AEAPS與葡聚糖共修飾超順磁納米顆粒的制備及性質(zhì)

1、AEAPS與葡聚糖共修飾超順磁納米顆粒的制備及性質(zhì)鄧均1,賀娟1,鄭峻松？1,賈延輝2,黃輝1,方立超1,李艷1,蔣麗莉1,李平1 （第三軍醫(yī)大學(xué)：1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床檢驗(yàn)學(xué)教研室，重慶 400038, 2學(xué)員旅七隊(duì),重慶 400038）摘要 目的 探討以AEAPS及葡聚糖共修飾超順磁納米顆粒（superparamagnetic nanoparticles, SPION）的制備方法，并檢測(cè)其物理和磁學(xué)性質(zhì)。方法 共沉淀一步法制備葡聚糖包被的四氧化三鐵納米顆粒，然后在通氮、 60C、強(qiáng)力機(jī)械攪拌的條件下加入 AEAPS,得到AEAPS與葡聚糖共修飾的SPION。采用透射電鏡測(cè)量其大小及分布，用振 動(dòng)

2、樣品磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)磁化率等參數(shù)，用普魯士染色的方法判斷AEAPS/葡聚糖-SPION是否與抗體連接。結(jié)果所得樣品核心為四氧化三鐵晶體，核心粒徑不超過(guò)20nm,包被葡聚糖后整體顆粒直徑不超過(guò)25nm,質(zhì)量飽和磁場(chǎng)強(qiáng)度為67.36488 emu/g Fe, AEAPS/葡聚糖-SPION與抗體結(jié)合，可對(duì)特異性抗原產(chǎn)生抗原-抗體結(jié)合，普魯士染色結(jié)果為陽(yáng)性。 結(jié)論制備的樣品具有粒徑小，分散性好，超順磁性等優(yōu)點(diǎn)，能與單克隆抗體有效結(jié)合。【關(guān)鍵詞】超順磁性氧化鐵；AEAPS;納米粒子；抗體偶聯(lián)Preparation and performance test for AEAPS/Dextran-modified

3、 SPIONDENG Jun, HE Juan, ZHENG Jun-song ?, JIA yan-hui, HUANG Hui, FANG Li-chang, LI Yang, Jiang Li-li, LI Ping （Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Medical Laboratory, Tird Military Medical University, chongqing 400038, China, 2Seventh Band, Student Brigade, Tird Military Medical

4、 University, chongqing 400038, China ）Abstract: Objective To explore the method of preparation of AEAPS-Dextran-modified SPION （ superparamagnetic iron oxide nanoparticles） and test the physical and magnetic properties of the nanoparticles . Methods Dextran-modified SPION was obtained by “onestep ”c

5、o-precipitation method. Then, AEAPS was added to the resultant Dextran-SPION under the condition of N2 saturation and high-speed mechanical stirring at 60 c . The size and magnetic susceptibility of the nanoparticles were measured by transmission electron microscope and Vibrating Sample Magnetometer

6、, respectively. Results The AEAPS-Dextran-modified SPION nanoparticles had core-shell diameter less than 25nm with magnetic core of less than 20nm in diameter.The mass saturation magnetic intensity is 65.82319emu/g Fe. Antibody conjugated with AEAPS-Dextran-modified SPION could bind to its specific

7、antigen and showed positive Prussian Blue staining. Conclusions The AEAPS-Dextran-modified SPION possessed characteristics of small size , good dispersion super-paramagnetic response and could be to link to monoclonal antibody for possible application in disease diagnosis and treatment. Key words :

8、superparamagnetic iron oxide nanoparticlesstem ; AEAPS ; Nanoparticles ； antibody conjugation超順磁納米顆粒（SPION）作為磁共振（magnetic resonance, MR）對(duì)比劑已應(yīng)用于臨床。磁性 納米材料可結(jié)合各種功能分子，如蛋白質(zhì)、細(xì)胞、 DNA或RNA等，從而實(shí)現(xiàn)各種特殊的檢查。由 于磁性納米粒子具有高比表面積、高比表面能，以及粒子各向異性的偶極距作用從而很容易聚集1。有些磁性粒子如Fe、Fe3O4很容易被氧化成 rFe2O3,從而導(dǎo)致粒子發(fā)生聚集和沉淀，不能形成穩(wěn)定的 分散體系，使其在生

