碳源、氮源及其他條件對vb c發(fā)酵影響的研究

1、摘要摘要本論文研究了碳源 氮源 溫度 等因素對維生素 產(chǎn)生菌發(fā)酵的影響并進(jìn)行了補(bǔ)糖 補(bǔ)氨 以及丙酸對發(fā)酵影響的研究 其主要研究內(nèi)容有以下幾個方面碳源的篩選實驗結(jié)果表明碳源 是 發(fā)酵的最佳碳源 培養(yǎng)基中起始 濃度對發(fā)酵產(chǎn)素的影響實驗結(jié)果表明 培養(yǎng)基中 的含量對菌體的生長有較大的影響 在不同水平的 加量實驗中 隨著培養(yǎng)基中起始 濃度的增加 對數(shù)生長期的菌體生長速率逐漸下降隨著 濃度的增加生物量經(jīng)過了一個由低到高再到低的變化過程發(fā)酵單位也經(jīng)過了一個類似的過程 但與生物量的變化規(guī)律有所不同 同時 當(dāng)培養(yǎng)基中 起始濃度達(dá)到 以上時會對菌體的生物量和發(fā)酵單位產(chǎn)生抑制作用發(fā)酵過程中補(bǔ)加 對發(fā)酵的影響實驗結(jié)果

2、表明 補(bǔ)加 對發(fā)酵單位上升有促進(jìn)作用 這種促進(jìn)作用可能有兩方面的原因 可能是由于生物量的增加而產(chǎn)生的可能是過程中較低的 濃度解除了其對 合成的代謝反饋抑制從而使發(fā)酵單位上升當(dāng) 濃度維持在 左右時并維持 小時對發(fā)酵單位提高最為有利 氮源的篩選通過對氮源進(jìn)行篩選得出氮源 是 發(fā)酵的最佳氮源 發(fā)酵過程中補(bǔ)加氨水對發(fā)酵的影響實驗結(jié)果表明 在一定的時期內(nèi)補(bǔ)加氨水對發(fā)酵單位的上升有促進(jìn)作用 補(bǔ)加時間過長會導(dǎo)致發(fā)酵單位的下降對氮源 的成分進(jìn)行初步分析氮源對的發(fā)酵單位有很大影響 不同來源的 對發(fā)酵的影響也不一致我們對其造成這種影響的原因進(jìn)行了初步分析氨基氮變化規(guī)律對發(fā)酵過程種氨基氮的變化規(guī)律進(jìn)行了研究 表明初

3、始 濃度和接種量的不同對氨基氮的變化有較大的影響I溫度及 對 發(fā)酵的影響摘要研究了溫度及 對菌體生長和 代謝的影響前體添加時間和添加量對 發(fā)酵的影響及其它添加物對 發(fā)酵的影響丙酸對 發(fā)酵的影響丙酸作為 合成中的代謝產(chǎn)物 其產(chǎn)生對菌體的生長和 代謝有不利的影響關(guān)鍵詞維生素 碳源氮源補(bǔ)料丙酸IIAbstractAbstractIn this work, we studied the effect of carbon resource, nitrogen resource,temperature, pH and other factors on fermentation and researched

4、 the influence ofsupplemented A, ammonia and propionic acid on VB12 production.1. Screening of carbon resourceThe result showed that carbon resource A was the best for VB12 fermentation.2. The effect of initial concentration of A on fermentationThe results showed that initial concentration of A dras

5、tically influenced thebiomass and biosynthesis of VB12. With the increase of initial concentration of A, thegrowth rate decreased during exponent phase, and the biomass changed from lower tohigher and to lower again. And the same change to the biosynthesis of VB12. Wheninitial concentration of A was

6、 7% or beyond, the biomass and VB12 production wasrepressed.3. The influence of supplemented A on VB12 productionThe experiment results showed that supplemented A could promote VB12production, and the promotion effect may be caused by the increase of biomass or theelimination of feedback inhibition

7、to VB12 biosynthesis. When concentration of A wassustained about 4% and was maintained about 20-30h, fermentation titer wasimproved largely.4. Screening of nitrogen resourceThe results showed that nitrogen resource B was the best for VB12 fermentation.5. The influence of supplemented ammonia on VB12

8、 productionThe result showed that supplemented ammonia was beneficial to improve thebiomass and fermentation titer of VB12. But if the feeding time was beyond 90h andlast the whole period of fermentation, the fermentation titer fell.6. Analysis of the components of nitrogen resource BNitrogen resour

9、ce B from different firm had different effect on VB12fermentation. We analyzed the content of protein and the kinds and the content ofamino acids of B in order to find the cause that led to the difference. But the resultsIIIAbstractdid not tell the difference.7. The change of amino nitrogen vs. time

10、We studied the change of amino nitrogen vs. time. The results showed that initialconcentration of A and inoculums quantity both had influence on the change of aminonitrogen.8. We also researched the influence of temperature and pH on the growth and thechange of A. And the effect of VB12 precursor on

11、 the VB12 fermentation9. Other additional components on the VB12 fermentation was studied too.10. propionic acid on the VB12 fermentationThe results showed that propionic acid had bad effect on VB12 fermentation.Key words vitaminB12, carbon resource, nitrogen resource, fed-batch, propionic acidIV第 1

12、 章 文獻(xiàn)綜述第 章文獻(xiàn)綜述所謂維生素 是指動物體內(nèi)物質(zhì)代謝所必需的要素 是基于生化功能的各種各樣物質(zhì)的總稱 植物一般都有合成維生素的能力 微生物中合成維生素能力隨著種屬的不同而有較大的差異 可是具有合成能力的微生物并不少 細(xì)菌中既有合成維生素能力的菌株 也有為了生長繁殖必須由外界供給維生素的菌株 酵母能合成幾乎全部的維生素霉菌有合成大部分維生素的能力超過 種以上的各種維生素不但化學(xué)性質(zhì)完全不同而且在生物合成途徑上也看不出它們的聯(lián)系 到目前為止 大部分維生素的生物合成途徑還沒有完全研究清楚然而多數(shù)已能用化學(xué)的方法進(jìn)行合成利用微生物進(jìn)行維生素工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn) 是能夠比較容易選擇性地得到化學(xué)合成有困

13、難的物質(zhì) 或一種有異構(gòu)體的化合物 至于維生素生產(chǎn)采用化學(xué)法還是微生物法則應(yīng)根據(jù)各種具體情況而定微生物能產(chǎn)生大量維生素的例子有用三孢布拉霉（）好食脈孢菌（ sp.）等生產(chǎn)胡蘿卜素（原維生素 ）用阿舒假囊酵母（）棉阿舒囊霉（）等生產(chǎn)維生素 用鏈霉菌諾卡氏菌丙酸菌（Propionibacterium）等生產(chǎn)維生素用濮膜青霉等生產(chǎn)葉酸用特異青霉生產(chǎn) 阿拉伯糖型抗壞血酸（異維生素 ） 用啤酒酵母 青霉等生產(chǎn)麥角甾醇（原維生素 ）等 現(xiàn)時工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的有維生素 胡蘿卜素 麥角甾醇 部分工藝是微生物發(fā)酵的有維生素 維生素 概述 年 以和 發(fā)現(xiàn)用肝臟抽提物可以治療人類惡性貧血病 這一發(fā)現(xiàn)使他們獲得了 年諾貝爾

