改變可以確立診斷，但臨床癥狀并不總是與x光片所見相吻合。骨掃描、CT和MRI都有助于早期骨性關節(jié)炎的發(fā)現(xiàn)和察覺關節(jié)的微小改變。骨關節(jié)炎診斷能早期發(fā)現(xiàn)軟骨退變的方法有：測定軟骨蛋白聚糖和存在于關節(jié)液、血清和尿液中的膠原碎片的水平以及先進的軟骨影像學方法，包括MRI。骨關節(jié)炎診斷浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科臨床表現(xiàn)疼痛：定位不準確、進行性加重、與活動有關。關節(jié)僵硬：早晨或長時間不活動后，通常不超過30分鐘。關節(jié)畸形關節(jié)攣縮肌肉萎縮體格檢查關節(jié)活動時可觸及骨贅和研磨感浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的病

6、因研究 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科幾十年來， 醫(yī)療界對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎研究雖已取得了很大進步，但對其確切病因仍未明了。按照美國風濕病協(xié)會的分類，骨性關節(jié)炎可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。前者確切原因不清，可能包括年齡、性別、職業(yè)、種族等因素。各種機械性刺激是軟骨細胞功能的重要調(diào)節(jié)因素，它不僅能誘導包括白細胞介素1-、一氧化氮和金屬蛋白酶等炎癥因子的產(chǎn)生，而且能導致蛋白聚糖從軟骨組織塊中釋放。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科 后者可繼發(fā)于各種關節(jié)損傷或疾病，如：半月板損傷、關節(jié)內(nèi)或關節(jié)周圍骨折、關節(jié)韌帶損傷、先天畸形或脫位等。各種機械性刺激是軟骨細胞功能的重要調(diào)節(jié)因素，它不僅能誘導包括白細胞介素1-、一氧化氮和金屬

7、蛋白酶等炎癥因子的產(chǎn)生，而且能導致蛋白聚糖從軟骨組織塊中釋放。膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的病因研究 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的病因研究 RePo等在體外試驗研究中觀察到，人膝關節(jié)軟骨細胞在應力超過4MPa時，便會導致軟骨細胞急性死亡。當承載壓力為循環(huán)壓力時誘導軟骨細胞死亡的壓力閾值明顯下調(diào)，大和6MPa的循環(huán)承載壓力可分別造成人髕骨軟骨組織塊和牛軟骨組織塊中的細胞明顯死亡。Jefrey等觀察到，軟骨被一次自由落體沖擊致傷后，其細胞功能減退，蛋白多糖及膠原合成減少，可出現(xiàn)軟骨細胞的急性死亡軟骨細胞受損的程度與沖擊創(chuàng)傷的能量大小成正比。ThomPson等在兔實驗中也觀察到，關節(jié)軟骨遭受可致骨

8、折的沖擊后，軟骨損傷難以修復，軟骨退變, 半年左右即發(fā)生病理改變。因軟骨無吞噬細胞軟骨細胞凋亡后產(chǎn)生的凋亡小體及囊泡將得不到及時清除。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科目前，膝關節(jié)骨性關節(jié)炎已公認為基因相關性疾病，確定與之相關的易感基因非常重要：通過基因研究深入了解膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的分子生物學發(fā)病機制，進而發(fā)明新的治療方法，如目前的熱點基因治療；通過在人群中對易感基因進行篩選，找出高危人群并提供遺傳學證據(jù)，進而及早干預和進行有效的防治。 膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的病因研究 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的病因研究 Koshizuka等進行鼠膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型的基因多態(tài)性研究，結(jié)果表明鼠胱氨酸蛋白酶抑

9、制劑(CST)10的表達基因與膝關節(jié)骨性關節(jié)炎相關，CSTl0鼠膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型可觀察到軟骨細胞鈣化受抑制。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的病因研究 膝關節(jié)骨性關節(jié)炎是遺傳和環(huán)境等因素共同作用的多因子疾病，因此研究過程中必須考慮到不同個體所處的不同環(huán)境因素對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的影響，最好能開展一些前瞻性的病例對照研究。 不同人群發(fā)病的不確定性也是研究的難點之一。 膝關節(jié)骨性關節(jié)炎易感基因的研究已取得不小的進展，但僅僅確定易感基因并無臨床意義，應明確不同基因的功能和作用機制，進而找到膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的有效干預手段及治療方法。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨關節(jié)炎的病機研究 正常情況

