細胞與支架材料的相互作用

1、細胞與支架材料的相互作用相互作用：細胞在材料上的行為細胞與材料的黏附（Adhesion）；細胞在材料上擴展（Spreading）；細胞在材料上遷移（Migration）；細胞在材料上聚集（Aggregation）；細胞在材料上功能（Function）。細胞-材料黏附：細胞培養(yǎng)細胞在材料上的擴展在刺激因子的作用下，細胞骨架 微絲出現(xiàn)不對稱分布；在細胞周邊區(qū)域出現(xiàn)極化區(qū)；特異性的分子重排；導致細胞空間形態(tài)發(fā)生改變。細胞在材料上擴展的測量Cell morphology was visualized by differential interference contrast at the indica

2、ted times after cell attachment to substrate細胞在材料上的遷移組織工程中，細胞在材料表面或細胞間遷移，是 新組織形成或再生的必經(jīng)階段。細胞遷移過程是頭部伸出偽足，附著于材料上， 后部黏附解聚，膜收縮，進而發(fā)生的前移。在復雜環(huán)境中細胞遷移很難測量。常用方法包括 細胞運動的個體化觀測，或者大量細胞運動前沿 的測量。細胞的遷移過程在誘導因子作用下:前部伸出偽足;形成新的黏附位點;尾部與其它細胞斷開并與基質(zhì)脫附;細胞膜收縮;胞體向前移動。細胞遷移的測定細胞在材料上的聚集細胞聚集是研究組織發(fā)育的重要過程，與細胞 間的作用密切相關(guān)；組織工程中，細胞聚集為細胞-支

3、架復合物或重 構(gòu)組織移植物增強細胞功能；細胞聚集程度用測量聚集體大小來量度；細胞聚集動力學通過測量聚集體大小隨時間的 分布，用計算機圖形分析獲得。細胞聚集成團分散的紅細胞聚集的紅細胞細胞在材料上的功能在組織工程中，強調(diào)細胞的特定功能：肝細胞：分泌白蛋白和解毒功能；軟骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞：ECM、 防止反分化;成肌細胞：形成肌小管及收縮功能；干細胞：多向分化潛能、誘導分化。材料中細胞功能檢測紅色:孔隙黑色:支架材料 黃色:接種的細胞基質(zhì)分泌 與檢測主要內(nèi)容細胞與材料的黏附作用(Adhesion)細胞黏附的意義測定方法影響因素舉例:肌腱細胞與支架材料的黏附細胞與材料黏附的意義組織工程基本內(nèi)

4、涵的體現(xiàn)：從單純細胞、單純 材料二者結(jié)合；組織工程研究的主要內(nèi)容之一；黏附是細胞發(fā)生遷移、分化和增殖的基礎；植入材料與機體發(fā)生作用的基礎是細胞與材料 表面的黏附。細胞與材料表面的黏附至關(guān)重要細胞與細胞或基質(zhì)的黏附細胞黏附與組織修復在誘導因子作用下，功能細胞遷移 并黏附于損傷區(qū)，然后分泌基質(zhì)；血管內(nèi)皮細胞遷移并黏附到損傷區(qū);形成細胞外基質(zhì)和血管系統(tǒng)。細胞與材料黏附的測定方法計數(shù)測定方法力學測定方法計數(shù)測定方法沉淀法（相差顯微鏡）熒光標記法染色法形態(tài)分類法細胞內(nèi)酶(DNA)的含量計數(shù)法細胞懸液接種在材料表面，培養(yǎng)后 洗脫未黏附細胞，用顯微鏡計數(shù)，計算出 黏附細胞的百分比：rate N100%N 0

5、AdhesionN： 黏附的細胞數(shù)N0：接種細胞總數(shù)計數(shù)法優(yōu)、缺點優(yōu)點：簡單快捷缺點：洗脫標準難掌握重復性差無可比性力學測定方法黏附力細胞與材料間形成黏附所需的力脫附力使已形成的細胞黏附產(chǎn)生破壞所需的力離心法Fa:細胞與材料的粘 附力R:細胞與轉(zhuǎn)軸的距離:離心機角速度m:細胞質(zhì)量FaCulture dishRotating axis2Fam R流室測定法方法在流室中，細胞受到流動液體的剪切力，同時 受到流室底面材料的黏附力。黏附細胞數(shù)量的改變， 給出細胞-材料相互作用的信息。顯微鏡密封膠載玻片入口出口帶材料底面流室測定法計算公式細胞所受到的切應力： 6Qh2 w:培養(yǎng)液粘度;Q:流室流量;h:

6、 流室高度;w:流室寬度。hQ流室測定法細胞排列 0 0微吸管法Fa RpP2Fa：細胞與材料的 粘附力 Rp：微吸管內(nèi)徑 P：微吸管吸壓Cell detatchment from surface polymerPolymerCellMicropipetteFocal adhesion細胞與材料黏附的影響因素細胞因素材料因素細胞因素細胞代謝狀態(tài)：影響?zhàn)じ脚c脫附；細胞接種時間：隨接種時間增大而增大；細胞膜的疏水性：不同細胞有差異；細胞表面電荷：異性電荷有利于黏附；細胞的變形性：變形能力越強，黏附越易 發(fā)生。材料因素材料表面物理性質(zhì)：浸潤性(Wettability )、電荷 性（培養(yǎng)瓶經(jīng)輝光放電或

7、酸處理）；材料表面化學性質(zhì)：不同聚合物、不同基團及成 分吸附細胞數(shù)量及能力不同；材料表面修飾：裱襯(Coating)蛋白質(zhì)、多肽、氨 基酸、生長因子等；材料表面形態(tài)：粗糙度(Roughness)及特化結(jié)構(gòu)(Texture)。材料表面特性的影響不同聚合物具有不同的細胞黏附性；聚苯乙烯（PS）：黏附性聚合物；聚羥乙基丙烯酸甲酯（pHEMA） ：非黏附性聚 合物；用不同比例的PS和pHEMA獲得不同的細胞黏附 性的基底。篩選材料時考慮其黏附特性表面物理特性的影響細胞在中等浸潤性的表面上黏附較好；在正電荷表面細胞黏附增加；細胞培養(yǎng)基底常用輝光放電或酸處理增加表面的 帶電基團數(shù)。比如：pHEMA 經(jīng)酸處

8、理增加了細胞的黏附性；PS表面等離子噴涂促進細胞黏附。表面化學特性的影響表面血清存在有利于細胞黏附；化學基團（Chemical functionalities）：如- OH，-C-O影響細胞黏附；吸附蛋白質(zhì)：如FN,LN等增加細胞黏附；表面化學修飾：共聚、接枝。特化的黏附細胞表面Hydrophobic (cell unfriendly) surface has been laid downover a hydrophilic surface through a mesh mask. This left a gridwork pattern ofhydrophilic surface, whic

9、h has been preferentially colonised by cells in culture.聚合物共混黏附表面The polymers differ only in the proportions of the two component blocks used:has a high density of cells, whilehas no adherent cells.ABABA:親水性聚 合物;B:疏水性聚 合物.聚合物的降解性降解性聚合物為細胞黏附提供了動態(tài)基質(zhì)組織工程支架的要求;PLA，PGA，PLGA是常用的降解性聚合 物，利于細胞黏附并經(jīng)FDA認可；細胞介導的

10、聚合物降解機制Synthetic peptides may be incorporated into materials to facilitate : controlled degradation via cell mediated enzymaticdegradation材料表面修飾(Surface modification )預涂純化的黏附分子，促進細胞黏附；預涂黏附分子抑制劑，抑制細胞黏附；表面固定膠原及其它胞外基質(zhì)分子；表面固定生物活性功能基團，短肽鏈或氨基 酸序列等，提高非(弱)黏附表面的特性；固定氨基酸、糖類等碳水化合物促進細胞黏 附。材料表面結(jié)構(gòu)的影響材料表面形態(tài)結(jié)構(gòu)（纖維、多

11、 孔）；材料表面微結(jié)構(gòu)（微米、納 米）；表面粗糙結(jié)構(gòu)（含溝、槽）；表面凹凸結(jié)構(gòu)（含峰、谷）；表面特化結(jié)構(gòu)（黏附區(qū)、非黏附 區(qū)）。材料物理狀態(tài)對細胞的影響拉力細胞生物材料牽拉表面對細胞粘附的影響肌腱細胞+硅膠膜： 二維動態(tài)培養(yǎng)ABA: non-stretchB: stretch牽拉表面對細胞功能的影響細胞與材料黏附分類非特異性黏附(Non-specific adhesion) ： 由細胞和材料表面物理性質(zhì)決定特異性黏附(Specific adhesion)：由細胞 和材料表面分子間的特異相互作用決定 (Specific adhesion forces at molecular contact)黏

