動物細胞工程制藥課件

1、動物細胞工程制藥密悼化蓄據(jù)叮早千幅鈍埔霸鐮褐鶴捶園游門巴輾軌鳴受馳延幀菌蓉贏臃崎動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第1頁，共73頁。細胞學(xué)說的建立 第一節(jié) 概述300多年前 世界上最早的顯微鏡 英國物理學(xué)家 Robert Hooke 軟木蜂窩狀的小格子“細胞”荷蘭科學(xué)家 Leeuwenhoek 首次觀察到活細胞 1838年Schleiden 1839年Schwann細胞是組成生物體的基本單位除紳瘴手油儒正晴和經(jīng)仿臻良攢枕俠妥防漓樓酞凈技搬鵲綏槳焰彬擂牽騷動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第2頁，共73頁。 第一節(jié) 概述組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng) 將組織或細胞從機體取出，在體外模擬機體內(nèi)的生理條件進行培養(yǎng)，

2、使之生存和生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。細胞工程 應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過某種工程學(xué)手段，在細胞整體水平或細胞器水平上，按照人們的意愿來改變細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)。憶赦呈億殲癢弧小索丟擴蘇決物痹楷敵釘觸見靈怖并抗哨勝塞虛寶槳盛崎動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第3頁，共73頁。第二節(jié) 動物細胞的形態(tài)和生理特性適應(yīng)功能,形態(tài)各異分化離體培養(yǎng)細胞分兩類： 貼壁細胞 懸浮細胞一、動物細胞的形態(tài)峨淆審硯柵詣腸贍翻政翠企帚悸嗆鈉儉拒庚里雙鎂蕉塑獺枕徘彼棍兵莆催動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第4頁，共73頁。恒侮詣虞卻溯繃寐難飛勇瘧膛唉汰磺負裁官吏汀療化歪

3、訖莎循遇焚懲皖脹動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第5頁，共73頁。貼壁細胞 生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長。 兩種形態(tài)： 成纖維細胞型 上皮細胞型動物細胞的形態(tài)院靈滑戴唇梭窄釉士緬鉚遷刊份鎳吊鋤芒帖渴義慘痢抓桃腥匠祖寺楷脹辣動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第6頁，共73頁。懸浮細胞 生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細胞。動物細胞的形態(tài) 盤鏈恕凍酞饑狗佩搬芍尖吟仰考滯淮鉆蕭舷浙諺成長羹考則言斤且儈閏垢動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第7頁，共73頁。兼性貼壁細胞 生長不嚴格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細胞，小鼠L929細胞。動物細

4、胞的形態(tài)小鼠成纖維細胞歇逼羅昭網(wǎng)橢壬須似贓湃舊鳴還瘡滁棚叁絆佩角傣虛赴套吹終唐唾匝踞蕾動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第8頁，共73頁。糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝分為三個階段：1.大分子降解為小分子物質(zhì)；2.小分子物質(zhì)代謝產(chǎn)生中間產(chǎn)物：乙酰CoA、-酮戊二酸、草酰乙酸；3.中間產(chǎn)物進入TCA循環(huán)，產(chǎn)生大量能量。二、動物細胞的代謝生物反應(yīng)器設(shè)計的關(guān)鍵： 如何提高氧的傳質(zhì)速率？諺標蓄向冶疆妓蠕汰樸斌胞蕩呵裕巨把缽?fù)示o隙娟拐郴撞隙凋批通哨婆誅動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第9頁，共73頁。 細胞的分裂周期長 細胞分裂時間為1248h。三、動物細胞的生理特點G0G1G2SM分裂周期 = 間期 + 分裂期

5、 （G1+S+G2） （M）羞惦吭墜相霧諾橢待楞鞏漠肢嫁湘狡貉子瀾郵稈綠村烈建彌指冗怠押估氓動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第10頁，共73頁。動物細胞生理特點G1期：46h 合成DNA聚合酶， RNA合成。S期：68h DNA合成。G2期：25h DNA量加倍, RNA合成。M期：0.51h 染色體分裂。攪脾拱淀除匿甩倍歲間圭立躍廊蜜蛤鼻磋啡徊鍺謬汪吱漬鞘辮縣雜櫥灣教動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第11頁，共73頁。動物細胞生理特點屋嘶展埠矛現(xiàn)核海嚼留遍押紉逸濟臉艦斧糕典啪睜椎妓駭喬皇籠星嗜狼宅動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第12頁，共73頁。動物細胞生理特點 細胞生長需貼附于基質(zhì),并有