14、醫(yī)學(xué)獎 年 和 從肝臟提取物中分離出結(jié)晶維生素 維生素 又稱（氰鈷胺素） 族維生素之一 是一種由微生物合成 動物必需的維生素它主要存在于動物性食品如內(nèi)臟肝腎和豬心等瘦肉魚牛乳以及蛋黃也存在維生素 植物中不含維生素 放線菌人和動物的腸道菌能合成維生素 動物所需的 主要靠從食物中攝取 或吸收腸道微生物產(chǎn)生的 但是人類只能從食物中獲得 因為人體腸道微生物合成的1異維生素 等河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文 不能被人體吸收由于動物組織中 含量很低沒有商業(yè)性生產(chǎn)價值化學(xué)合成也不可能因為 結(jié)構(gòu)復(fù)雜 合成 需要 步反應(yīng) 第一次大批量獲得 是從生產(chǎn)抗菌素如鏈霉素氯霉素新霉素等發(fā)酵液中分離得到的一種副產(chǎn)品其含量約隨著對

15、 需求的增加 選育出了 的高產(chǎn)菌株 目前工業(yè)化生產(chǎn) 已 全 部 采 用 發(fā) 酵 工 藝世 界 上 維 生 素 的 重 要 制 造 商 有意大利 英國的 美國的 公司和法國的 公司等維生素 作為一種人體和動物必需的維生素其獨(dú)特的功能性及其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生條件決定了其較為苛刻的生產(chǎn)條件 正是這種不易獲得性使其價格非常昂貴多年來人們一直在嘗試通過化學(xué)合成的途徑來降低維生素 的成本但由于其龐大而復(fù)雜的結(jié)構(gòu) 雖在近些年已獲得成功 但同時使化學(xué)家們陷入了新的困境 副產(chǎn)物太多 難以提純 于是 人們又重新審視維生素 的生產(chǎn)方法再次將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向發(fā)酵法生產(chǎn)能產(chǎn)生維生素 的菌種較多但由于其作為次級代謝產(chǎn)物 始終在發(fā)酵

16、水平?jīng)]有新的突破 在國內(nèi) 僅近年才出現(xiàn)了兩個生產(chǎn)廠家 但其年產(chǎn)量與龐大的國內(nèi)需求市場相比微不足道 因此 在國內(nèi)實現(xiàn)維生素 的低成本化將會有巨大的市場潛力維生素 的結(jié)構(gòu)維生素 是自然界中存在的結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的小分子化合物之一 它是含三價鈷的多環(huán)系化合物 基本結(jié)構(gòu)是鈷啉 由四個四氫吡咯環(huán)組成 它與卟啉環(huán)的區(qū)別在于 環(huán)和 環(huán)之間缺少一個甲川橋 經(jīng)驗式為 其結(jié)構(gòu)式經(jīng)多次修正 從結(jié)構(gòu)式中可以看出 鈷胺酰胺上的核糖 位上連接一個異環(huán)基團(tuán) 二甲基苯并咪唑 該基團(tuán)上另外一個氮原子又與鈷形成配位鍵 含有其它異環(huán)基團(tuán)的 類似物（用嘌呤或苯并咪唑替代 二甲基苯并咪唑）可由微生物轉(zhuǎn)化或在培養(yǎng)基中添加這些物質(zhì)產(chǎn)生 與 二

17、甲基苯并咪唑相比其他取代基團(tuán)取代后形成的 衍生物 在脊推動物體內(nèi) 生理作用較低 嘌呤堿基取代的 衍生物在人體內(nèi)無效2第 1 章 文獻(xiàn)綜述圖 維生素 的結(jié)構(gòu)圖維生素 的物理和化學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用維生素 為深紅色吸水的針狀結(jié)晶或結(jié)晶粉末 無一定的熔點(diǎn) 于 時變暗 在 分解 無臭無味 溶于水 乙醇和甲醇及酚 不溶于氯仿 丙酮和乙醚 結(jié)構(gòu)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定 水溶性為中性 具有左旋光性 在中性溶液中耐熱酸堿日光氧化劑和還原劑均能使其破壞維生素 水 穩(wěn)定性維生素 在中性或微弱酸性溶液中均穩(wěn)定但在 或 中 完全失效水溶液 時最穩(wěn)定，鈷胺素去掉氰基 換以 脫氧腺嘌呤核苷基 就成為維生素 輔酶 化學(xué)名稱為 脫氧腺嘌呤核苷

18、鈷胺素維生素 是人類及其他一些動物維持生長和生血最重要的一種維生素3它溶液在波長 和 處有最大吸收 分別為 河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文是造血過程中的生物催化劑 能促進(jìn)血液中有形物質(zhì)的成熟 用于治療惡性貧血和其他巨細(xì)胞型貧血 具有趨脂性作用 防止脂肪在肝中的沉積 有機(jī)體在受到射線的作用后 能恢復(fù)造血功能自然界中的維生素 有五種左右的類似物主要是分子中與 連接的基團(tuán)不同 分別為 和 它們具有相同的生理活性維生素 以輔酶形式參與各種代謝過程促進(jìn)甲基的形成和轉(zhuǎn)移 參與某些化合物的異構(gòu)化作用 維持 基的還原狀態(tài) 促進(jìn) 和蛋白質(zhì)的合成 促進(jìn)細(xì)胞的成熟維持神經(jīng)組織的正常功能缺乏維生素 時會發(fā)生惡性貧血 神經(jīng)系

19、統(tǒng)的損害等 臨床上可用于治療惡性貧血 肝臟疾病神經(jīng)炎神經(jīng)痛等在飼料工業(yè)上也可用于促進(jìn)豬雞等牲畜的生長維生素 的產(chǎn)生菌維生素 雖然廣泛的存在于自然界 但是自然界維生素 唯一來源出于微生物的合成 高等植物和動物組織對此維生素的合成 至今尚未得到令人信服的證實許多微生物在不同的培養(yǎng)基中都能合成維生素 產(chǎn)生維生素 的主要為放線菌和細(xì)菌放線菌中鏈霉菌屬的主要有Albidoflavus Antibioticus Aureofaciens Colombiensis Griseus Olivaceus Roseochromogenus 細(xì)菌主要包括有 Aerobacter aerogensBacillus m

20、egatherium B.subtilis Clostridium butyricum Cl. Cochhlearium Cl.flabelliferumCl.tetaromorphumum Escherichia coli the Flavobacerium species acetylicum acidificum aqu atilearborescensdevoranL.caseiPropionibacterium freudenreichii 等 另外米根霉的一些種也可合成維生素 維生素 的生物合成及其相關(guān)調(diào)控基因維生素 生物合成是自然界中最復(fù)雜的生物合成之一 約需 步酶促反應(yīng)通常有兩

