ECIS細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀-PowerPoint演示文稿

1、ECIS細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀 細(xì)胞生物學(xué)研究新技術(shù)平臺 Ivar Giaever Winner of the 1973 Noble Prize in PhysicsECIS技術(shù)的發(fā)明人 Electric Cell-Substrate Impedance Sensing（ECIS）是一種細(xì)胞行為學(xué)動(dòng)態(tài)研究的技術(shù)平臺，能夠?qū)崟r(shí)、 定量、無損傷、非介入地研究生長細(xì)胞形態(tài)、位置、數(shù)目等變化。三大特點(diǎn)：無損傷的細(xì)胞動(dòng)態(tài)研究平臺（不用染色、標(biāo)記）實(shí)時(shí)定量地進(jìn)行測量，實(shí)時(shí)獲取數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有高度可重復(fù)性，而傳統(tǒng)方法對細(xì)胞動(dòng)態(tài)行為多數(shù)只能采用定性研究ECIS 技術(shù)簡介ECIS 測量技術(shù)原理ECIS （Electri

2、c Cell-substrate Impedance Sensing）從基底電極板到培養(yǎng)液的電流通過細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目、形態(tài)變化、細(xì)胞間、細(xì)胞與基底之間連接緊密度、細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)等，均導(dǎo)致可測量的電阻值變化細(xì)胞層電阻研究技術(shù) ECIS 基本原理：測量電極與溶液間的電阻 當(dāng)電極上覆蓋生長細(xì)胞時(shí)，由于這些細(xì)胞的覆蓋率、細(xì)胞間連接的緊密程度、細(xì)胞與基質(zhì)間的空間大小等因素影響，會(huì)出現(xiàn)電阻變化 上圖是直徑250um金屬圓孔電極的顯微照片。金屬表面是經(jīng)過特殊工藝處理過的，適宜細(xì)胞生長的區(qū)域 中心圓孔電極周圍的黃色區(qū)域是絕緣層，絕緣層同樣很適合細(xì)胞的生長, 其表面是按正常細(xì)胞培養(yǎng)板表面制作的目前已發(fā)表過的相關(guān)文獻(xiàn)

3、的細(xì)胞種類有： BAEC、BPAEC、Caco2-BBE、ECV304、HEK、LP3、MCF-7、MDCK、Myoblast、NRk、Orbital Fibroblasts 、 ROS17/2.8 V79、WI38等數(shù)百種細(xì)胞系細(xì)胞類型 細(xì)胞損傷和修復(fù) 細(xì)胞生長和粘附 細(xì)胞對藥物、刺激物和病毒感染的反應(yīng) 腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移 細(xì)胞微運(yùn)動(dòng) 細(xì)胞趨化 流動(dòng)狀態(tài)下的細(xì)胞行為 不同氧環(huán)境下細(xì)胞生長的研究ECIS技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域ECIS在損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用傳統(tǒng)的損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)：劃痕實(shí)驗(yàn)人為因素的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果難于評估ECIS損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)： 操作自動(dòng)化 實(shí)驗(yàn)的高度重復(fù)性 實(shí)時(shí)定量地監(jiān)測細(xì)胞損傷修復(fù)過程，數(shù)據(jù)便

4、于統(tǒng)計(jì)分析Electrical Wound-healing For Cells in vitro Charles R. Keese, etc. Nov 24, 2003 PNASX軸：時(shí)間 Y軸：細(xì)胞電阻上圖：BS-C-1細(xì)胞按1.25 X 105/cm2加入六孔電極板，細(xì)胞逐漸生長至覆蓋全板下圖：三個(gè)孔的細(xì)胞損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)：第一個(gè)孔未作電擊第二個(gè)孔以3V 40KHz 10秒電擊第三個(gè)孔以3V 40KHz 30秒電擊然后觀察細(xì)胞電擊損傷后逐漸修復(fù)生長的情況PNAS. 101: 1554-1559 (2003).用相差顯微鏡觀察MDCK細(xì)胞ECIS損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)的變化：a) 電擊前 e) 電擊前活細(xì)