6、接觸抑制現(xiàn)象俗父汞修蜂戒癢慌鈣靖希怎嵌繭頒輯絹鈣哀斧棍鋼淬扼椿浮扁竭司省窯賞動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第13頁，共73頁。動物細胞生理特點 正常二倍體細胞的生長壽命是有限的原代培養(yǎng)：細胞從機體取出后立即培養(yǎng)。經(jīng) 傳代后成為有限細胞系。細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到4050代，這種傳代細胞稱為細胞株。細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。賴勁挑慨犯膀欣

7、畜橙舒慕尺謎提康旱繪遏井范馭噓慫蚜碾允覺知瘁漠封望動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第14頁，共73頁。如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細胞株和細胞系？細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞株細胞系多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變動物細胞生理特點黍仕鐘忿頂杠怔牡鮑耳貢咬輩臻小婿挖柑貧淘生般酬仰篡匠蓉斷柏貍瞧詢動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第15頁，共73頁。動物細胞生理特點 動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感 對理化因素敏感，如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。 動物細胞對培養(yǎng)基要求高 必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、葡萄糖

8、、細胞生長因子、貼壁因子等。詛千扶鎳故閹媒證棠囤豁移夕蕪趣駁撿霄娛頓糊拂殘軟濤領(lǐng)漠時氈滑雕即動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第16頁，共73頁。動物細胞生理特點 蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細菌不同 動物細胞蛋白質(zhì)的合成部位： 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體 游離核糖體口弟摩兒剛澆薩交龍之雀吮焚肘氓慮漱潘軍晦枷軀廈啤搖順園犬渣脈程擄動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第17頁，共73頁。動物細胞生理特點游離核糖體合成蛋白質(zhì)： 用于細胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)： 分泌的和膜中的整合蛋白，多為糖蛋白。帶邵礦仗始蝎懾寬丙淹竟男顆拍哪豈筆蔭網(wǎng)賽車炮較貿(mào)禽椰賽橡鐮耿皆蘸動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第1

9、8頁，共73頁。動物細胞生理特點動物細胞生產(chǎn)藥物優(yōu)點:分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖 基化，與天然產(chǎn)品一致。缺點:培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。帖泊已倡掘慨挑鄂永向氖恭散臨速捎漢幽闌建畦鄉(xiāng)寢從至礎(chǔ)唯位汀豈懲犁動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第19頁，共73頁。第三節(jié) 生產(chǎn)用動物細胞的 要求和獲得原代細胞二倍體細胞系轉(zhuǎn)化細胞系一、生產(chǎn)用動物細胞的要求跪鈾祖淪扳肩飾摸郁陜蜜尾嫩扇掏磚劍你蕪懦已唉巍確淖殖薛痕翅漳單佑動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第20頁，共73頁。二、生產(chǎn)用動物細胞的獲得原代細胞 是直接取自動物組織器官,經(jīng)過粉碎消化而獲得的細胞懸液（109個/g）。 常用的如：雞胚細胞、原代兔腎

10、細胞、鼠腎細胞、淋巴細胞。缺點：需要大量動物，費錢費勞力。痰壘祖付絞名茹佬扒援?dāng)f夯腕醛桶差商菊軀哄懼移墻澳荷句墊磅脂垣董帽動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第21頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的獲得 二倍體細胞系 原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從多種細胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。二倍體細胞有正常細胞的特點：染色體組型是2n核型；貼壁依賴接觸抑制；可傳代培養(yǎng)50代；無致瘤性?？奘Y抉豫侗想振淌曳屑狹唆了俏伯頻灌鎊竹鼻趴汽侄肢撈棍即郡炙條喝住動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第22頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的獲得 轉(zhuǎn)化細胞系 通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，

11、失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的和人工的（如從腫瘤組織中建立的細胞系）。日坪殃壟鈣甕武盞夢操暫寓稽盅淡氮街九梳很狀迢瘤汗畔貍九鋤試醉漾纓動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第23頁，共73頁。三、基因工程細胞構(gòu)建和篩選 在生產(chǎn)中采用更多、更有前景的是融合細胞以及基因工程構(gòu)建的各種工程細胞。芍競屆容曉坍蓄訂咖但哼搏緘抑晉肺瞄壞辯槳盅近牟暢避奇積披酶終榨伙動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第24頁，共73頁。被用構(gòu)建工程細胞的動物細胞有CHO-dhfr（野生型t-PA工程細胞株） BHK-21（倉鼠卵巢細胞株）Namalwa（人淋巴瘤細胞株）Vero（非洲綠猴腎細胞株）SP2/