21、種合成維生素 的路徑 一條路徑需要氧分子作為環(huán)收縮的前提故稱好氧路徑 另一個路徑可以在缺乏氧分子的條件下 利用鈷離子進(jìn)行環(huán)收縮稱為厭氧路徑現(xiàn)已確定了好氧路徑的各個中間產(chǎn)物并從反硝化假單胞菌分離出所需酶的編碼基因厭氧路徑涉及維生素 合成酶的編碼基因也已經(jīng)從鼠傷寒沙門氏菌 巨大芽孢桿菌中分離并測序薛氏丙酸菌4第 1 章 文獻(xiàn)綜述兩條路徑的差異除了體現(xiàn)在鈷離子插入的時間和對氧分子的需求不同外 在基因上也有區(qū)別 反硝化假單胞菌有 個基因 在鼠傷寒沙門氏菌中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的基因 而鼠傷寒沙門氏菌中的 個基因在反硝化假單胞菌中也沒有對應(yīng)的基因基因編碼的是一個單體加氧酶需要 作為輔助因子所以 可作為好氧路徑中的

22、一個標(biāo)志基因 而 可能作為厭氧路徑的標(biāo)志基因 在大多數(shù)產(chǎn)鈷氨素的厭氧生物中未發(fā)現(xiàn)一般來說 好氧路徑的基因前綴為 而相應(yīng)的厭氧路徑基因為 其后的字母代表該基因在操縱子中的順序甘氨酸琥珀酰 CoA-氨基乙酰丙酸尿卟啉原CH3 基卟吩膽汁烷糞甾原Co2+1-氨基-2-丙醇原卟啉Mg2+NH35-脫氨腺苷鈷啉醇酰胺血紅素葉綠素5-脫氨腺苷鈷啉醇酰胺GTP5-脫氧腺苷鈷啉醇酰胺鳥苷二磷酸血紅蛋白5 6-二甲基苯并咪唑核黃素-核唑-5-P5-脫氨腺苷鈷胺素磷酸5-脫氧腺苷鈷胺素(B12)圖 維生素 的合成維生素 B12 好氧與厭氧生物合成路徑5河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文合成前咕啉 和鈷前咕啉步驟 由氨基乙酰

23、丙酸，形成膽色素原，在 脫水酶 也稱為 合成酶 的催化下 個 分子縮合形成 個 分子 基因編碼該酶 生物合成也有 條途徑 一種是在 合成酶催化下由琥珀酰輔酶 和甘氨酸縮合生成 另一途徑較為復(fù)雜 由谷氨酸的完整碳架形成 步驟 合成羥基甲基后膽色素原，由 基因編碼的 脫氨酶催化 個 分子脫氨并羧化形成線性的四吡咯步驟 合成尿卟啉原，尿卟啉原 合成酶由 基因編碼 催化 生成 的地位十分重要 除維生素 外 它還是生成血紅素 葉綠素 等的必要中間產(chǎn)物細(xì)菌葉綠素 鐵氫卟啉 步驟 在尿卟啉原 的 和 位置甲基化及厭氧路徑中的鈷螯合尿卟啉原 甲基轉(zhuǎn)移酶是維生素 生物合成的關(guān)鍵酶 催化將 腺苷蛋氨酸 上的 個甲

24、基轉(zhuǎn)移到尿卟啉原 上 第一個甲基轉(zhuǎn)移到 位置形成前咕啉 接著在 位置又進(jìn)行一次甲基化反應(yīng) 產(chǎn)生前咕啉 當(dāng)該酶的底物濃度大于 的時候顯示出底物抑制因此 在鈷氨素生物合在厭氧生物鼠傷寒沙門氏菌中 尿卟啉原 甲至此 好氧和厭氧路徑并沒有差別但厭氧路徑在形成前咕啉 后 隨即發(fā)生鈷螯合反應(yīng) 形成鈷前咕啉 這樣在厭氧路徑 鈷離子在一個相對較早的階段插入進(jìn)來 而好氧路徑 鈷在一個相對較晚的階段插入從這以后兩個路徑開始出現(xiàn)差異鼠傷寒沙門氏菌的 基因編碼蛋白由 個氨基酸組成 是一個多功能 可能也起鈷螯合酶的作用在該菌中又發(fā)現(xiàn)了另一個蛋白6需要 及 個獨(dú)立的酶參與在反硝化假單胞菌中 該酶由 基因編碼成過程中可能起

25、調(diào)控作用基轉(zhuǎn)移酶由 基因編碼性的酶 該蛋白 端 個氨基酸 具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性 而 末端（ ）具有鈷螯合酶的作用 等人第 1 章 文獻(xiàn)綜述從薛氏丙酸菌中分離的尿卟啉原 甲基轉(zhuǎn)移酶基因鈷螯合酶編碼區(qū) 而與反硝化假單胞菌的 基因更相似 故也稱為 基因相似 末端的 個氨基酸與 發(fā)現(xiàn)于 相似故該鈷螯合酶的編碼基因稱為 步驟 位置甲基化在好氧路徑 由 基因編碼的前咕啉甲基轉(zhuǎn)移酶在前咕啉 的 位置催化甲基化反應(yīng)生 成 前 咕 啉 也 稱 前 咕 啉 在厭氧路徑 該甲基化反應(yīng)由 催化 將鈷前咕啉轉(zhuǎn)化成鈷前咕啉 該酶的反應(yīng)活性要比 至少小 倍合成前咕啉和鈷前咕啉環(huán)收縮可能兩條路徑間最大的差異就在于環(huán)收縮的機(jī)制不

26、同 在好氧路徑 需要兩步反應(yīng)和不同的兩個酶將前咕啉 轉(zhuǎn)化成前咕啉而在厭氧路徑將鈷前咕啉 轉(zhuǎn)化成鈷前咕啉僅需 個酶步驟 前咕啉 的氧化作用和內(nèi)酯的形成在好氧路徑 催化在前咕啉 的 位結(jié)合 發(fā)生羧化作用 先生成內(nèi)酯隨后形成前咕啉 羥基內(nèi)酯 也稱為前咕啉或前咕啉 由于厭氧生物不需要 故沒有相應(yīng)的步驟因此 可作為好氧路徑的一個標(biāo)志性基因步驟 位置甲基化及環(huán)收縮在好氧路徑中由 基因編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶引入第四個甲基即在前咕啉 的 位發(fā)生甲基化作用形成前咕啉該反應(yīng)依賴 如果缺少用則反應(yīng)不能進(jìn)行環(huán)收縮由此次甲基化作用所引發(fā) 并不需要任何酶的作在厭氧生物鼠傷寒沙門氏菌中 該步反應(yīng)與好氧路徑基本相似 催化在鈷前咕啉