10、下，關節(jié)軟骨基質(zhì)的分解代謝與合成維持著動態(tài)平衡。這一過程受體內(nèi)多種生物活性分子的調(diào)控，其中氧自由基等活性分子在關節(jié)軟骨破壞中起重要作用。在正常生理情況下，由于機體具有強大的自由基防御系統(tǒng)，可將機體代謝所產(chǎn)生的自由基及時清除。但在病理情況下，自由基的生成增加，清除率下降而導致自由基堆積，繼而自由基作用于多不飽和脂肪酸(PU-FA)而誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，脂質(zhì)過氧化物增加，通過多種途徑對局部組織產(chǎn)生破壞。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨關節(jié)炎的病機研究研究證實，自由基可在損傷軟骨細胞、降解細胞外基質(zhì)的同時形成自身抗原，破壞機體的耐受性，導致淋巴系統(tǒng)機能異常及自身免疫發(fā)生。自由基對軟骨細胞的影響可能為抑制核

11、糖核普酸還原酶，導致軟骨細胞DNA合成減少，并使核酸亞硝酞化，DNA堿基C脫氨為U，發(fā)生堿基錯配，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)與遺傳信息改變導致細胞死亡。自由基干擾軟骨細胞能量代謝，攻擊線粒體膜，并與含亞鐵原葉琳的鐵離子結(jié)合，形成亞硝酞絡合物，損傷線粒體，自由基使蛋白質(zhì)多膚鏈交聯(lián)形成橋鍵，結(jié)構(gòu)改變后酶活性改變。 研究證實，自由基可在損傷軟骨細胞、降解細胞外基質(zhì)的同時形成自身抗原，破壞機體的耐受性，導致淋巴系統(tǒng)機能異常及自身免疫發(fā)生。 自由基對軟骨細胞的影響可能為抑制核糖核普酸還原酶，導致軟骨細胞DNA合成減少，并使核酸亞硝酞化，DNA堿基C脫氨為U，發(fā)生堿基錯配，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)與遺傳信息改變導致細胞死亡

12、。 自由基干擾軟骨細胞能量代謝，攻擊線粒體膜，并與含亞鐵原葉琳的鐵離子結(jié)合，形成亞硝酞絡合物，損傷線粒體，自由基使蛋白質(zhì)多膚鏈交聯(lián)形成橋鍵，結(jié)構(gòu)改變后酶活性改變。軟骨細胞是成熟軟骨組織內(nèi)唯一的細胞類型，它在軟骨損傷以及重塑過程中起到維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。既往對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的研究大多數(shù)著重于細胞外基質(zhì)的變化，近年的研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞的異常凋亡也起著重要的作用.細胞凋亡是一個正常的生理過程，是一種由基因控制的、主動地去除非需要或損傷細胞的程序性死亡過程。 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨關節(jié)炎的病機研究浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨關節(jié)炎的病機研究 關節(jié)軟骨細胞凋亡作為膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制的研究為防

13、治膝關節(jié)骨性關節(jié)炎提供了一個新的途徑，抑制關節(jié)軟骨細胞過度凋亡，意味著部分軟骨細胞得以保存，延緩或減輕對關節(jié)軟骨破壞，促進損傷的軟骨修復，從而緩解關節(jié)癥狀，改善和恢復關節(jié)功能，達到治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的目的。中醫(yī)對骨關節(jié)炎的認識浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨關節(jié)炎屬于祖國醫(yī)學的腰背痛，痹癥的范疇，也稱為“鶴膝風”、“歷節(jié)病”、“骨痹”、“著痹”、“痛痹”、“淤血痹”。中醫(yī)認為，膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的發(fā)病與肝腎虧虛、氣滯血瘀、風寒濕阻等有關。張氏醫(yī)通云:“膝為筋之府，膝痛無有不因肝腎虛者，虛則風寒濕氣襲之?！北静崬楸咎摌藢嵵C，其本是肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)所致。肝腎虧虛是病變的根本，風寒濕痰瘀痹阻經(jīng)絡為標