12、0（小鼠骨髓瘤細胞株）Sf-9（昆蟲細胞系）彌文勉締埠筋牡殉動丘娥暇尾素抿渣釘猿腿邑有常院翔扔芥土奮纖冉壩洞動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第25頁，共73頁。 真核細胞基因表達載體的構(gòu)建 使用的載體有兩類： 病毒載體 質(zhì)粒載體基因工程細胞構(gòu)建哼黨居旗干肉政橋題宗兔往們瞳倘肖睫贖圍軋肇器嚇邊重董侄襟猿貼興疇動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第26頁，共73頁。基因工程細胞的構(gòu)建病毒載體 牛痘病毒：用構(gòu)建多價疫苗。 腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：用于基因治療。 桿狀病毒：用于外源基因表達。蟹勝霹槽妄電姜黔碎陪克費估剃噓棍趕痘鈕譬蛆熬殃膳暑爺淖撩伯銑負漾動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第27頁，共73頁?；?/p>

13、工程細胞的構(gòu)建 病毒作為載體的優(yōu)點： 雙鏈DNA，易重組； 插入78kb DNA不影響正常病毒粒子的形成； 多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子； 多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%30%； 用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為標記物，選陽性克?。?如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達外源基因。祁腳滬個雨五稻乏謠睜育豆濱狹凹梗汐能視憂粗澳臣畔體互合兆獅狡候載動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第28頁，共73頁?；蚬こ碳毎臉?gòu)建質(zhì)粒載體 在細菌和哺乳動物細胞體內(nèi)都能擴增 穿梭質(zhì)粒載體。含有如下基本成分： 允許

14、載體在細菌體內(nèi)擴增的質(zhì)粒序列。 含有使基因表達的調(diào)控元件。 能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。 有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng)。偷棚站寢甘鄧硫侍炭待炸儡彪蠱鼓醫(yī)處欺閨晾鉤炸漫圓呂敏娥班絮席吵里動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第29頁，共73頁。 基因載體的導(dǎo)入和高效表達 工程細胞株的篩選配閘顯覽堆暇珠舵窘苫俺謂兒種廢豆嗜涯疽貪靳隅僳弱再柄觀評周瘍窮顛動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第30頁，共73頁?；蜉d體的導(dǎo)入 基因載體導(dǎo)入動物細胞常用方法是：磷酸鈣沉淀法電穿孔法居試針款峭炸饑扔濺守臉挨已厘損葡隙堪枝脂傅捐訟謗苯囊墩赴內(nèi)巳巨電動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第31頁，共73頁?；?/p>

15、因載體的導(dǎo)入磷酸鈣沉淀法 溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細胞表面接觸時，則通過細胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。鈾花墑蘋秤徑壓韭夢四激椒暗拭駒駝操葉跟鉀頭淋俘幾估蒸驟榴觸踩洗栽動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第32頁，共73頁。基因載體的導(dǎo)入電穿孔法 借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。享斗慨滌帆掃肉保憂儲銳薔貳窗芋杏剪涯雪勛放恬戳喝挨拍初猙葛財餅式動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第33頁，共73頁。四、常用生產(chǎn)用細胞的特性W1-38 正常胚肺組織人

16、二倍體細胞系。 核型為2n=46。成纖維細胞，能產(chǎn)生膠原。 培養(yǎng)基（BME）：10%小牛血清，pH7.2。同工酶為G6PD B型。倍增時間為24h，有限壽命50代。安全，用于制備疫苗。疫苗是將病原微生物（如細菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。 疫苗保留了病原菌刺激動物體免疫系統(tǒng)的特性。當(dāng)動物體接觸到這種不具傷害力的病原菌后，免疫系統(tǒng)便會產(chǎn)生一定的保護物質(zhì)，如免疫激素、活性生理物質(zhì)、特殊抗體等；當(dāng)動物再次接觸到這種病原菌時，動物體的免疫系統(tǒng)便會依循其原有的記憶，制造更多的保護物質(zhì)來阻止病原菌的傷害。極毋亦胳脾訊電鳳襪娥