27、 位甲基化形成鈷前咕啉環(huán)收縮也是由此次甲基化而引發(fā)在薛氏丙酸菌中由一個整合的基因 催化完成該步反應(yīng)而在鼠傷寒沙門氏菌中 分別是 個獨(dú)立的基因合成前咕啉 和前咕啉鈷前咕啉 和鈷前咕啉7由于不具有 的薛氏丙酸菌的鈷螯合酶共含有 個氨基酸 其 末端的 個氨基酸與 河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文步驟 在 發(fā)生甲基化反應(yīng)合成前咕啉 和鈷前咕啉在好氧路徑 前咕啉 甲基轉(zhuǎn)移酶 由 基因編碼催化在 位發(fā)生甲基化反應(yīng) 產(chǎn)生前咕啉 該反應(yīng)需要 移酶由 編碼-7在厭氧路徑 相應(yīng)的甲基轉(zhuǎn)步驟 在 發(fā)生甲基化反應(yīng)合成前咕啉和鈷前咕啉在好氧路徑 由 基因編碼的前咕啉 甲基轉(zhuǎn)移酶是一個雙功能酶 它既催化前咕啉 的脫酰反應(yīng)也在隨后

28、依賴 的 位甲基化反應(yīng)中起催化作用生成前咕啉在厭氧路徑由鈷前咕啉 向鈷前咕啉 的轉(zhuǎn)化與好氧路徑有所差異該過程需要打開內(nèi)酯環(huán)脫醛及 位甲基等三個步驟目前催化這一過程的酶尚未發(fā)現(xiàn)令人奇怪的是在好氧生物反硝化假單胞菌中由 負(fù)責(zé)這一過程 而在鼠傷寒沙門氏菌中卻缺少相應(yīng)的酶 這暗示了在厭氧生物 一定存在一個前面已確定的甲基轉(zhuǎn)移酶 也許是 或 在 位甲基化反應(yīng)前咕啉鈷前咕啉 形成氫巴啉酸鈷巴啉酸步驟 還原前咕啉鈷前咕啉 產(chǎn)生雙氫產(chǎn)物由 基因編碼的前咕啉 還原酶催化前咕啉 的還原反應(yīng) 產(chǎn)生雙氫前咕啉也稱前咕啉該反應(yīng)依賴 的存在 在厭氧路徑 相應(yīng)的還原酶是由 基因編碼 但其作用機(jī)制尚不清楚步驟 位置發(fā)生甲基化

29、和脫羧反應(yīng)形成前咕啉 鈷前咕啉這一過程的 個反應(yīng)由一個多功能的酶前咕啉 合成酶所催化 反應(yīng)同時進(jìn)行該酶 基因編碼不僅催化 位置上的兩次甲基化反應(yīng) 依賴 而且還在 位的醋酸根脫羧反應(yīng)中起催化作用 形成前咕啉由于前咕啉 合成酶的氨基末端與其他甲基轉(zhuǎn)移酶具有同源性所以可能羧基末端也具有脫羧酶的活性 在缺少 的情況下 則不發(fā)生脫羧反應(yīng) 這暗示了在脫羧反應(yīng)以前 該酶就已經(jīng)結(jié)合上 或者至少發(fā)生過 次甲基化反應(yīng)8又發(fā)揮一次作用第 1 章 文獻(xiàn)綜述就目前已知的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)來看 在大多數(shù)厭氧生物中 催化這一反應(yīng)的酶并不是單個的蛋白 而是分別由 個獨(dú)立的酶來完成 例如 負(fù)責(zé) 位的甲基化 負(fù)責(zé) 位的脫羧反應(yīng) 步驟 位

30、甲基轉(zhuǎn)移到 位產(chǎn)生氫巴啉酸 鈷巴啉酸前咕啉 變旋酶或稱 合成酶由 基因編碼催化 位的甲編碼的酶催化鈷前咕啉 甲基重排形成鈷巴啉酸在厭氧路徑中 由 基因由氫巴啉酸 鈷巴啉酸形成鈷巴啉酸 二酰胺步驟 合成氫巴啉酸二酰胺，鈷巴啉酸二酰胺（），及鈷螯合好氧與厭氧路徑之間的另一個差異在于鈷巴啉酸二酰胺的合成 在厭氧生物中該步驟較為簡單 催化鈷巴啉酸發(fā)生酰胺化作用形成鈷巴啉酸二酰 基因編碼的 雙酰胺合成酶催化產(chǎn)生 二酰胺 接著在鈷巴啉酸二酰胺合成酶的作用下 將鈷離子螯合到大環(huán)上 該酶至少包含 個亞基分別由 基因編碼其中 起主要的作用至此好氧和厭氧路徑便匯合以后的步驟完全相同步驟 還原鈷 巴啉酸二酰胺生成鈷

31、 巴啉酸二酰胺 （），催化這一過程的酶及其基因在 條路徑中均未發(fā)現(xiàn)步驟 鈷巴啉酸 二酰胺發(fā)生腺苷化反應(yīng)在鈷 巴啉酸 二酰胺腺苷轉(zhuǎn)移酶的催化下形成腺苷鈷 巴啉酸，二酰胺 （），該酶在反硝化假單胞菌中在鼠傷寒沙門氏菌中由 基因 不同于前面提到的甲基轉(zhuǎn)移酶 編碼在薛氏丙酸菌中由 基因控制步驟 位置的羧基發(fā)生酰胺化反應(yīng)由腺苷鈷巴啉酸合成酶作用在 位置的羧基發(fā)生腺苷化反應(yīng)產(chǎn)生腺苷鈷巴啉酸見圖 底物中需要有腺苷基團(tuán)在9基向 位遷移 產(chǎn)生 該酶受產(chǎn)物抑制胺 但在好氧路徑中 這一過程較為復(fù)雜 先在 和谷氨酰胺存在下 由由 基因編碼河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文好氧生物中 由 基因編碼該反應(yīng)所需的酶 在厭氧生物中相應(yīng)

32、的是 基因步 驟 在 腺 苷 鈷 巴 啉 酸 上 連 接 氨 基 丙 醇該反應(yīng)所需的酶由 個蛋白和組成基丙醇發(fā)揮作用生成腺苷咕啉醇酰胺 現(xiàn)已知 和 基因編碼蛋白蛋白的編碼基因尚未發(fā)現(xiàn)在厭氧生物 由 基步 驟 將 腺 苷 咕 啉 醇 酰 胺 轉(zhuǎn) 化 為 腺 苷 咕 啉 醇 酰 胺該過程需兩步反應(yīng)但由一個雙功能酶咕啉醇酰胺激酶 基因編碼催化前一個反應(yīng)是依賴 的磷酸化反應(yīng)后面的反應(yīng)是 形成 步反應(yīng)分別形成磷酸腺苷咕啉醇酰胺和腺苷咕啉醇酰胺 既在第二個反應(yīng)中作底物 又在第一個反應(yīng)中作為調(diào)控因子增加與底物腺苷咕啉醇酰胺的親和力在鼠傷寒沙門氏菌中相應(yīng)的酶步驟 將腺苷咕啉醇酰胺轉(zhuǎn)化為腺苷鈷氨素 此步驟是形成