14、。肝藏血，主筋；腎藏精，主骨；老年肝腎不足或勞損、外傷損傷氣血，復受風寒濕(熱)邪，邪滯膝部，氣滯血瘀，經(jīng)絡閉阻，筋骨失榮為本病的基本病機。故治當以補益肝腎、強筋壯骨為主，活血祛瘀，祛風通絡為輔。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨性關節(jié)炎中醫(yī)病因病機中醫(yī)將膝關節(jié)骨性關節(jié)炎納入“骨痹”范疇，素問痹論謂“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”，“所謂痹者，各以其時重感于風寒濕之氣也”，認為年老體虛、跌仆損傷、飲食、藥物失當及風寒濕熱之邪是導致膝關節(jié)骨性關節(jié)炎發(fā)病的內(nèi)外因素。中藏經(jīng)五痹謂“骨痹者，乃嗜欲不節(jié)，傷于腎也則邪氣妄人”，指出邪氣閉阻經(jīng)絡，氣血不通，脈絡絀急是本病的病機所在，日久也可由經(jīng)絡累及臟腑。病理性質(zhì)屬

15、虛實相兼。 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨性關節(jié)炎中醫(yī)病因病機中醫(yī)對本病多從肝腎虧虛、風寒濕邪外侵、氣滯血癖等辨證論治，在實驗研究方面取得了很大進步。黃楓等觀察了補腎方含藥血清對白細胞介數(shù)1(IL-1)抑制軟骨細胞增殖及誘導軟骨細胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)作用的影響; 郭建剛等運用壯筋活血湯(熟地黃、山藥、牛膝、山茱英、土鱉蟲、紅花等)對實驗性家兔的膝骨性關節(jié)炎模型進行防治; 汪青春等制造小鼠膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型，觀察中藥對關節(jié)軟骨的影響; 潘浩等采用補腎壯筋湯治療早期膝關節(jié)骨性關節(jié)炎，通過觀察其對軟骨細胞凋亡及增殖細胞核抗原表達的影響。 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科骨性關節(jié)炎的主要治療手段1、非藥物治療

16、：包括患者的健康教育、自我訓練、減肥、有氧操、關節(jié)活動度訓練、肌力訓練等2、藥物治療：包括各種非甾體類抗炎藥(NSAID）、氨基葡萄糖和硫酸軟骨素 以及中醫(yī)中藥治療3、關節(jié)內(nèi)注射治療：包括糖皮質(zhì)激素、透明質(zhì)酸鈉等 4、手術治療：傳統(tǒng)手術、關節(jié)鏡手術5、中醫(yī)治療：貫穿于整個疾病治療過程的始終結(jié)合中醫(yī)的整體觀念，辨證論治，綜合運用中藥、針灸、推拿等多種手段從膝關節(jié)局部用藥和全身整體出發(fā)，內(nèi)外兼治，動靜結(jié)合，充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢綜合治療，結(jié)合西醫(yī)各種治療手段為治療該病行之有效的方法。中藥湯劑內(nèi)服辯證倫治1中藥洗劑、熏蒸治療 2練功、推拿療法3針灸、針刀療法4中醫(yī)治療骨關節(jié)炎主要手段浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)

17、院骨科42浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科中醫(yī)治療手段中醫(yī)外治法在防治膝關節(jié)骨性關節(jié)炎方面療效顯著，方法較多，目前仍是治療本病的重要手段。通過對關節(jié)周圍經(jīng)絡循行部位上筋結(jié)的治療，逐步恢復關節(jié)動力學的動態(tài)平衡，從而抑制關節(jié)液中IL-lB、IL-6和TNF-水平的異常升高，達到治療膝骨關節(jié)炎的作用。 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科中醫(yī)治療手段熏洗熱熨法是利用藥物加熱后的熱能及藥物本身的作用，因此具有雙重功效?？杉铀倬植垦汉土馨鸵旱难h(huán)，促進關節(jié)積液吸收，緩解疼痛和腫脹，能明顯抑制膝關節(jié)滑膜炎癥，減輕膝骨關節(jié)炎軟骨退變。中藥熏洗具溫通功效，能有效地改善局部血液循環(huán)，增加皿流量，促進新陳代謝，促進靜脈回流，加快炎

