免疫學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)修

1、免疫學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名: 姚麗君專業(yè)：針灸推拿學(xué)年級(jí)：2002年研究生實(shí)驗(yàn)室：免疫試驗(yàn)室時(shí)間：2003年1月12日教師：李永念老師免疫學(xué)教研室人血清I的提取及鑒定主要原理：離子交換層析提取人血清I gG：離子交換劑采用DEAE-纖維素，是表面交聯(lián)有二乙基乙胺基團(tuán)的纖維素，本身帶有真電荷，能吸附陰離子。DEAE-纖維素懸浮在PH高于6.5，克分子濃度低的緩沖液內(nèi)，置備成層析柱。人血清經(jīng)過PH7.4磷酸緩沖液透析平衡后，其中的IgG不帶電荷或僅帶少量電荷，其他的蛋白質(zhì)則主要帶負(fù)電荷，這樣的血清樣品通過相同緩沖液平衡好的DEAE-纖維素柱，除IgG以外的血清蛋白都吸附在柱上，僅IgG最易形

2、成吸附-解離-再吸附-再解離的狀態(tài)，因此能隨洗脫液一起最早從柱中流出，收集洗脫液獲得IgG。血清I鑒定：以收集的洗脫液為抗原，與兔抗人IgG做瓊脂雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)沉淀線的形成確定IgG抗原性。用免疫電泳法使血清中各種蛋白的分子大小以及電荷狀態(tài)、電荷量均有差異，因而它們的泳動(dòng)速率也不相同，根據(jù)在凹槽中加入免抗人血清，上下兩孔加入用蔗糖包埋法進(jìn)行濃縮后的濃縮液和正常人血清，經(jīng)一段時(shí)間后出現(xiàn)沉淀弧，根據(jù)沉淀弧的情況來檢測(cè)所獲的IgG的純度。用754型分光光度計(jì)于280nm紫外光源測(cè)定洗脫液光密度值，根據(jù)IgG的E1cm1%=14.3(OD)公式，可計(jì)算出收獲的IgG含量，并推算出所獲得IgG的百分

3、率。主要材料：0.5N NaOH、0.5N HCL 、0.85%NaCL按常規(guī)配制DEAE-纖維素 健康人全血PH7.4 0.01M磷酸緩沖液20%三氯醋酸水溶液按W/V比例配制蔗糖（研成細(xì)粉狀）PH8.6 0.025MBA巴比妥納-巴比妥緩沖液，2M NaCL水溶液1.5%瓊脂凝膠布氏漏斗、抽濾瓶、水泵、試管，燒杯，玻璃棒，濾紙?jiān)嚰?、蝴蝶鐵架、透析袋、離心機(jī)，746-電泳儀、754型分光光度計(jì)三、操作步驟：（一）DEAE-纖維素預(yù)處理：稱取DEAE-纖維素1克，均勻撒在事先盛有150ml 0.5NNaOH的燒杯中，人其自由沉降，放置分鐘，不時(shí)地用玻璃棒輕輕攪動(dòng)。將湖狀物移入墊有濾紙的布氏漏斗

4、中，連接漏斗抽濾瓶，并用水泵抽干糊狀物。立即將DEAE-纖維素移入燒杯中，加蒸餾水，浸泡20-30min并不時(shí)攪拌，再移入漏斗抽干，如此重復(fù)，至洗出的PH值等于8即可。將交換劑移入150ml 0.5N HCL中放置40-50min，不時(shí)輕輕攪動(dòng)，移入布氏漏斗抽濾，再依同法用0.5N NaOH處理一次，時(shí)間不超過50min。重第2項(xiàng)操作，至抽濾液PH值等于8即可，最后PH7.4 0.01MPB液浸泡交換劑，抽干，再重復(fù)一次，然后將交換劑用相同PB調(diào)成糊狀，保留至裝柱。裝柱、平衡固定層析柱在蝴蝶鐵架上，垂直。柱上方放置PH7.4 0.01MPB液的洗脫瓶，以乳膠管相連，柱底部有細(xì)膠管，裝止水夾，調(diào)