33、鈷氨素的最后一步即核唑或磷酸核唑取代腺苷咕啉醇酰胺上的 最終生成腺苷鈷氨素該反應(yīng)所需的酶為鈷氨素合成酶在好氧路徑由 編碼 厭氧路徑中相對應(yīng)的酶為 的基因產(chǎn)物反應(yīng)中所需的磷酸核唑來自二甲基苯并咪唑和煙酸單核苷酸在反硝化假單胞菌中 基因編碼的酶催化這一反應(yīng) 在鼠傷寒沙門氏菌中相應(yīng)的酶在薛氏丙酸菌的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中 通過添加二甲基苯并咪唑來促進(jìn)丙酸菌合成維生素 以上即是腺苷鈷氨素好氧與厭氧生物合成的完整路徑最后用氰化物取代腺苷鈷氨素的腺苷基團(tuán)便轉(zhuǎn)化為維生素 即氰鈷氨素關(guān)于這 條維生素 生物合成路徑的分子水平進(jìn)化方面 比較容易接受的觀點(diǎn)是厭氧途徑是更為原始的維生素 生物合成路徑兩個路徑所需的甲基轉(zhuǎn)移酶是

34、高度相似的這不能簡單地解釋為它們在 億年前 隨著光合作用的10并且依賴 及 氨因編碼的酶催化該過程由 基因編碼由 基因編碼第 1 章 文獻(xiàn)綜述開始 大氣中氧氣量隨之增加而產(chǎn)生 如果事實是這樣的話 那就不能解釋厭氧途徑如何在已 牢記 含鈷底物的酶的作用下 而突然轉(zhuǎn)變成能利用氧分子和一套新的中間產(chǎn)物 這與達(dá)爾文通過自然選擇和變異的進(jìn)化論并不相符 相反 這 條途徑一定是從一個更早的階段在光合作用出現(xiàn)之前開始分化的 很可能好氧途徑最初進(jìn)化是作為厭氧途徑的一種可替代的方式進(jìn)行的維生素 生物合成的代謝調(diào)控維生素 是微生物次級代謝的產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)在次級代謝產(chǎn)物的生物合成中有著重要的作用在維生素 的生物合成中

35、對維生素 代謝途徑的第一個酶 合成酶有反饋抑制作用 尿卟啉原對 脫水酶存在反饋抑制作用維生素 生物合成中的代謝調(diào)控如圖 微生物在正常生長條件下可以通過自我調(diào)節(jié)使機(jī)體內(nèi)的代謝途徑互相協(xié)調(diào)和平衡 但在人為控制下 可對代謝途徑進(jìn)行修飾 改造 使微生物過量產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物 大量提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量隨著對維生素 需求量的增加現(xiàn)有生產(chǎn)水平不能滿足需求要想大幅度提高維生素 的產(chǎn)量 對基因工程菌的研究勢在必行 要培育維生素 生產(chǎn)菌 就要了解其生物合成途徑 關(guān)鍵酶的反饋調(diào)控機(jī)制 考慮解除的方法 從而設(shè)計正確的育種方案 應(yīng)用 重組技術(shù) 克隆關(guān)鍵酶的基因并在工程菌中表達(dá)從而選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)易于自動化生產(chǎn)的基因工程菌除了

36、克隆維生素 生物合成的關(guān)鍵酶及其基因外還可對非維生素 合成的重要基因進(jìn)行調(diào)控研究 如我們知道薛氏丙酸菌的特性是在代謝過程中將葡萄糖分解成丙酸及其他產(chǎn)物 而丙酸抑制了菌體的生長 在丙酸產(chǎn)生過程中 甲基丙二酰 變位酶是一個關(guān)鍵酶 該酶由 個亞基組成 分別由 和 基因編碼 該酶量的降低可導(dǎo)致丙酸產(chǎn)量的下降基因組測序計劃也為深入研究維生素 生物合成的調(diào)控及進(jìn)化提供了可靠的信息資源 維生素 的生物合成給化學(xué)家和生物學(xué)家提出了一個巨大的挑戰(zhàn)目前 已揭示出許多令人感興趣的生理特性 毫無疑問 還將有更多的奧秘得到闡明11河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文圖 維生素 生物合成途徑的代謝調(diào)控維生素 的發(fā)酵生產(chǎn)抗生素廢液中提

37、取早在 年美國 等人就發(fā)現(xiàn) 當(dāng)用加有鈷化合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)灰色鏈霉菌時可大大提高維生素 在整個培養(yǎng)液中的濃度但是對于鈷化合物的濃度要求要適量 過高的濃度會對菌體細(xì)胞產(chǎn)生毒性 另有研究表明 添加適量的氰化合物也同樣可促進(jìn)抗生素廢液中 類似物的含量但需嚴(yán)格掌握其用量放線菌發(fā)酵自從人們發(fā)現(xiàn)可從抗生素廢液中提取得到維生素 后許多科學(xué)家將目光轉(zhuǎn)向了采用放線菌其中主要是鏈霉菌屬中的灰色鏈霉菌和橄欖色鏈霉菌（Streptomyces olivaceus）來發(fā)酵生產(chǎn)維生素 由于鏈霉素的生成而始終未能使得維生素 的產(chǎn)生處于主導(dǎo)地位因此我們應(yīng)選出鏈霉素發(fā)酵支路的關(guān)鍵酶并將其抑制這樣便可大大提高維生素 的得率 使得大

38、量產(chǎn)生維生素 下水道廢液中提取采用生物活性污泥法處理的廢水中通常含有多的 干的活性污泥可先用水浸提然后過濾掉固形顆粒之后可分離純化 由此得到的 有如下特點(diǎn) 無需前培養(yǎng) 這樣大大減少了前期投入 能耗大 尤其是濃縮這一關(guān)鍵性步驟將造成大的能量損耗 用此法得到的 的濃度雖并不低 但受活性污泥這一來源的影響由此獲得的 并不能直接進(jìn)入食品或藥品級產(chǎn)品而丙酸菌發(fā)酵12成為可能通常只局限于飼料添加劑第 1 章 文獻(xiàn)綜述能夠產(chǎn)生 的菌株較多如巨大芽孢桿菌 Bacillus megaterium橄欖色鏈霉菌Streptomyces olivaceus等產(chǎn)量較高的菌株主要來自傅氏丙酸桿菌Propionibacte