18、性物質(zhì)吸收，起到祛散風寒、除濕消腫的作用。 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科中醫(yī)治療手段 推拿治療有其獨特的優(yōu)勢和良好的效果，能通過疏通病變膝部經(jīng)絡氣血而改善病變膝部關節(jié)液、血液及淋巴循環(huán)，促進關節(jié)炎癥滲出的吸收，有效地增強病變膝關節(jié)軟骨細胞的營養(yǎng)。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科中西醫(yī)結(jié)合治療骨性關節(jié)炎的治療優(yōu)勢一、中西藥結(jié)合的優(yōu)勢1.克服了單純西藥治療副作用大的弊端2.拓寬了治療途徑3.中藥治療以中醫(yī)整體觀念為指導，治療針對關節(jié)局部用藥的同時兼顧肝、腎、脾等臟器，通過藥物提高了相關臟器機能，做到了標本兼治。浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科二、中西醫(yī)結(jié)合非藥物治療骨性關節(jié)的優(yōu)勢1.目前治療包括超短波治療、干擾電、蠟

19、療、冰敷、中醫(yī)手法治療、及康復治療、康復體操等。2.中醫(yī)手法以中醫(yī)臟腑經(jīng)綸理論為指導，采取相應的經(jīng)絡腧穴通過點穴舒筋，可以恢復肌力，以改善關節(jié)的穩(wěn)定性和功能狀態(tài)；通利關節(jié)3.促進局部血液循環(huán)，加快局部代謝，促進膝關節(jié)無菌性炎癥的吸收和致痛物質(zhì)的代謝又能夠調(diào)理相關臟腑達到通利血脈、壯骨強筋。4.中醫(yī)針法、灸法等治療同樣以中醫(yī)臟腑經(jīng)絡理論為指導采用特定腧穴達到蠲痹止痛目的。中西醫(yī)結(jié)合治療骨性關節(jié)炎的治療優(yōu)勢浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科膝關節(jié)康復練習常規(guī)浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科膝關節(jié)康復練習常規(guī) 海桐皮湯熏蒸對兔實驗性膝骨關節(jié)氧自由基代謝和軟骨細胞凋亡的影響賴 震 石仕元 費 俊 等杭州市紅十字會醫(yī)院

20、實驗內(nèi)容一 海桐皮湯熏蒸對兔實驗性膝骨關節(jié)炎軟骨顯微結(jié)構(gòu)的影響材料與方法 1. 藥物 海桐皮湯: 海桐皮，透骨草，乳香，沒藥，當歸，防風，紅花，川芎，威靈仙，川椒，白芷，桂枝組成。 2.主要儀器設備 RTZ-l0A型臺秤、 66805電針治療儀、 低溫冰箱(BS-812)、 電子天平(AX-6901)、LKB800超薄切片機(德國)、 JSM-840 、OlymPus光學顯微鏡(日本) 3.實驗動物 45只新西蘭大白兔，雌雄不限，體重為（體重）由浙江中醫(yī)藥大學實驗中心提供，批號:SYXK(浙)2008-0116，普通級。 熏蒸時將實驗兔置于熏蒸臺，臺下放電飯煲以熏蒸之用。 材料與方法 圖1 實

21、驗動物稱重圖 2 熏蒸架 圖3對實驗兔進行熏蒸 造模方法每只動物隨機選取右側(cè)膝關節(jié)，參考 Hulth 造模方法，取膝關節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約 4cm，探查關節(jié)腔無原發(fā)病變后仔細切斷前交叉韌帶和后交叉韌帶，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板(勿損傷關節(jié)軟骨面)，逐層縫合傷口，無菌敷料包扎固定。HuIth A Lindberg L ,Telhag H. ExPermental osteoarthritis in rabbits Preliminary rePort. Acta OrthoP Scand, 1970, 4l(5)：522530 圖4 實驗動物 圖5 對實驗兔進行造模 圖6 手術造模時切除交