5、胞染色（紅色代表死細(xì)胞）b) 電擊后即刻觀察 f) 電擊后即刻活細(xì)胞染色c-d) 電擊后10和20小時(shí)觀察，見到細(xì)胞呈向心性生長修復(fù)類似實(shí)驗(yàn)：六孔電極板NRK細(xì)胞一個(gè)孔未作電擊另五個(gè)孔以2.5V 40KHz分別10、30、60、120、180秒電擊上圖：測量細(xì)胞層電阻下圖：測量細(xì)胞層電容圖中可看到在用高電壓對細(xì)胞進(jìn)行損傷后，電阻值瞬間下降，然后再恢復(fù)低電壓來進(jìn)行監(jiān)控其生長修復(fù)過程PNAS. 101: 1554-1559 (2004).Activation of epithelial CD98 glycoprotein perpetuates colonic inflammation Torst

6、en Kucharzik1,etc. Laboratory Investigation (2005) 110Caco2-BBE細(xì)胞，電擊4.5V，40KHz，30sa. 紅線：電極板預(yù)包被anti-CD98 綠線：電極板預(yù)包被對照蛋白b. a圖的顯微鏡觀察圖c. Caco2-BBE細(xì)胞用DSS預(yù)處理重復(fù)a圖實(shí)驗(yàn)可見anti-CD98抑制DSS處理的Caco2-BBE細(xì)胞損傷修復(fù)d. c圖的顯微鏡觀察圖ECIS技術(shù)測量細(xì)胞生長比較BSC-1細(xì)胞和NRK細(xì)胞不同的生長曲線 軟骨細(xì)胞生長的連續(xù)監(jiān)控ECIS在細(xì)胞、基底膜相互作用方面的研究 -細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附生長的關(guān)系WI-38細(xì)胞在不同基質(zhì)上的生

7、長情況：四孔電極板分別包被: 層粘連蛋白(Laminin) 血清(Serum) 彈性蛋白(Elastin) 纖粘連蛋白(Fibronectin)上圖：不同基質(zhì)對細(xì)胞生長促進(jìn)作用不同新方法研究細(xì)胞在不同基質(zhì)表面粘附生長的快慢程度product review Nature . 366 : 591-592(1993).新方法研究細(xì)胞在不同基質(zhì)表面粘附伸展的快慢程度一篇文獻(xiàn)的分析Electric CellSubstrate Impedance Sensing (ECIS) as a NoninvasiveMeans to Monitor the Kinetics of Cell Spreading t

8、o Artificial SurfacesJoachim Wegener, etc. Experimental Cell Research 259 (2000)MDCK細(xì)胞在10-100,000Hz電場下，0-20小時(shí)三維實(shí)時(shí)生長曲線，電極板上預(yù)鋪血清：上圖：細(xì)胞層電阻下圖：細(xì)胞層電容一篇文獻(xiàn)的分析（1）/（2）：WI-38 / VA-13細(xì)胞加入1mM RGDS四肽（箭頭處）對照：加入無關(guān)四肽RGDS無關(guān)四肽RGDS：Integrin家族核心活性保守四肽序列介導(dǎo)細(xì)胞與多種基底膜蛋白相互作用Measurements of endothelial cell-to-cell and cell-to

9、-substrate gaps and micromechanical properties of endothelial cells during monocyte adhesion Noriyuki Kataoka, etc. 99(24) 2002 PNASECIS同時(shí)測量HUVEC細(xì)胞：1 細(xì)胞層總電阻2 細(xì)胞與細(xì)胞間連接的電阻3 細(xì)胞層與基底膜間的電阻細(xì)胞層總電阻細(xì)胞間電阻細(xì)胞與基底膜間電阻說明：ECIS儀器具備獨(dú)特的功能，能單獨(dú)測量細(xì)胞層與基底膜間的電導(dǎo)，通過公式將電導(dǎo)換算成電阻，就得到了細(xì)胞層與基底膜間的單獨(dú)電阻HUVEC細(xì)胞加入單核細(xì)胞和不加入單核細(xì)胞兩種條件下測量HUVEC細(xì)