9、物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用受到了限制。通過(guò)對(duì)磁性納米粒子的表面修飾可以降低其表面 能，提高粒子的抗氧化能力，得到分散性好的納米復(fù)合粒子；同時(shí)適當(dāng)?shù)谋砻嫘揎椏梢哉{(diào)節(jié)磁性納 米粒子與其他材料的相容性和反應(yīng)特性。單克隆抗體修飾超順磁性氧化鐵微粒后，可應(yīng)用于惡性腫 瘤的特異性靶向給藥或早期診斷。由于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，SPION很難到達(dá)肢體遠(yuǎn)端。為此，本研究利用葡聚糖修飾 SPION,增加其生物相容性，再用N-（2氨基）-3氨基丙基硅氧烷（N-（2-aminoethyl）- 3-aminopropyltrimethoxysilance, AEAPS ）修飾SPION ,使其氨基硅烷化后能與單克隆抗體有效結(jié)合并 可

10、逃逸網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬。1材料與方法儀器和試劑基金項(xiàng)目：創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（批準(zhǔn)號(hào)：SKLKF200809 ）作者簡(jiǎn)介：鄧均（1974-）,男（漢族）,重慶，博士。電話：（023） 68752309, E-mail: HYPERLINK mailto:djtmmu djtmmu?通訊作者：鄭峻松,男，（1971-）,研究領(lǐng)域?yàn)榧{米材料在腫瘤早期靶向診斷的應(yīng)用。電話：（023） 68752310, E-mail:zhengjunsong。儀器 Hitachi-600透射電鏡（日本日立公司），KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限 公司中佳分公司） ， T6-1

11、型電動(dòng)攪拌機(jī)（上海標(biāo)本模型廠） ， HL-2 恒流泵（上海瀘西分析儀器廠有限公司） ， Multiskan Sepectrun 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 （Thermo） ， 紫外分光光度計(jì)DU-65（Beckman） ， HH- 15 震動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（ 南京大學(xué)儀器廠）。試劑三氯化鐵（FeC13 6H2。）、氯化亞鐵（FeC12 6H4。）、碳酸鈉、碳酸氫鈉、亞鐵氧化鉀、鹽 酸、氨水、冰乙酸、甲醇、甲苯、戊二醛、硫酸、鹽酸羥胺、鄰二氮菲等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，葡聚糖 T-10（BBI ， 相對(duì)分子質(zhì)量10000） ， BSA ， AEAPS（A1fa Aesar） ， 甲胎蛋白單克隆抗體（Tianji

12、n ），甲胎蛋白（博賽生物） 。方法SPION的制備 通過(guò)共沉淀法制備外包葡聚糖的四氧化三鐵超順磁納米顆粒（ SPION）,反應(yīng)原 理：Fe 結(jié)果2.1 透射電鏡在210000倍透射電鏡下觀察，可見(jiàn)AEAPS/Dextran-SPION 核心為高密度的圓形顆粒，表面為分+2 Fe散均勻的 AEAPS/Dextran 覆蓋層，以透射電鏡標(biāo)尺50nm ，估算出 AEAPS/Dextran-SPION 的核心粒徑不超過(guò)20nm,整體粒徑不超過(guò) 25nm （圖1）。由圖2可知，SPION的平均粒徑約為15nm。樣品OD490 （ x至）+8OH-=Fe304+4H2。，具體步驟：稱取 FeCl3 .

13、6 H2O 2.34 g、FeCl2 4 H2O 0.86 g、葡 聚糖T-10 2.5g,在通氮條彳下溶于30ml三蒸水中，在60c和1000r/min機(jī)械攪拌下用恒流泵以1ml/min 滴加25%氨水30ml,反應(yīng)1h后得到黑色膠狀物。自然冷卻至室溫，8000r/min離心10min,棄去沉淀，收集上清液。將上清液用冰乙酸調(diào)pH值至8.0, 0.22濾膜過(guò)濾，分裝后置于 4 c備用。AEAPS修飾SPION在Dextran-SPION表面修飾AEAPS ,使其氨基硅烷化2。配制AEAPS溶液， 取3.5mM AEAPS加入10ml甲苯/甲醇（甲苯：甲醇 =1 ： 1）溶液。取50 ml D