22、叉韌帶 圖7手術造模時切除側(cè)半月板分組與治療 隨機取10只實驗兔作為正常對照組(A 組)，其余35只采用 Hulth 方法造模，取30只造模后無明顯不良反應的實驗兔并隨機分為 模型組(B 組)、水蒸氣熏蒸組(C組)和海桐皮湯熏蒸組（D組）。模型組：造模后正常飼養(yǎng)。水蒸氣熏蒸組：用自來水熏蒸，將實驗兔固定在熏蒸臺上(距離熏蒸鍋30cm)熏蒸30分鐘，每日一次，共4周。海桐皮湯熏蒸組：取海桐皮湯熏蒸，將每副中藥在治療前浸泡半小時后，放入電飯鍋通電加熱至煮沸冒蒸汽為止。同時熏蒸30分鐘，每日一次，共4周。 切片的制備及觀察 關節(jié)蠟塊，常規(guī)制片，HE染色，由病理專業(yè)人員閱片，關節(jié)軟骨有無破壞或纖維化。

23、根據(jù)病變由輕到重的程度，依次半定量為輕微()，輕度()，中度()，重度()，無病變組織為陰性（）。 統(tǒng)計學分析 應用軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差（ S）表示。組間比較時，方差齊性者，采用單因素方差分析，方差不齊者，比較采用非參數(shù)檢驗和Dunnett-t檢驗；組內(nèi)前后比較時，采用單樣本t檢驗，均以作為顯著性差異的標準。結(jié) 果 造模情況 在造模過程中出現(xiàn)2只實驗兔手術后死亡，手術1周后出現(xiàn)2只實驗兔膝關節(jié)感染，處死后，解剖右膝關節(jié)發(fā)現(xiàn)膝關節(jié)內(nèi)有大量膿液及壞死組織。其余實驗兔膝關節(jié)無明顯異常。 圖8 感染實驗兔膝關節(jié)紅腫 圖9 切開感染實驗兔膝關節(jié)可見大量膿液大體觀察各組按相應方法處理4周后

24、，膝關節(jié)無明顯紅腫，各組體重無顯著差異（見表1），解剖右膝關節(jié)后，正常組和海桐皮湯熏蒸組關節(jié)軟骨無明顯區(qū)別，色澤正常，均無肉眼可見關節(jié)軟骨裂隙，軟骨下骨裸露和關節(jié)周緣骨贅形成。模型組和水蒸氣熏蒸組肉眼可見部分關節(jié)軟骨裂隙，軟骨下骨裸露。 表1 各組治療前后體重的比較（kg， s）組別實驗前體重實驗后體重正常對照組2.90.363.20.74模型對照組2.90.523.00.61水蒸氣熏蒸組2.90.933.10.92海桐皮湯熏蒸組3.00.243.20.45注：實驗前各組體重均無顯著差異P；實驗后各組均無顯著差異P 圖10 正常組 圖11模型組光鏡觀察1）正常組：關節(jié)面光滑，表面被覆薄層透明軟

25、骨，細胞排列整齊，關節(jié)骨組織結(jié)構(gòu)清晰，無骨折、壞死。2）模型組：10只中8只有炎癥性病變和軟骨破壞，滑膜增厚，軟骨表面糜爛，細胞成簇排列，其余2只軟骨有不同程度的破壞，并且有炎細胞浸潤，局部纖維組織增生，骨組織基本正常。 3）水蒸氣熏蒸組：關節(jié)軟骨炎性病變較模型組減輕，輕微炎細胞浸潤，膝關節(jié)軟骨細胞數(shù)增多，軟骨細胞排列較整齊，基質(zhì)囊變好轉(zhuǎn)，基質(zhì)纖維變性減輕。4）海桐皮湯熏蒸組：關節(jié)軟骨炎性病變較模型組減輕，膝關節(jié)軟骨細胞數(shù)增多，軟骨細胞排列較整齊，基質(zhì)囊變好轉(zhuǎn)，基質(zhì)纖維變性減輕。另1只滑膜組織及關節(jié)軟骨、骨組織基本正常。見表 2，圖12-15。 圖12正常組細胞排列整齊，關節(jié)骨組織結(jié)構(gòu)清晰 圖

26、13模型組軟骨有不同程度的破壞，并且有炎細胞浸潤 圖14水蒸氣熏蒸組關節(jié)軟骨炎性病變較模型組減輕 圖15 海桐皮湯熏蒸關節(jié)軟骨炎性病變較模型組減輕各組關節(jié)軟骨觀察情況組別序號組織增生細胞變性炎性水腫炎細胞浸潤組織破壞12341+正常組567891+10 組別序號組織增生細胞變性炎性水腫炎細胞浸潤組織破壞12212111324215122模型組62172281191210212 組別序號組織增生細胞變性炎性水腫炎細胞浸潤組織破壞112231411水蒸氣熏蒸組516271811911011 組別序號組織增生細胞變性炎性水腫炎細胞浸潤組織破壞112231411海桐皮湯熏蒸組5617181911110