5、節(jié)流速。將上糊狀物傾入柱中，打開柱底流出口，用燒杯接流出液，注意不能斷層，纖維素中不允許進(jìn)空氣，柱上表面要平，上部要留有約3cm高空間。上樣和洗脫將人血置離心機(jī)以2000rpm，10min離心，取出并用毛細(xì)吸管吸取10 ml人血清裝入透析袋，于燒杯內(nèi)浸入40倍于血清體積的起始緩沖液中，置4冰箱內(nèi)透析過夜，中途更換兩次緩沖液;打開柱上端塞子，用帶有橡皮乳頭的毛細(xì)吸管吸出交換劑表面的緩沖液，至仍2mm厚的液面，以免空氣進(jìn)入;用清潔細(xì)吸管將已平衡好的血清樣本原柱管內(nèi)壁緩緩加在纖維素柱表面，調(diào)節(jié)流速，使樣品進(jìn)入交換柱內(nèi)，約3ml/10min;待液面還約2mm厚的樣品時(shí)，用少量起始PB沖洗柱內(nèi)壁，到PB

6、進(jìn)入交換劑仍留有2mm后液面時(shí)，再?zèng)_洗二次，保持柱面平整;最后加適量起始緩沖液，連接洗脫瓶，流速調(diào)至30-40ml/cm2/h ;收集洗脫液與試管中，每管5ml，共收集12管。并從各管中取1-2滴，加20%三氯醋酸1-2滴檢測(cè)。洗脫液抗原性鑒定用1.5%瓊脂凝膠制版，根據(jù)下圖用打孔器打孔：加樣：中心孔加入兔抗人IgG，從收集的12管洗脫液中用毛細(xì)吸管吸取洗脫液分別加入周圍六孔，每孔所加樣品的量以液面與孔測(cè)平齊為準(zhǔn)；將瓊脂板置濕盒內(nèi)37溫箱孵育24小時(shí)，觀察結(jié)果。 IgG純度鑒定瓊脂板制作：用1. 5%瓊脂凝膠加熱融化后傾注在載玻片上，玻片上放一條細(xì)玻棒，等凝膠凝固后在玻棒上下兩側(cè)打孔，制成如圖

7、所示：洗脫液的處理：將通過離子交換層析法收集的12管洗脫液，用754型分光光度計(jì)測(cè)各管洗脫液在波長280nm的光密度值，第一個(gè)蛋白峰為IgG，收集有IgG活性的三管洗脫液，混合后裝于透析袋內(nèi)，用蔗糖粉末將其包埋使其濃縮；加樣：如圖示上孔加入濃縮的IgG提取液，下孔加入正常人血清，將加樣后的瓊脂板置于746-電泳儀上，用四層紗布條做橋，連接凝膠板與電極緩沖液。該橋搭在凝膠上部分約5mm，盡量拉直，與膠面間不能有氣泡；連接電源，調(diào)節(jié)指示電壓至100V（端壓約為5V/cm），電泳槽加蓋后，電泳至血清蛋白遷移至距正極段邊緣1cm處，關(guān)閉電源；凝膠板與桌面，取出玻條，凝膠中部既成一長槽，加兔抗人全血清加

8、入槽內(nèi)與膠面水平；置凝膠板與濕盒內(nèi)，于37或室溫中孵育，12小時(shí)觀察沉淀弧出現(xiàn)的情況。7、 計(jì)算回收率：取透析袋內(nèi)濃縮的提取液，用754型分光光度計(jì)測(cè)波長280的光密度值，如果超出測(cè)定范圍，稀釋后再測(cè)，按濃縮后IgG(mg/ml)=OD2801.43回收體積，正常人血清IgG:12(mg/ml) 收集的血清體積，回收率=濃縮IgG/正常人血清IgG，計(jì)算回收率。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、DEAE-纖維素洗脫，收集洗脫液12管，均為略帶黃色的液體，取樣添加20%三氯醋酸，各管中僅第4、5管出現(xiàn)渾濁，表明試管洗脫液中含蛋白質(zhì)。其余管未見明顯反應(yīng)。745型分光光度計(jì)測(cè)出12管洗脫液的光密度（OD）值如下：管