39、rium freudenreichii薛氏丙酸桿菌Propionibacteriumshermanii 和脫氮假單胞菌 Pseudomonas denirificans 丙酸菌 例如 Propionibacterium freudenreichii 和 Propionibacterium shermanii常用作 的產(chǎn)生菌 這類細(xì)菌常采用厭氧發(fā)酵 采用丙酸菌發(fā)酵的特點(diǎn) 在于培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中產(chǎn)生丙酸而使得培養(yǎng)基 下降 從而可避免雜菌的污染因為是厭氧發(fā)酵勿需設(shè)計供氧系統(tǒng)和攪拌系統(tǒng)可減少設(shè)備投入和節(jié)約能耗隨著發(fā)酵過程丙酸鈣的產(chǎn)生而丙酸鈣通常是用作防霉和防腐添加劑的 從而可進(jìn)一步減少染菌的可能性 研

40、究表明 可采用如下幾種方法來增加 的產(chǎn)量在培養(yǎng)基中添加 左右的 可成倍地增加 的產(chǎn)量 添加增稠劑 可增加 的產(chǎn)量 這是由于一方面細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中沒有任何干擾 從而增長細(xì)胞的生長速度 更為重要的是通常高濃度的鈷化合物對于菌體細(xì)胞本身是有害的 而在加入增稠劑后 丙酸菌對鈷化合物的耐受性增大 可達(dá) 這樣 既能避免對菌體的毒害 又可以最大限度地提高 的產(chǎn)量加入前體物質(zhì)已知的可促進(jìn) 產(chǎn)生的前體物質(zhì)有四種（）正丙烯二氨 （）苯并咪唑 （） 二甲基二氨基苯 （） 二甲基苯并咪唑 其中（）和（）可促進(jìn)真正 的生成 而（）和（）可增加 類似物的含量 當(dāng)以甘氨酸作為補(bǔ)充氮源時可增加其產(chǎn)量由巨大芽孢桿菌生產(chǎn) 以巨

41、大芽孢桿菌為例 將培養(yǎng)基用氨水調(diào)至 發(fā)酵液需要連續(xù)不停地攪拌和大量通氣 溫度需控制在 左右 每隔一定時間需用 的氨水來調(diào) 同時需定期補(bǔ)充碳氮源以期達(dá)到最高產(chǎn)量采用轉(zhuǎn)基因的 發(fā)酵生產(chǎn)目前人們對于 的控制基因已經(jīng)非常清楚因此這就使得將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌以期大量生產(chǎn)但該方法真正用于大生產(chǎn)還有待時日即使用于生產(chǎn)也會不可避免地存在這樣的問題 如導(dǎo)入的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地遺傳下去 會隨發(fā)酵條件的變化而脫落以及 產(chǎn)生腸毒素素 的生產(chǎn)仍需按傳統(tǒng)發(fā)酵來完成-4內(nèi)毒素等因此就近些年維生13河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文原生質(zhì)體融合菌株的生產(chǎn)研究應(yīng)用現(xiàn)代遺傳工程技術(shù) 能大大提高 的產(chǎn)量 將 Protaminobacter rube

42、r和 Rhodopsendomonas spheroides 兩個菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合 得到一株融合菌Rhodopseudomonas protamicus 能利用葡萄糖做碳源 不需要添加 二甲基苯并咪唑 的產(chǎn)量可大達(dá) 維生素 的測定方法比色測定法本法是藥物樣品中維生素 測定的常用方法其原理是樣品經(jīng)濃硫酸和高氯酸鉀消化后樣液中的鈷與 二（吡啶酮）吡啶聯(lián)腙生成鈷的紅色化合物可以進(jìn)行比色測定再從鈷的含量換算成維生素 的含量離子交換測定法藥物中的維生素 可以從弱酸性陽離子交換樹脂中得到 分離洗脫下來例如 桔子醬中的維生素 通過 土為吸咐劑進(jìn)行層析分離后 在 波長處測定其含量 原子吸收法維生素 的分子

43、中含有鈷原子占維生素 的 采用原子吸收分光光度法可以測定其中的鈷含量再換算成維生素 含量在測定藥品中維生素 時 可以直接將藥品的溶液吸入原子分光光度計中測定 但用于測定食品中的維生素 時 先將樣品預(yù)先處理 樣品用提取劑提取 于濾液中加入 用 調(diào)節(jié)至 再加入 活性炭振搖用無灰濾紙過濾維生素 被吸附在活性炭上將活性炭連同濾紙一起在 下灰化完全用 的硝酸將殘渣溶解 然后用原子吸收分光光度法測定鈷的含量 本法與微生物法結(jié)果一致微生物法微生物法原理同微生物學(xué)濁度法試驗菌種采用乳酸酐菌（）靈敏度高效液相色譜法（）14第 1 章 文獻(xiàn)綜述維生素 發(fā)酵生產(chǎn)面臨的問題及今后的發(fā)展方向（）搞好維生素 發(fā)酵菌株的選

44、育工作 同時可借助于紫外線誘變 原生質(zhì)體融合等生物技術(shù)工程手段提高單株的產(chǎn)量（）進(jìn)行高密度培養(yǎng)首先增加生物量 以期提高單位發(fā)酵效率（）由于目前關(guān)于維生素 的代謝途徑和基因表達(dá)序列已基本研究清楚 因此 可采用基因工程手段 使該基因片段能在宿主細(xì)胞中多次表達(dá) 并使其能穩(wěn)定遺傳將會是維生素 發(fā)酵的一大革命（）研制新型的誘導(dǎo)劑以進(jìn)一步提高其產(chǎn)量 （）研制高效專用的生物反應(yīng)器采用連續(xù)流加培養(yǎng)（）采用固定化技術(shù)將菌種包埋或吸附于載體上 實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)（）近 年來 國外開展了大量的利用各種醇類和烴類化合物作為碳源生產(chǎn) 的菌種篩選工作并獲得了大量能產(chǎn)生 的菌株 但烴類和高級醇作為碳源發(fā)酵收率較低 采用甲醇作為

45、碳源似乎具有較好的前景 例如 篩選到一株甲烷八疊茵甲醇基質(zhì)濃度為 采用流加工藝發(fā)酵 的發(fā)酵濃度可達(dá) 本研究的目的及意義本實驗從實際角度出發(fā)與生產(chǎn)緊密聯(lián)系對影響維生素 發(fā)酵的各種因素和操作做了研究 并對廠家提出的一些生產(chǎn)上的問題進(jìn)行了初步研究 以期為廠家進(jìn)行生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供一些參考15河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文第章碳源對發(fā)酵的影響材料菌種薛氏丙酸桿菌主要試劑Propionibacterium shermanii試劑 甲液溶解結(jié)晶酚于 中并稀釋至在此溶液中加入亞硫酸氫鈉 乙液 稱取酒石酸鉀鈉 加到中 再加入 二硝基水楊酸溶液 將甲液與乙液相混合即得黃色試劑貯于棕色瓶中在室溫下放置天以后使用 標(biāo)準(zhǔn)液