10、胞層的韌性。比較兩者可知，加入單核細(xì)胞后，HUVEC細(xì)胞層變“軟”了GFP標(biāo)記的單核細(xì)胞和紅色熒光染色的HUVEC細(xì)胞在電極板上混雜生長的熒光共聚焦顯微鏡三維計(jì)算機(jī)模擬成像細(xì)胞對藥物，刺激物，病毒感染的反應(yīng)細(xì)胞浸潤遷移的研究ECIS新方法先在電極板上鋪內(nèi)皮細(xì)胞形成單層，然后再加入遷移細(xì)胞，研究其侵襲轉(zhuǎn)移以及對內(nèi)皮層細(xì)胞的破壞能力，比起傳統(tǒng)方法更能真實(shí)的模擬內(nèi)皮層的活性狀態(tài)，并且有連續(xù)性精確性，操作簡單，不須人工染色計(jì)數(shù)等過程，減少了誤差ECIS技術(shù)研究細(xì)胞侵潤利用ECIS技術(shù)測量細(xì)胞層電阻變化，比較：AT3細(xì)胞（強(qiáng)侵潤性）、G細(xì)胞（弱侵潤性）、和對照（不添加細(xì)胞） 對HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞的侵潤白

11、細(xì)胞侵潤The Lectin-Like Domain of Complement Receptor 3 Protects Endothelial Barrier Function from Activated Neutrophils1. Vassiliki L. Tsikitis, The Journal of Immunology, 2004, 17310血清（上圖） 1血清（下圖）MLL細(xì)胞對HUVEC細(xì)胞層的侵潤Real-Time Impedance Assay to Follow the Invasive Activities of Metastatic Cells in Cultur

12、e. Charles R. Keese,etc. BioTechniques 33:842-850 (October 2002)ECIS技術(shù)研究細(xì)胞趨化Automated Real-Time Measurement of Chemotactic Cell Motility Nacima Hadjout,etc BioTechniques 31:1130-1138 (November 2001)A：以葉酸為趨化化合物，少量NC4A2細(xì)胞從電極板一側(cè)（左下）遷移（右上）測量到的細(xì)胞層電阻值變化。由圖可見，隨著細(xì)胞進(jìn)入電極孔范圍，電阻值上升，隨著細(xì)胞進(jìn)一步遷移出電極孔，電阻值又下降B：顯微鏡下觀察遷

13、移過程，與電阻測定值對應(yīng)ECIS技術(shù)研究細(xì)胞遷移NC4A2細(xì)胞在不同葉酸濃度下的趨化速度，以及相應(yīng)細(xì)胞層電阻變化曲線流動(dòng)狀態(tài)下的細(xì)胞行為 可模擬勻速流動(dòng)以及模擬脈博頻率的流動(dòng)專為流動(dòng)狀態(tài)設(shè)計(jì)的ECIS電極板不同氧環(huán)境下細(xì)胞生長的研究細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀 ECIS ZECIS Z的性能參數(shù) Simple impedance ZConstant currentWell capacity: 16 or 96 wellsMaximum data acquisition rate (single frequency): 5 point / secAvailable frequencies: continuou

14、sly variable from 4 kHz to 64 kHzMulti-frequency measurements: 8 frequencies ranging from 4 kHz to 64 kHz (10 seconds per well acquisition rate)Measurement range: 500-500 kohmsReproducibility: 1%Wounding/Electroporation current: 8 step controlPercent error in measurement: 1%Wounding/Electroporation current: 256 step controlPercent error in measurement: 1%Sine wave purity: 1