17、舊氯囑洱彼泊頹脾竊瓶唁效斥咸實事鴦鎮(zhèn)柿往牡為動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第34頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的特性 有限壽命4246代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。MRC-5 從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細胞系。 核型：2n=46，屬成纖維細胞。 培養(yǎng)基：加小牛血清。 同工酶：G6PD B型。折逆繁撼達敗饒膠滇柬袖虧籮徑憲洶咒鄧伐何炙哈暇夯巴蓄欲嫉棺貉校勞動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第35頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的特性CHO-K1 從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細胞。 核型： 2n=2022。 培養(yǎng)基（DEME）：0.1mm

18、ol/L次黃嘌呤， 0.1mmol/L胸苷； 10%小牛血清，加入 脯氨酸。扒縮劊敞鯉蚜屢彈括縛妖烴麗綱翔戍查幟擅爆垮捆代婉蘆崇楔嗓提美宋賄動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第36頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的特性BHK-21 從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的；成纖維樣細胞,核型為 2n=44；培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細胞構(gòu)建。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細胞構(gòu)建。扶燴犁摩暴詐寢猶讀哆述迭跌所逾脈伶掖圣菱扦雖對樓校犢杰墜峽俏匙仿動物細胞工程制藥動物細胞工程

19、制藥第37頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的特性Vero 從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。散曙線鞋運曹蓋兄論雕默慶唾量滿取伊抄盂寒弗莉潑裁摹八戮蜒榴巢雇豎動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第38頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的特性Namalwa 從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類淋巴母細胞。2.8%的高倍體率，12 14條標記染色體。單條X，無Y。培養(yǎng)基為RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生產(chǎn)干擾素。學(xué)悟潔筍君賞啼鼓膿刑瞻樸惱踏末棗刻畢淺憋集懲寺秀蠕殺食斑畝疥州焦

20、動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第39頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的特性SP2/0-Ag14 通過融合的方法，從有羊抗紅細胞活性的BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞系P3X63Ag8融合雜交瘤SP2/NL-Ag亞克隆中分離獲得，能耐受8氮鳥嘌呤20g/ ml但在含HAT 選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為DMEM，添加10%胎牛 血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細胞和抗體。初掣綏狹餅店博野巍漓鈴吵履琢迅亦揚筷赫癟戰(zhàn)滇捕僑靜丙敢辛恤轄穩(wěn)秒動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第40頁，共73頁。生產(chǎn)用動物細胞的特性Sf-9 1983年從親代IPLBSF21AE中克隆形成。親代細胞從秋粘蟲的蛹卵組織中分離獲

21、得。它對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。 通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，10%胎牛血清。用于高效表達外來蛋白制品。刺侄臺圓種耶繞檔險總鉻陸挨置武承欣曝宦袒伙綜蔬腿妥拇溜頻稗高從欄動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第41頁，共73頁。五、細胞庫的建立 生產(chǎn)用的工程細胞必須建立兩個細胞庫： 原始細胞庫 生產(chǎn)用細胞庫妹膠顏杖雁顆造事輝瘸敷滁瘟芹鼎剁梨痘酵淺瑟懼斂汲嘴局遠操幻南志宏動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第42頁，共73頁。細胞庫的建立原始細胞庫 貯存時須有該細胞的詳細擋案，包括： 該細胞系的歷史 該細胞系的特性 對各種有害因子

22、的檢查結(jié)果泡職擅鱉稚篇牧拋迸杉藤巡酥做蜘婦沿縫府棲延俏豎躇癢倫它躇噓忙睛音動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第43頁，共73頁。細胞庫的建立 生產(chǎn)用細胞庫 從原始細胞庫來的，或從單一安瓶來，或從多個安瓶來即刻混合，經(jīng)培養(yǎng)擴增再分 裝儲存形成細胞庫。需建擋案，進行無菌性無細胞交叉污染的檢查。需確定最高使用的傳代數(shù)。父瑚跺倔玄擄奧佩忙丹容紳母濁市洪輸蝗吮溪曝吳嚙賬虹薔灶赫熱厲網(wǎng)縛動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第44頁，共73頁。第四節(jié) 動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基一、動物細胞的培養(yǎng)條件動物細胞體外培養(yǎng)特點營養(yǎng)條件苛刻適應(yīng)性差, 敏感培養(yǎng)時間長，易污染附泳挺身儡技棟追餞什僳話鈴曼削斬打藐雜鼎孜曉后金缺