27、11 實驗內(nèi)容二 海桐皮湯熏蒸對兔實驗性膝骨關節(jié)炎氧自由基代謝的影響 材料與方法1 .主要試劑 乳酸林格氏液、0. 9%生理鹽水、0. 3%肝素溶液、無菌蒸餾水、冰醋酸、3%戊巴比妥鈉、丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物岐化酶（SOD）測試盒 2.主要儀器設備 家兔手術臺、動脈插管、三用恒溫水浴箱 、LXT- II型離心機、計算機及PcLab生物信號處理系統(tǒng)、550nm分光光度計、可調(diào)式移液器及槍頭、L0ml刻度離心管、比色管 3.實驗動物與造模方法 同實驗一 4.分組與治療 同實驗一檢測方法血清超氧化物歧化酶(SOD)的測定測定原理:通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化輕

28、胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度計測其吸光度，當被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力，并定義每ml反應液中SOD抑制率達50%時SOD量為一個活力單位(U)。 表1 血清SOD含量測定操作表試劑測定管對照管試劑一(ml)1. 01. 0樣品(ml)1. 0蒸餾水(ml)1. 0試劑二(ml)0. 10. 1試劑三(ml)0. 10. 1試劑四(ml)0. 10. 1用旋渦混勻器充分混勻，置37恒溫水浴40分鐘顯色劑(ml)2.02.0

29、混勻，室溫放置10分鐘，于波長550nm處，lcm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色測各管吸光度值。血清中SOD含量計算公式:SOD活力=(對照管吸光度一測定管吸光度)/對照管吸光度+50% 反應體系 稀釋倍速樣本測試前的稀釋倍速。 血清丙二醛(MDA)含量的測定 MDA測試原理:過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物(LPO)中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合(因底物為TBA所以此法稱TBA法)，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰，用可見光分光光度計測其吸光度，通過公式計算血清中MDA含量。操作方法：取培養(yǎng)上清液，參考八木國夫所描述的脂質(zhì)過氧化物(LPO)測定的TBA法，以的1133-四甲氧基丙

30、烷為標準品，日立F3000熒光分光光度計測定LPO代謝終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量，結(jié)果以均值標準差（ s）表示。 表2 血清MDA含量測定操作表標準管標準空白管測定管測定空白管*l0nmol/ml標準品(ml)0. 1無水乙醇(ml)0. 1測試樣品(ml)0. 10. 1試劑一(ml) 0. 10. 10. 10. 1混勻(搖動幾下試管架)試劑二(ml)3. 03. 03. 03. 0試劑三(ml)1.01.01.050%冰醋酸(ml)1.0 旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95水浴40分鐘，取出后流水冷卻，然后35004000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清3m1倒入l

31、cm比色杯中，532nm處，lcm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。血清中MDA含量計算公式:血清MDA含量=(測定管吸光度一測定空白管吸光度)/(標準管吸光度一標 準空白管吸光度)標準品濃度樣本測試前稀釋倍速 統(tǒng)計學處理方法應用軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差（ S）表示。組間比較時，方差齊性者，采用單因素方差分析，方差不齊者，比較采用非參數(shù)檢驗和Dunnett-t檢驗；組內(nèi)前后比較時，采用單樣本t檢驗，均以，P 0. 01作為顯著性差異的標準。實驗結(jié)果 海桐皮湯熏蒸對兔實驗性膝骨關節(jié)炎SOD活性的影響治療前各組的SOD值無顯著差異（P）；治療后正常組與治療前無顯著差異（P）；治療后模型