46、 準(zhǔn)確稱取分析純的 預(yù)先在量蒸餾水溶解后定容至實驗器材培養(yǎng)箱（日本公司）UV 2000型紫外分光光度計日本HITACHI公司培養(yǎng)基干燥至恒重用少穿刺培養(yǎng)基母瓶培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基略略略以上培養(yǎng)基的滅菌條件均為研究方法正交實驗原理正交試驗法也叫正交試驗設(shè)計法 它是用“正交表”來安排和分析多因素問題試驗的一種數(shù)理統(tǒng)計方法這種方法的優(yōu)點(diǎn)是試驗次數(shù)少效果好方法簡單使用方便 效率高 因此 正交試驗法在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和其它科學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用 并取得顯著的效果 在研究比較復(fù)雜的問題中 往往都包含著多種因素 我們把準(zhǔn)備在試驗中考察的有關(guān)影響試驗指標(biāo)的條件稱為因素 把在試驗16冰箱保存?zhèn)溆玫?2 章 碳源對

47、VB12發(fā)酵的影響中準(zhǔn)備考察的各種因素的不同狀態(tài)稱為水平（或位級） 而且這些因素與各種水平是互相交織在一起的 為了尋求最優(yōu)化的生產(chǎn)條件 就必須對各種因案以及各種因素的不同狀態(tài)進(jìn)行試驗方法這就是多因素的試驗問題選用因素水平的正交表分別選取碳源氮源和一種無機(jī)鹽 三種因素的三個不同水平進(jìn)行正交實驗 對于選取個水平 選取個水平 選取個水平 對結(jié)果進(jìn)行直觀分析確定各因素對發(fā)酵的影響程度不同碳源種類對發(fā)酵的影響用不同種類的碳源替換原有發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源 研究薛氏丙酸桿菌對不同生物量的測定母瓶中生物量的測定將穿刺培養(yǎng)基中的菌體用生理鹽水充分洗出 接種于母瓶培養(yǎng)基中 以不接發(fā)酵瓶中生物量的測定將母瓶中的菌體接

48、種于發(fā)酵培養(yǎng)基中以不接種菌體的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照每隔四個小時取樣稀釋倍于下測定發(fā)酵過程中濃度的測定原理試劑是由 二硝基水楊酸 氫氧化鈉 酒石酸鉀鈉 苯酚和亞硫酸氫鈉加蒸餾水配制而成 方法適于堿性條件 與還原糖共熱后發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成了氨基硝基水揚(yáng)酸棕紅色的氨基化合物 在一定的范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成比例關(guān)系利用比色法可測知樣品的含糖量與還原糖進(jìn)行反應(yīng)并顯色 顯色煮沸時間對還原糖的測定有很大影響顯色時間在內(nèi)顯色液的吸光度隨顯色時間的延長而增加 之后 吸光度隨時間變化不大 尤其在之后 顯色后的吸光度已基本趨于穩(wěn)定 所以 一17（ ）碳源的利用情況種菌體的母瓶培養(yǎng)基為對照 每隔四個小時

49、取樣 稀釋倍 于下測定河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文般取與反應(yīng)的顯色時間為標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取支試管分別按下表順序加入各種試劑空白溶液蒸餾水 試劑 加熱冷卻 均在沸水浴中加熱分鐘立即用流動冷水冷卻蒸餾水 光密度 將上述各管溶液混勻后在進(jìn)行比色測定用空白管調(diào)零點(diǎn)記錄光密度值以濃度為橫坐標(biāo)光密度值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法用取液器取發(fā)酵液置于離心管中 離心分鐘去除菌體及雜質(zhì)取上清液稀釋倍然后再取上清稀釋液置于刻度試管中加入蒸餾水試劑 混勻在沸水浴中充分加熱分鐘立即用流動水冷卻 然后再加入蒸餾水定容至 小時內(nèi) 在波長下比色測定光吸收值對照標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的的含量 按下述公式計算出的百分含量每個樣品重復(fù)測定

50、次取平均值含量（毫克數(shù)樣品稀釋倍數(shù)）樣品體積搖瓶補(bǔ)料方法盛取溶于水中的溶液加于搖瓶中滅菌分鐘 備用補(bǔ)料時用移液管吸取一定量發(fā)酵液中含量的測定化學(xué)法粗略測定發(fā)酵液中含量高效液相色譜法測定發(fā)酵液中含量18第 2 章 碳源對 VB12發(fā)酵的影響結(jié)果與討論正交實驗結(jié)果及分析因素A-碳源 %B-氮源 %C-無機(jī)鹽%水平1236%5%4%4%3.5%3%0.5%0.4%0.3%表正交試驗設(shè)計及實驗結(jié)果因素水平處理號1A2B3C結(jié)果1234567891112223335%5%5%4%4%4%3%3%3%1231231234%3.5%3%4%3.5%3%4%3.5%3%1232313120.5%0.4%0.3

51、%0.4%0.3%0.5%0.3%0.5%0.4%0.2180.2070.1470.1570.1370.1130.1250.1370.1070.1930.2040.1580.1560.1460.1180.1310.1310.107K1K2K3R11278287383899809637382429109388459319表正交試驗因素水平表（ ）河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文正交試驗結(jié)果直觀分析圖（）圖對發(fā)酵的影響（）圖對發(fā)酵的影響（）圖對發(fā)酵的影響20酵 單 位 （）發(fā)酵 單 位 （）發(fā)發(fā) 酵單位（）第 2 章 碳源對 VB12發(fā)酵的影響碳源對產(chǎn)生菌生物量和發(fā)酵單位的影響本實驗考察了工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中常用

52、的碳源對產(chǎn)生的影響 每種碳源分別選取三個濃度梯度（）實驗結(jié)果表明對于菌株生長以及合成的最佳碳源為 該菌株在其它碳源的三種濃度梯度的培養(yǎng)基中有的生長緩慢有的生長停滯有的甚至發(fā)生自溶初始濃度對產(chǎn)生菌生物量和發(fā)酵單位的影響在確定為最佳碳源后 進(jìn)而確定初始濃度的合適添加量 從正交表可以看出在不流加的情況下在的初始濃度范圍內(nèi)的發(fā)酵單位隨初始濃度的上升而增加實驗研究了初始濃度對發(fā)酵的影響選取 六個不同的初始濃度研究對菌體生物量以及發(fā)酵單位的影響初始濃度對發(fā)酵生物量的影響1 的 初 始 濃 度（）圖不同初始濃度對發(fā)酵生物量的影響初始濃度對發(fā)酵單位的影響21菌體密度（）河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文1的不同初始濃度

53、 （）圖不同濃度對發(fā)酵單位的影響結(jié)果表明初始濃度并不是越高越好 我們在 的初始濃度的條件下進(jìn)行實驗時 觀察到的濃度與的濃度在菌體的生物量上相差不大 但是在初始濃度為時 的發(fā)酵單位要比時的高 菌體在初始濃度為時生長緩慢菌體生物量和發(fā)酵單位都迅速下降在更高的初始濃度下生長停滯 甚至出現(xiàn)自溶 因此濃度在以上是不適合菌體生長及合成的 補(bǔ)料操作對發(fā)酵的影響補(bǔ)料的作用和依據(jù)補(bǔ)料是在發(fā)酵過程中補(bǔ)充某些養(yǎng)料以維持菌的生理代謝活動和合成的需要補(bǔ)料的內(nèi)容有補(bǔ)充微生物能源和碳源 補(bǔ)充菌體所需的氮源 補(bǔ)充某些微生物生長或合成需要的微量元素或無機(jī)鹽等等 補(bǔ)料的原則就在于控制微生物的中間代謝 使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向