23、琳瓦秘頒印揉拔動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第45頁，共73頁。1、無菌、無毒的環(huán)境（器材的清洗、消毒）2、水質(zhì)（去除有毒元素、金屬離子、微生物、熱 原）3、pH：最適在7.2-7.4。常用Na2HPO4/NaH2PO4和 NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)。4、滲透壓：理想值 290300 mOsm/kg（NaCl法）5、溫度：370.5 6、空氣（O2， CO2 ，N2） 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)：裝液量不超過總?cè)莘e的30%； 大規(guī)模培養(yǎng)：95%空氣和5%CO2。動物細胞培養(yǎng)條件mOsm/kg（毫滲）1升溶液中所含的非電解質(zhì)或電解質(zhì)的毫摩爾，稱為毫滲透摩爾。熱原可以引起體溫增高的物質(zhì)。拴坊食屆屹赴鴨誘口聚悶檬

24、眶尾拾陸慕急甩度衍睡戮五芯叁寂凹如雨憐垛動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第46頁，共73頁。 主要取自于動物體液或從動物組織分離提取而得。優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點是成分復(fù)雜、個體差異大、來源有限。包括生物性液體(如血清、淋巴液)、組織浸出液(如胚胎浸出液、羊水、腹水)、凝固劑(如血漿)等。二、動物細胞培養(yǎng)基的種類和組成天然培養(yǎng)基吊視揍涌六橡炭專擔(dān)糾撲轉(zhuǎn)唬氣杜總摸罷識桐粱潑勸腔霧汕享碘栽果兒頂動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第47頁，共73頁。 采用成分明確的化學(xué)試劑配制的培養(yǎng)基。所含成分大致為：氨基酸、維生素、糖類、無機鹽和其他成分（腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷、谷胱甘肽、動物血

25、清）。動物細胞培養(yǎng)基種類和組成合成培養(yǎng)基狡的福賈堿癥撩忘拿摻駭炭福宮胞痞熊費腿并銷汽鴉鎮(zhèn)蒸萌氦構(gòu)祟侗洗屏動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第48頁，共73頁。動物細胞培養(yǎng)基種類和組成動物血清的作用提供有利于細胞生長增殖所需的各種生長因子和激素；提供有利于細胞貼壁所需的貼壁因子和生長因子；提供可識別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白；提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素；提供良好的pH緩沖系統(tǒng)。幸站滄引燙漏爸鹽敷牽蓄坯秸陷似伎棋科灼隅開蘇族嫡蛆秤晚渠祝淄械喚動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第49頁，共73頁。 在合成培養(yǎng)基中加入不同種添加劑所構(gòu)成。添加劑的類型：激素和生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展

26、因子、有利于細胞生長的因子和元素（如谷胱甘肽、硒等）。動物細胞培養(yǎng)基種類和組成無血清培養(yǎng)基瑚疙范供互淳溺螟襯帆鉚祥虧婿呼棺看瑣倡抒膳檔征往椒城碧噎瞪籃攬啞動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第50頁，共73頁。第五節(jié) 動物細胞培養(yǎng)的基本方法根據(jù)細胞種類原代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)基液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)容器和方式靜止培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)攪拌培養(yǎng)微載體培養(yǎng)中空纖維培養(yǎng)固定化培養(yǎng)豌眉倡步護盲御劫加扶扎瘍零瞎務(wù)聚舊朱擂慨袒瀕蕉酸稠炔謂籬逸衙繭湃動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第51頁，共73頁。1.離心分離法 從含有細胞的體液如血液、羊水、胸腹水中分離細胞。800-1000r/min，5-10min。 動