12、附力的類型非特異性黏附力：范德瓦爾斯（Van der Waals）力靜電作用力其它物理作用力 特異性黏附力：受體-配體相互作用力范德瓦爾斯力分子的空間位置或運動與其它分子的 空間位置或運動相互關(guān)聯(lián)而產(chǎn)生的 力，其大小與r-6成正比。靜電作用力(electrostatic interactions)同種電荷產(chǎn)生相互排 斥力(repulsive)；異種電荷產(chǎn)生相互吸 引力(attractive)。其大小與電荷量及二者間距有關(guān)qqeF K 12r 2rq1q2Fe受體-配體相互作用鑰匙 與 鎖 的 作 用受體-配體相互作用：綜合作用非共價的；幾何形狀匹配的；許多弱相互作用；取決于受體和配體的距離、角

13、度和位形(Conformation)；距離合適，若角度和位形不匹配，會“視而不見”。整合素蛋白受體 ：介導黏附細胞-材料特異相互作用是基于連接于材料表面 的黏附蛋白（作為配體）與細胞表面的整合素蛋 白(integrin)（作為受體）間的特異性黏附；這種受體-配體間的特異性相互作用可通過人工 合成多肽或蛋白質(zhì)在體外進行模擬。短鏈多肽典型的氨基酸三肽鏈精氨酸-甘氨酸-天冬 氨酸序列Arg-Gly-Asp (RGD) ；RGD在很多胞外基質(zhì)黏附蛋白活性鏈中存 在（CN，F(xiàn)N）；與整合素蛋白(Integrin)受體特異性結(jié)合。RGD介導的粘附Synthetic peptides may be inco

14、rporated into materials to facilitate cell attachment through specific ligands.胞外基質(zhì)蛋白（ECM）細胞對胞外基質(zhì)蛋白，如纖維粘連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N) 和層粘連蛋白（ Laminin ，LN)的黏附，主要由整合素 蛋白質(zhì)(Integrin)受體介導；整合素蛋白質(zhì)受體介導的細胞黏附，是受 體激活和力學耦合到胞外基質(zhì)配體上的高 度調(diào)節(jié)過程?？桂じ阶饔米钄嗷蛘吒偁幮晕讲牧媳砻娴呐潴w，或 者細胞表面的受體，可有效地抑制細胞與 材料的特異性黏附；設計材料表面特化區(qū)域；設計醫(yī)用植入材料，用于防止組織粘連。 腹

15、壁和肌腱修復中防粘連。FN和膠原介導的黏附特異性細胞反應植入物表面與細胞或蛋白質(zhì)發(fā)生的特異性相 互作用；在設計材料時在其表面進行分子設計，可以 促進植入物與機體組織發(fā)生特異性黏附；這種設計可極大地促進植入材料與細胞間發(fā) 生的界面結(jié)合能力。這在骨科和牙科植入體提前負重有重要意義。舉例肌腱細胞與支架材料的黏附Cells and MaterialsHuman embryonic tenocytes (HETCs）Transformed human embryonic tenocytes(THETCs）Poly-D-lysine (PDL）Bovine serum albumin (BSA)Type

16、I collagen (CNI) and its Antibody (a-CNI)Fibronectin ( FN）and its Antibody (a-FN)材料表面處理方法PLGA溶于丙酮；均勻涂抹于載玻片上；凍干；表面孵育PDL或BSA；依次孵育不同濃度FN或膠原；依次孵育不同滴度FN或膠原抗體；孵育不同濃度類胰島素生長因子。聚合物膜厚度測量Polylactic acid (PLA) :18.6 mPolylactic-co-glycolicacid (PLGA): 17.3 mSurface of PolymersABCEDF細胞培養(yǎng)及黏附力測定Cell culturecell co

17、llectionCell seedingIncubation(37,5%CO2,30min)Micropipette aspiration techniqueExperimental apparatusAdhesion Force MeasurementCalculation of adhesion forceR： internal radius of micropipetteP：aspiration pressure of micropipetteap2F RP細胞脫附過程接種時間的影響012354306090120150180Seeding time(minute)Adhesion for

18、ce(10-8N)HETCs+PLGAHETCs+PLGA+FN(2.0g/ml) THETCs+PLGA THETCs+PLGA+FN(2.0g/ml)Comparison ofPLA to PLGA*and*represent statically significant differences inside and between groups , respectively（P0.05）, n is number of cellsn=36*n=52n=36*n=40*n=43*n=28*876543210PLAPLGA85/15Adhesive force(10 -8N)Polymer(PLA or PLGA85/15)(control) Polymer+BSA(50g/ml) Polymer+PDL(2g/ml)型膠原對腱細胞黏附的影響0246010125CNI concentration(g/ml)Adhesion f