9、數(shù)123456789101112A2800.0240.0322.853.042.650.660.1920.1550.1330.1130.1100.110做A280光密度值峰值曲線圖如下：A280 （試管數(shù)）經(jīng)過蔗糖粉末包埋后，收集到濃縮的IgG為3.5ml，測(cè)其OD值為3.52，此值已經(jīng)超出光密度計(jì)測(cè)定范圍，取0。5ml濃縮液加2.5ml生理鹽水稀釋5倍后測(cè)OD值為2.52。按下列方法計(jì)算IgG回收率：濃縮后IgG：C(mg/ml)=OD2801.43體積（3. 55）正常人血清IgG：12(mg/ml) 體積(8ml)回收率=濃縮IgG/正常人血清IgG=2.521.433.55/128=6

10、5.69%向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果如下圖，有白色成沉淀線出現(xiàn)，彼此相互融合相連。疫電泳（純度鑒定）如下圖，有沉淀弧出現(xiàn)，提取液與抗人全血清之間只出現(xiàn)一條沉淀弧，并靠近凝膠板負(fù)極端，說明所提取IgG為純品。人血清與抗人血清之間由于存在多抗原抗體成分，所以出現(xiàn)多條沉淀弧。五、分析與討論：IgG是一種具有抗體活性的免疫球蛋白，其具有一般蛋白質(zhì)的通性，是再次體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要Ig。IgG主要由脾臟和淋巴結(jié)中漿細(xì)胞合成，含量高（在血清中含量最高），分布廣，它能與抗原特異性結(jié)合，從而在體內(nèi)介導(dǎo)多種生理和病理效應(yīng)。本次試驗(yàn)是利用離子交換劑的特性，血清中IgG不帶電荷或僅帶少量電荷，其它的蛋白質(zhì)則主要帶負(fù)電荷，

11、使人血清通過帶陽離子DEAE-纖維素制成的交換劑，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)與陽離子交換劑結(jié)合，而不帶電荷的IgG處于游離狀態(tài)，用PH7.4的磷酸緩沖液通過層析柱，未結(jié)合的IgG隨洗脫液 一起流出，試管收集，這樣使血清樣品通過DEAE-纖維柱而得以分離出IgG。收集的洗脫液顏色略帶黃色，可能是收集血清時(shí)吸入了破碎的紅細(xì)胞。在加入三氯醋酸后4、5管出現(xiàn)沉淀，說明從第4管開始有大量的IgG存在，IgG峰值集中在3、4、5三管，并峰值上升和下降很快，未見饅頭峰，證明洗脫較好。本次試驗(yàn)已成功地收集了IgG。從雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果看，中間孔抗人IgG與周圍孔的提取液IgG之間的凝膠出現(xiàn)一條白色沉淀線，3、4、5

12、孔之間形成的沉淀線相互吻合，這說明IgG與抗體抗人IgG濃度相當(dāng)，提取液為單一抗原，即IgG。通過免疫電泳結(jié)果看：在滴加濃縮提取液的一測(cè)出現(xiàn)一條沉淀弧，說明濃縮提取液中只有一種抗原物質(zhì)，而在滴加正常人血清的一測(cè)出現(xiàn)多條沉淀弧，說明正常人血清中存在多種抗原物質(zhì)。所以，通過以上兩個(gè)試驗(yàn)證明：經(jīng)分離提取的為純IgG。根據(jù)回收率看本實(shí)驗(yàn)的提取及回收比較有效，亦可根據(jù)公式計(jì)算IgG的濃度為18.018mg/ml。實(shí)驗(yàn)七 抗體形成細(xì)胞的檢測(cè)一、脾細(xì)胞介導(dǎo)的羊紅細(xì)胞分光光度計(jì)定量測(cè)定法（QHS）二、主要原理將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾臟制成細(xì)胞懸液，與一定量的綿羊紅細(xì)胞在試管內(nèi)混合，加入適量補(bǔ)體，在水浴中孵育