32、組SOD值降低，與本組治療前有顯著差異（P）；水蒸氣熏蒸組、海桐皮湯熏蒸組SOD值均升高，與治療前均有顯著差異（P），海桐皮湯熏蒸組SOD值升高明顯，與水蒸氣熏蒸組相比有顯著差異（P）。 表3 各組兔治療前后血清SOD含量的比較（ s）組別例數(shù)（只）治療前（/ml）治療后（/ml）正常組10125.004.42122.909.06模型組10122.3010.85114.509.12水蒸氣熏蒸組10121.209.36129.707.43海桐皮湯熏蒸組10120.1012.99136.807.03注：與正常組治療前比較P；與本組治療前比較P；與正常組治療后比較P；與水蒸氣熏蒸組治療后比較P 海桐

33、皮湯熏蒸對兔實驗性膝骨關節(jié)炎MDA含量的影響治療前各組的MDA值無顯著差異（P）；治療后正常組與治療前無顯著差異（P）；治療后模型組MDA值升高，與本組治療前有顯著差異（P）；水蒸氣熏蒸組、海桐皮湯熏蒸組MDA值均降低，與治療前均有顯著差異（P），海桐皮湯熏蒸組MDA值降低明顯，與水蒸氣熏蒸組相比有顯著差異（P）。 表4血清MDA含量的變化（ s ，nmol/L）組別數(shù)量治療前治療后正常組105.170.365.180.27模型組105.180.776.070.44水蒸氣熏蒸組105.090.314.420.42海桐皮湯熏蒸組105.010.353.820.43注：與正常組治療前比較P；與本組

34、治療前比較P；與正常組治療后比較P；與水蒸氣熏蒸組治療后比較P 實驗內(nèi)容三 海桐皮湯熏蒸對兔實驗性膝骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響 材料與方法1.主要儀器與試劑 流式細胞儀(FACSCalibur，美國)、低溫冰箱(BS-812 )、顯微鏡 型號：OlymPus IX51、全溫振蕩培養(yǎng)箱 型號：江蘇培英 HZQ-F160、電子天平(AX-6901) 、LKB800切片機(德國)、移液槍 型號：EPPendorf染色缸 、濕盒低溫高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)DL-2 OG- II、高速冷凍離心機HHS11-4、電熱恒溫水浴箱 (1)取材:空氣栓塞法處死動物后，立即解剖右膝關節(jié)，打開膝關節(jié)腔，從股骨

35、遠端及脛骨近端連同軟骨下骨一并切取。(2)切片:縱向切取外側(cè)脛骨平臺2-3mm厚的薄片，置于4%多聚甲醛PBS緩沖液固定48小時，修整標本，然后置入10%乙烯二胺四乙酸鈉脫鈣液以低溫微波脫鈣法脫鈣，至脫鈣完全(用針刺入組織無阻力感即可)為止。經(jīng)流水沖洗2h，去除EDTA，按常規(guī)石蠟包埋，5m連續(xù)切片.(3)軟骨細胞分離:外科無菌手術條件下，用眼科刀削取剩余標本關節(jié)面的關節(jié)軟骨，切成1. 0-2. 0mm大小，移入小瓶用PBS液漂洗后，用眼科剪剪碎，越細越好。將剪細的軟骨碎片收集移入試管中，加0.25%胰蛋白酶Sml消化30min，然后吸凈消化液并用PBS液漂洗，以除凈胰蛋自酶及可能沾染的滑膜細

36、胞.再加入0. 2 0l0 II型膠原酶(用2 0 % DMEM配制)Sml， 37下消化4-6h成絮狀，然后將消化液用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，1000rPm離心lOmin棄上清，加PBS液搖勻后制備成軟骨細胞懸液2 3 4 檢測方法流式細胞儀檢測細胞凋亡方法1）、取兔關節(jié)軟骨組織，PBS清洗干凈，0.25%胰酶室溫消化十分鐘，1000rPm5min，去除上清液，PBS重懸細胞，重復離心兩次，徹底去除胰酶。2）、調(diào)整待檢測細胞濃度為105個/ml，取200ul，1000rPm5min。3)、預冷的PBS1ml 潤洗兩次2，1000rPm5min。4)、將細胞重懸于100ul binding buffer，加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml)，輕輕混勻，避光冰上放置15分鐘。5)、轉(zhuǎn)至流式檢測管，加入400ulPBS，每個樣品臨上機前加入1ulPI（50ug/ml），2分鐘后迅速檢測。6)、同時以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作為陰性對照。 7）結(jié)果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流