實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)定量測定

1、分光光度法1(一)基本原理分光光度法是利用物質(zhì)對某種波長的光具有選擇性吸收的特性建立起來的鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項(xiàng)技術(shù)。Lambert-Beer定律，吸光度與溶液的濃液成正比，與光束通過溶液的距離(即光程)成正比，用數(shù)學(xué)表達(dá)式表示為： A=KLCC：物質(zhì)的濃度，L：光程（cm），K為吸光系數(shù)或消光系數(shù)。2（二）待測溶液的濃度計(jì)算1、利用標(biāo)準(zhǔn)管法計(jì)算待測溶液的濃度：2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算：3、利用吸光系數(shù)（消光系數(shù)）求出待測溶液的濃度。3根據(jù)Lambert-beer定律： 標(biāo)準(zhǔn)管：As=KLCs (下標(biāo)S：標(biāo)準(zhǔn)液) 待測管：Ax=KLCx (下標(biāo)X：待測液)L相等，溫度相同，測定同一物質(zhì)，所

2、用單色光相同，則K相同，則： As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/AsCs在實(shí)際操作中，常使待測管體積與標(biāo)準(zhǔn)管體積相等(以X代表測定管含量，S代表標(biāo)準(zhǔn)管含量)則： X=Ax/AsS計(jì)算待測溶液濃度時(shí)，可根據(jù)測定時(shí)實(shí)際吸取的標(biāo)準(zhǔn)液的體積(Vs)和待測樣品的體積(Vx)，將上式演變?yōu)椋?待測溶液濃度：Cx=Ax/AsCsVs/Vx利用標(biāo)準(zhǔn)管法計(jì)算待測溶液的濃度4利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的作用 (1) 又叫做校正曲線或工作曲線。從濃度一光密度直線的直線特性，判斷所采用方法的呈色反應(yīng)是否符合lambertBeer定律。 (2)作多次平行測定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可判斷在整個(gè)測定過程中操作、儀器等誤差的

3、大小，確定該測定方法的可靠性。 (3)從繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可以比較各種方法的靈敏度。 (4)大批樣品分析時(shí)，省略多次計(jì)算，從光密度值直接查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線而求得被測物質(zhì)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制52標(biāo)準(zhǔn)曲線的作法(1) 標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測樣品的可能變異最低與最高值，一般選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級(jí)增加。(2) 標(biāo)準(zhǔn)液的測定：在比色時(shí)，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：一般常用光密度一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。6【操作】73、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制 用普通方格紙作圖。圖紙長寬=11或長寬=32，以橫軸為濃度，縱軸為光密度

4、。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，將各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)連成一條線。若各點(diǎn)不在一直線，則可通過原點(diǎn)，盡可能使直線通過更多點(diǎn)，使不在直線上的點(diǎn)盡量均勻地分布在直線的兩邊。座標(biāo)紙上注明：測定物及測定方法的名稱，儀器型號(hào)、波長及繪制的日期、室溫。8標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)Lambert-Beer定律， A與C成正比配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液C1、C2、C3，在max下，測相應(yīng)的A1、A2、A3。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,儀器型號(hào),波長,日期,室溫.mg/ml9利用吸光系數(shù)（消光系數(shù)）求出待測溶液的濃度根據(jù)Lambert-Beer氏定律：A=KLC若C為1%（g/ml），L為1cm，此時(shí)的K值稱為百分吸光系數(shù)用E1%1cm表示.即：C=A/E1%1cm若C為1

5、mol/L，L為1cm，其K值稱為摩爾吸光系數(shù)，用表示即； C=A/10(三)波長的選擇11最大吸收峰的波長(max) 根據(jù)三個(gè)原則： 1.被測溶液有適當(dāng)?shù)墓饷芏?，適當(dāng)?shù)墓饷芏葹?.1- 0.7，以0.2- 0.6最理想。 2.應(yīng)使干擾影響降低至最低限度。 3.應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)曲線在盡可能大的范圍內(nèi)接近直線。12蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)13雙縮脲法紫外分光光度法BCA（二喹啉甲酸）法Lowry法(Lowry改良法)考馬斯(Comessie)亮蘭結(jié)合法凱氏定氮法14雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量15雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵(-CONH-)在堿性溶液中也能與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。操作簡便、迅速、受蛋白質(zhì)種類性質(zhì)的影響較?。混`敏度較差，特異性不高。-CONH2、 -CH2NH2、 -CS-NH2等基團(tuán)也有此反應(yīng)?！驹怼?6【操作】17【結(jié)果】(一)在座標(biāo)紙上以光密度為縱座標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(二)從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出待測血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(g/L)，并求出人血清樣本的蛋白質(zhì)濃度。(三)從標(biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測定管光密度相接近者，求出人血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(g/L)。18原始數(shù)據(jù)記錄日期，室溫實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目19實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、