27、物細胞培養(yǎng)的基本方法細胞分離2.消化分離法組織塊剪碎消化（胰酶、EDTA、檸檬酸鹽等）細胞懸液緩沖液洗滌離心棄殘留的消化液收集細胞 懂藕妒蔫纂攝待災(zāi)戀辮奸擎燈歷僚瞻信筐柜慨晾捧扼隱慈藏兌捌旗佃痹假動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第52頁，共73頁。 分為：自動細胞計數(shù)器計數(shù)、血球計數(shù)板計數(shù)（細胞總數(shù)）、結(jié)晶紫染色細胞核計數(shù)法、MTT染色計數(shù)法（活細胞計數(shù)）。動物細胞培養(yǎng)的基本方法細胞計數(shù)油渝千階絮見膏乒湃遙悸盎俊蝗謄呆苞扳篆潰誠喂袱膚貴冠思河泌階削也動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第53頁，共73頁。 血細胞計數(shù)板的四個角上各有一個大格，每一大格由16個方格組成。 動物細胞培養(yǎng)的基本方法血球計

28、數(shù)板計數(shù) 因為每1大格體積為0.1mm3，1ml =1000mm3，所以1大格細胞數(shù)10000 = 細胞數(shù)/ml。如細胞壓在格線上，則按計數(shù)規(guī)則：“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”。頃涪壕瑚鳳乖泳痙耐鴦豺臨喜捏肌酸喝賈郭麓惋孵戲巋崖瞬碴淬節(jié)龔心缺動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第54頁，共73頁。動物細胞培養(yǎng)的基本方法血球計數(shù)板計數(shù)鮮蘸鼠慌邦診擎沉啞鳳啃峰頌該項拱勺媽初嘎丘潤臼宙毗聞停霞旱譴述遣動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第55頁，共73頁。 活細胞的細胞膜具有選擇通透性，不能被臺盼藍染色，所以活細胞是透明的。當(dāng)細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，使其著色，借此可以鑒別死細胞和活細胞。 動

29、物細胞培養(yǎng)的基本方法活細胞計數(shù)翟煌辦白佰卜視杏險柄佳韌鉀觀唐纜涪畏征榨精匪舔膘嗅桓竭役疹度頗億動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第56頁，共73頁。1.懸浮的細胞傳代 加入一倍或幾倍的生長液，然后分種兩只或多只培養(yǎng)瓶。動物細胞培養(yǎng)的基本方法細胞傳代2.貼壁的細胞傳代 需經(jīng)消化液消化后再分種。消化液用量以蓋滿單層細胞為度；消化時間2-5min（室溫）；加入到有血清的培養(yǎng)基中，以20-30萬個/ml為好。每天或隔天換液，3-5d傳代一次。鎬拜現(xiàn)球升淺槳問派校瘡霸董棘窩慢棺羹啞胺城讓尺昏插贏起莽掏冪和船動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第57頁，共73頁。目的：延長存活期。方法：液氮低溫冷凍（-196）

30、動物細胞培養(yǎng)的基本方法細胞的冷凍注意： 加保護劑，如甘油、二甲亞砜。 控制冷凍速度：以1/min的速度下降為宜。細胞的復(fù)蘇要求：快融。內(nèi)晝臻錢雷這泡孿顏菠煽狼朝荒閱棕枷煙逃薪墊忘造膿啊鑲括貌吩穗玫梗動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第58頁，共73頁。第六節(jié) 動物細胞大量培養(yǎng)的方法一、動物細胞培養(yǎng)方法1.懸浮培養(yǎng)：用于非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)，可用發(fā) 酵罐式的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器。2.貼壁培養(yǎng)：用于貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。滾瓶系統(tǒng)、 微載體系統(tǒng)。3.固定化培養(yǎng)：既適用于非貼壁依賴性細胞也適用于 貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。一般對于貼 壁依賴性細胞通常是采用膠原包埋， 而對于非貼壁細胞是采用海藻酸鈣包 埋。墻郡稀

31、轄丸賊撬煤卻覺羌傅斑話遙緒匿扣佬箕趕洲焚擎財痘牙兩潮杯哇齡動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第59頁，共73頁。脂句忌瘤緩雍盂沫粱堵妥輿丫瑟祖障笛牢序擲垮笛澤謝豹尿響荒貫隱峽韻動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第60頁，共73頁。二、動物細胞培養(yǎng)的操作方式培養(yǎng)方式：分批式培養(yǎng)、半連續(xù)、連續(xù)式培養(yǎng)。分批式培養(yǎng) 細胞、培養(yǎng)基 一次性加入到反應(yīng)器中 培養(yǎng) 培養(yǎng)基、產(chǎn)物、細胞一并取出半連續(xù)式培養(yǎng) 細胞、培養(yǎng)基 加入到反應(yīng)器中 每隔一定時間取出部分培養(yǎng)物、補充同量新鮮培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng) 優(yōu)點：操作簡便、生產(chǎn)效率高，可長期進行生產(chǎn)，重復(fù)收獲產(chǎn)品，細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量保持在較高水平。正礦豺椰張獅街鼻燦程延嘲酣哦茂嘿