13、一定時(shí)間，在補(bǔ)體的參與下，引起抗體形成細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞溶解，而且溶血的程度與脾細(xì)胞中的抗體形成細(xì)胞總數(shù)有一定的關(guān)系，與抗體形成細(xì)胞所分泌的抗體量有關(guān)，但不能反映單個(gè)抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量。因抗體形成細(xì)胞上有抗綿羊紅細(xì)胞抗體，與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合，在補(bǔ)體的激活下，綿羊紅細(xì)胞溶解，故抗SRBC抗體又稱溶血素。通過一定量SRBC完全溶解的最高血清稀釋度得到溶血素的效價(jià)。QHS法可用于檢測(cè)藥物對(duì)SRBC誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生過程是否有刺激作用和抑制作用。三、主要材料SRBC保存液，預(yù)先洗三次，配置為0.5%、1%濃度的SRBCBalb/c小鼠（體重25左右，雌雄隨機(jī)），免疫與未免疫小鼠各6只0.01M PH7.2

14、PBS（含Ca2+，Mg2+），生理鹽水補(bǔ)體（預(yù)先制備好的，需稀釋成1：30），熒光標(biāo)記的免疫小鼠IgG其他：水浴箱、離心機(jī)、試管、玻片、毛細(xì)吸管、組織研磨器等四、操作步驟1、先摘除免疫小鼠的眼球，收集血液于清潔干燥試管內(nèi)，待血液凝固后，置恒溫箱37內(nèi)30min，血清析出，并收集與小管保存，以備測(cè)溶血素；2、頸椎脫臼處死小鼠，暴露腹腔，用PBS清洗，用組織研磨器研磨置備單細(xì)胞懸浮液（每個(gè)脾臟加5mlNS），然后離心（2000轉(zhuǎn)/分）10min，棄上清夜，再加生理鹽水離心，如此重復(fù)3次，各管最后留下的沉淀分別加生理鹽水至8ml備用；3、取6個(gè)試管，設(shè)1、2、5號(hào)為免疫后的小鼠，3號(hào)為未免疫小鼠，

15、4、6號(hào)不裝入脾細(xì)胞，然后按如下操作，混勻，置37水浴箱30min，目測(cè)結(jié)果如下： 單位（ml）編號(hào)脾細(xì)胞（5106）/mlSRBC（0.5%）補(bǔ)體（1:30）PBC目測(cè)結(jié)果1-21（免疫鼠）11清31（未免疫鼠）11混濁4111混濁51（免疫鼠）11混濁612混濁4、溶血素效價(jià)的測(cè)定：1) 取前血清制備測(cè)血清，離心；取前制備免疫小鼠，取0.1ml于第一試管中，再加入0.9NS 1ml，混勻從中取0.5ml加入第二個(gè)試管中，再加0.5mlNS，混勻，取0.5ml加入第三管中，繼續(xù)如此加至第9管，稀釋后取出0.5ml丟棄，最后一管只加NS，然后再于各管中加入0.5ml補(bǔ)體（1:30）和0.5ml

16、 1%SRBC，搖勻，于37水浴30min，取出后看結(jié)果。方法與結(jié)果如下：管數(shù)123456789101112131415對(duì)照組小鼠血清0.10.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5-NS0.90.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5補(bǔ)體0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.51%RBC0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5結(jié)果+-血清稀釋度1:101:201:401:801:1601:3201:6401:12801:2560注：完全溶血用“+”，完全不溶血“-”依同樣方法做未免疫小鼠各10管，其結(jié)果為完全不溶血，液體混濁。五、討論與分析脾細(xì)胞介導(dǎo)的綿羊紅細(xì)胞分光光度計(jì)定量測(cè)定法運(yùn)用了細(xì)胞溶血反應(yīng)來檢測(cè)溶血的程度與抗體形成細(xì)胞總數(shù)及所分泌抗體量的關(guān)系。抗原和抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，抗體鉸鏈區(qū)構(gòu)型改變，使Fc段的補(bǔ)體結(jié)合部位暴露，補(bǔ)體C1與之結(jié)合，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，形成攻膜復(fù)合體，并在細(xì)胞膜上形成小孔，使小的可溶分子、離子以及水分可以自由通過