實驗二蛋白質定量測定

1、分光光度法1(一)基本原理分光光度法是利用物質對某種波長的光具有選擇性吸收的特性建立起來的鑒別物質或測定其含量的一項技術。Lambert-Beer定律，吸光度與溶液的濃液成正比，與光束通過溶液的距離(即光程)成正比，用數學表達式表示為： A=KLCC：物質的濃度，L：光程（cm），K為吸光系數或消光系數。2（二）待測溶液的濃度計算1、利用標準管法計算待測溶液的濃度：2、利用標準曲線進行換算：3、利用吸光系數（消光系數）求出待測溶液的濃度。3根據Lambert-beer定律： 標準管：As=KLCs (下標S：標準液) 待測管：Ax=KLCx (下標X：待測液)L相等，溫度相同，測定同一物質，所

2、用單色光相同，則K相同，則： As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/AsCs在實際操作中，常使待測管體積與標準管體積相等(以X代表測定管含量，S代表標準管含量)則： X=Ax/AsS計算待測溶液濃度時，可根據測定時實際吸取的標準液的體積(Vs)和待測樣品的體積(Vx)，將上式演變?yōu)椋?待測溶液濃度：Cx=Ax/AsCsVs/Vx利用標準管法計算待測溶液的濃度4利用標準曲線進行換算 1標準曲線的作用 (1) 又叫做校正曲線或工作曲線。從濃度一光密度直線的直線特性，判斷所采用方法的呈色反應是否符合lambertBeer定律。 (2)作多次平行測定繪制標準曲線，可判斷在整個測定過程中操作、儀器等誤差的

3、大小，確定該測定方法的可靠性。 (3)從繪制標準曲線的斜率可以比較各種方法的靈敏度。 (4)大批樣品分析時，省略多次計算，從光密度值直接查閱標準曲線而求得被測物質的濃度。標準曲線的繪制52標準曲線的作法(1) 標準液濃度的選擇：標準液濃度選擇一般應能包括待測樣品的可能變異最低與最高值，一般選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級增加。(2) 標準液的測定：在比色時，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產生的誤差。(3) 標準曲線圖的繪制：一般常用光密度一濃度標準曲線。6【操作】73、標準曲線圖的繪制 用普通方格紙作圖。圖紙長寬=11或長寬=32，以橫軸為濃度，縱軸為光密度

4、。繪制標準曲線時，將各座標點和原點連成一條線。若各點不在一直線，則可通過原點，盡可能使直線通過更多點，使不在直線上的點盡量均勻地分布在直線的兩邊。座標紙上注明：測定物及測定方法的名稱，儀器型號、波長及繪制的日期、室溫。8標準曲線根據Lambert-Beer定律， A與C成正比配制一系列標準液C1、C2、C3，在max下，測相應的A1、A2、A3。實驗項目,儀器型號,波長,日期,室溫.mg/ml9利用吸光系數（消光系數）求出待測溶液的濃度根據Lambert-Beer氏定律：A=KLC若C為1%（g/ml），L為1cm，此時的K值稱為百分吸光系數用E1%1cm表示.即：C=A/E1%1cm若C為1

5、mol/L，L為1cm，其K值稱為摩爾吸光系數，用表示即； C=A/10(三)波長的選擇11最大吸收峰的波長(max) 根據三個原則： 1.被測溶液有適當的光密度，適當的光密度為0.1- 0.7，以0.2- 0.6最理想。 2.應使干擾影響降低至最低限度。 3.應使標準曲線在盡可能大的范圍內接近直線。12蛋白質定量分析技術13雙縮脲法紫外分光光度法BCA（二喹啉甲酸）法Lowry法(Lowry改良法)考馬斯(Comessie)亮蘭結合法凱氏定氮法14雙縮脲法測定蛋白質含量15雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反應生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中含有許多肽鍵(-CONH-)在堿性溶液中也能與Cu2+反應產生紫紅色化合物。在一定范圍內，其顏色的深淺與蛋白質濃度成正比。操作簡便、迅速、受蛋白質種類性質的影響較小；靈敏度較差，特異性不高。-CONH2、 -CH2NH2、 -CS-NH2等基團也有此反應。【原理】16【操作】17【結果】(一)在座標紙上以光密度為縱座標，以蛋白質濃度為橫座標繪制標準曲線。(二)從標準曲線中查出待測血清樣本的蛋白質濃度(g/L)，并求出人血清樣本的蛋白質濃度。(三)從標準管中選擇一管與測定管光密度相接近者，求出人血清樣本的蛋白質濃度(g/L)。18原始數據記錄日期，室溫實驗項目19實驗報告1、