32、卜壇鎬食紐舅事盅帝渤獰儀緣叁杰申動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第61頁，共73頁。二、動物細胞培養(yǎng)的操作方式連續(xù)式培養(yǎng) 一般是采用灌注培養(yǎng)。是把細胞接種后進行培養(yǎng)的過程中，連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液，同時不斷的補充新鮮培養(yǎng)基。但過程中不取出細胞，細胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細胞處于一種營養(yǎng)不斷的狀態(tài)。優(yōu)點：細胞處在良好的環(huán)境中（營養(yǎng)充足、有害代謝產(chǎn)物少）；細胞密度大，極大提高產(chǎn)品產(chǎn)量；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間縮短，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；培養(yǎng)基的比消耗率較低，生產(chǎn)成本降低。撣癌茵妨姻針粉嚙矗綢腸暢炯弧瘁陰樂截襟始零節(jié)抱夠題詠抨帥佐討瘧貢動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第62頁，共73頁。第七節(jié) 動物細胞生

33、物反應(yīng)器 為動物細胞的生長代謝提供一個最優(yōu)化的環(huán)境，從而使其在生長代謝過程中生產(chǎn)出最大量、最優(yōu)質(zhì)的所需產(chǎn)物?；疽笾圃觳牧媳仨殶o毒；良好的傳質(zhì)、傳熱和混合性能；密封性能良好，避免污染；自動化程度高；可長期連續(xù)運轉(zhuǎn)；容器內(nèi)面光華、無死角；拆裝、廉潔和清潔方便，耐高壓，成本低。保口禍貧眷瑯掏奔病蝗險聚庸繞訂透擄脾粟詛崔斟窘狙由糜禹課疏蹋及郴動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第63頁，共73頁。一、動物細胞生物反應(yīng)器的類型及基本結(jié)構(gòu)1.攪拌罐式生物反應(yīng)器舶栽櫻人靶劃溶賀元膩譴巨烯進欲銘沁順快閏嘯拍畝窯鉚創(chuàng)柿損瞎霧肅匹動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第64頁，共73頁。一、動物細胞生物反應(yīng)器的類型及基

34、本結(jié)構(gòu)2.氣升式生物反應(yīng)器傲棄支帆密雜塔嫡婦凌一歡鉆凱膘樊夢頸述成鍘蹋廉鵝創(chuàng)敲軌蜂怖賺師側(cè)動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第65頁，共73頁。一、動物細胞生物反應(yīng)器的類型及基本結(jié)構(gòu)3.中空纖維式生物反應(yīng)器凌貝甥泳埂敘乒巷壽幫革葬晦蠢怔誤榨輕雛動己刀桌峨飄簍狽綸衣渣顏炕動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第66頁，共73頁。一、動物細胞生物反應(yīng)器的類型及基本結(jié)構(gòu)4.透析袋或膜式生物反應(yīng)器壺匝霜外禮涅銻跳鎂詳綿硯屈墟背艱玉爪凜此貍食桃圓數(shù)糜腺獻炒這弧啥動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第67頁，共73頁。一、動物細胞生物反應(yīng)器的類型及基本結(jié)構(gòu)5.固定床或流化床式生物反應(yīng)器盆別溯民房俱敗抓曹廠涕旨財侄巳肚瞪豎忙芒密教供鋪劊奢宰拈鄉(xiāng)轄斯墮動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第68頁，共73頁。一、動物細胞生物反應(yīng)器的類型及基本結(jié)構(gòu)5.固定床或流化床式生物反應(yīng)器痢盒聶栓熏搏中鴻貸箔信壽夾瘓氛醞幣榜僻甲巒滇宮神掛浚疑靴竭涪悄院動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥第69頁，共73頁。二、動物細胞生物反應(yīng)器的檢測控制系統(tǒng)1. 培養(yǎng)過程中需檢測的物化參數(shù)在線檢測（傳感器檢出） 溫度、pH、溶氧、攪拌速度離線取樣檢測 活細胞數(shù)、氨基酸濃度、葡萄糖、乳酸、氨離子計算獲得 細胞群