54、發(fā)展 為此 要根據(jù)菌體的生長代謝 生物合成規(guī)律 利用中間補(bǔ)料的措施給于生產(chǎn)菌適當(dāng)?shù)恼{(diào)控 鑒于我們對微生物的代謝規(guī)律尚未充分掌握 現(xiàn)有的各種補(bǔ)料措施都是根據(jù)實驗方法確定的 補(bǔ)料的時機(jī)也不能單純以培養(yǎng)時間作為根據(jù) 還要根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源種類 用量和消耗速度 前期發(fā)酵條件 菌種特性和種子質(zhì)量等因素判斷 因此 根據(jù)代謝變化如殘?zhí)呛恐祷蚓z形態(tài)來考慮比較切合實際標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在沸水中加熱反應(yīng)冷卻后定容至在22下測定溶液的酵 單 位 （）發(fā)第 2 章 碳源對 VB12發(fā)酵的影響值用作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性方程為（）圖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 （：濃度 吸光度值）在每次實驗測定發(fā)酵過程中的消耗曲線時

55、 重新繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以使得結(jié)果保持一致不同初始濃度的條件下發(fā)酵過程中殘曲線及生長曲線的測定初始濃度為時的消耗曲線和菌體的生長曲線 時 間（）圖濃度和生物量隨時間的變化初始濃度為時的消耗曲線和菌體的生長曲線23（）菌體密度（）（）河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文 時 間（）圖濃度和生物量隨時間的變化初始濃度為時的消耗曲線和菌體的生長曲線60.85432100.70.60.50.40.30.20 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 01 1 01 2 0時 間（）圖濃度和生物量隨時間的變化從圖 圖 圖可以看出隨著初始濃度的降低 代謝終點(diǎn)到來的時間也隨之提前 在

56、圖中代謝的終點(diǎn)約在小時左右 在圖中的代謝終點(diǎn)約在小時左右而對于圖代謝的終點(diǎn)在小時左右并且隨著代謝終點(diǎn)的到來 菌體都停止了生長 進(jìn)入了穩(wěn)定期 并隨著培養(yǎng)時間的延長出現(xiàn)了自溶 測定了在發(fā)酵過程中的代謝規(guī)律 這就為確定補(bǔ)料的時間和補(bǔ)加的量值提供了依據(jù)初始濃度為時菌體的生長曲線24（）菌體密度（）菌體密度（）（）第 2 章 碳源對 VB12發(fā)酵的影響 時 間（）圖不同初始濃度對生長的影響從圖可以看出 雖然在初始濃度為的條件下 最終的菌體生物量以及的發(fā)酵單位相對較高代謝終點(diǎn)到來的時間比較晚 但在初始濃度為的條件下菌體生長并不處于最佳狀態(tài)從上圖可以看出產(chǎn)生菌的最大比生長速率隨起始質(zhì)量濃度的增加而降低 在初

57、始濃度為的情況下 菌體的對數(shù)生長期相對其他的兩個濃度要晚一些即菌體生長的遲緩期時間相對較長對于維生素的發(fā)酵來講由于是胞內(nèi)產(chǎn)物因此要提高維生素的產(chǎn)量首先必須保證菌體能夠達(dá)到一定的生物量 如果在前期能夠使菌體的生長速率加快 使得菌體生長的遲緩期縮短在生產(chǎn)中無疑是有益的因此可采取使初始的濃度降低而在后期進(jìn)行補(bǔ)料的方式維持菌體的生物量和的發(fā)酵單位接種量對生長曲線和代謝的影響選擇 個接種量 考察對的影響 其中為原始接種量 接種量增大 菌體的停滯期縮短 使菌體迅速的處于快速繁殖的對數(shù)期 的發(fā)酵單位隨接種量的增加有所提高 提高幅度以增加到為最大 因此以下選擇作為接種量25菌體密度（）河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文

58、0.850.800.750.700.650.600.550.500.450.400.350.300.250.200.1517%12%0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120時間 ）圖不同接種量對菌體生長的影響從圖可以看出 增大接種量有利于初期菌體的生長和繁殖 能夠使菌體較早的進(jìn)入對數(shù)生長期 從而對生產(chǎn)較為有利 因而 我們進(jìn)一步測定了接種量增大至后發(fā)酵過程中在不同初始濃度下的代謝曲線 初始濃度為時的消耗曲線和菌體的生長曲線 時 間（）圖濃度和生物量隨時間的變化初始濃度為時的消耗曲線和菌體的生長曲線26菌體密度菌體密度（）（）第 2 章 碳源對 VB12發(fā)酵的影

59、響 時 間（）圖濃度和生物量隨時間的變化初始濃度為時的消耗曲線和菌體的生長曲線 時 間（）圖濃度和生物量隨時間的變化初始濃度為接種量為時菌體的生長曲線 時間（）圖不同初始濃度對生長的影響27（）菌體密度（）菌體密度（）菌體密度（）（）河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文接種量增大至后初始濃度對菌體生長的影響及消耗的影響和接種量增大之前的規(guī)律相似 從各個代謝圖的對比中可以看到 增大接種量后代謝的終點(diǎn)都提前了約個小時 從的消耗曲線可以看出 在初始階段小時左右的消耗速率較慢菌體濃度上升也較慢這可能是由于菌體處于適應(yīng)期在到小時為的高消耗階段 濃度下降很快菌體生物量也大量上升 初始濃度為時的補(bǔ)料試驗以 作為初始濃度

60、 分別依據(jù)消耗曲線 確定補(bǔ)料的時間及補(bǔ)料的具體的量值表不同初始濃度下的補(bǔ)料試驗及其結(jié)果初始濃度最終濃度液相測定結(jié)果產(chǎn)量增幅對照樣品的效價為對于初始濃度為的樣品 在 小時時補(bǔ) 對和的樣品分別在小時時補(bǔ) 從結(jié)果來看以三個初始濃度進(jìn)行補(bǔ)料都取得了一定的效果且的效果略優(yōu)于和而且從總濃度來看比和的要低 并且從圖可以看出菌體在較低的初始濃度下生長速率較快 因而以下實驗選擇為初始濃進(jìn)一步進(jìn)行補(bǔ)料實驗初始濃度在時的補(bǔ)料實驗對為初始濃度的樣品的消耗曲線進(jìn)行比較精確的測定 28第 2 章 碳源對 VB12發(fā)酵的影響 時 間（）圖濃度隨時間的變化從圖中可以看出 以為初始濃度的樣品其實際濃度要高于分析可能是由于培養(yǎng)基