14、extran-SPION溶液，加入 5ml AEAPS溶液，在通氮條件下， 60 ch和1000r/min機(jī)械攪拌下反應(yīng)4h。0.22 ”濾膜過(guò)濾，分裝后 置于 4備用。同時(shí)，選用傳統(tǒng)的交聯(lián)劑戊二醛修飾Dextran-SPION 。樣品性能檢測(cè)透射電鏡觀察SPION的形態(tài)和直徑在銅網(wǎng)上制膜，將SPION溶液滴于銅網(wǎng)上，自然沉淀 5min后，用濾紙吸走邊緣多余液體，透射電鏡觀察SPION 的形態(tài)和直徑。SOPIN 、 AEAPS-SPION 中鐵離子和葡聚糖含量的測(cè)定采用二價(jià)鐵-鄰二氮菲法3測(cè)定鐵的含量；蒽酮 -硫酸法 4 測(cè)定葡聚糖的含量。磁學(xué)性質(zhì) 用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)進(jìn)行磁化曲線檢測(cè)，具體方法如

15、下：真空烘干樣品 , 逐漸加大磁 場(chǎng)強(qiáng)度作用于樣品 , 觀察到樣品的磁化強(qiáng)度不再增加時(shí)停止。 記錄磁化曲線相關(guān)數(shù)據(jù) , 處理后獲得樣 品的飽和磁化強(qiáng)度、比飽磁化強(qiáng)度、比剩余磁化強(qiáng)度和剩磁等參數(shù)。AEAPS與Dextran-SPION連接的檢測(cè) 為檢測(cè)AEAPS/Dextran修飾的SPION是否可以有效連接 AFP抗體，該抗體用來(lái)與 AFP抗原反應(yīng)。用冰乙酸將 AEAPS/Dextran-SPION溶液調(diào)pH值至6.0,加入 2.59 科 g/mlanti-APF , 4 c靜止 24小時(shí)，使單克隆抗體與 AEAPS/Dextran-SPION 結(jié)合（Mab-APF- AEAPS/ Dextr

16、an- SPION）。同樣的方法將抗體與戊二醛修飾的SPION連接（Mab-APF-GA/Dextran-SPION ）作為對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為 Dextran-SPION溶液直接與鐵染液進(jìn)行普魯士藍(lán)反應(yīng)。將 40ng/ml APF抗原100 包被酶標(biāo)板，4c包被過(guò)夜。用200 dl 1%BSA , 37c封閉1.5h。PBS洗滌3次后，力口入Mab-APF-AEAPS /Dextran-SPION （38 mg/ml） , 37c作用1h。PBS洗滌3次后，加入鐵染液（20%的亞鐵氧化鉀5份和鹽 酸1份）進(jìn)行普魯士藍(lán)反應(yīng)，37c作用0.5h。出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)果為陽(yáng)性，用酶標(biāo)儀測(cè) D （490）值。圖1

17、 AEAPS /Dextran-SPION的透射電鏡圖0010203025)90顆粒直徑（nm）AEAPS/Dextran-SPION顆粒數(shù)與粒徑關(guān)系A(chǔ)EAPS/Dextran-SPION中鐵離子和葡聚糖的含量以標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液濃度 C為橫坐標(biāo)，吸光度 A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程： A=0.0012C+0.0405 , r=0.9992。SPION 鐵離子濃度為 0.71mg/ml ; AEAPS/Dextran-SPION 中鐵離子濃 度為1.2mg/ml;以葡聚糖溶液濃度 C為橫坐標(biāo)，吸光度 A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸 方程：A=0.0126C+0.0533 ,

18、r=0.9994。SPION 中葡聚糖的濃度為 20.59 mg/ml, AEAPS/Dextran-SPION 葡聚糖的濃度為19.37 mg/ml。磁學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品的磁化強(qiáng)度值隨著外加磁場(chǎng)強(qiáng)度的增大而增大，當(dāng)外加磁場(chǎng)增大到3000Gs時(shí)，繼續(xù)增大外加磁場(chǎng)強(qiáng)度（本實(shí)驗(yàn)加大到10000GS）,樣品磁化強(qiáng)度值保持不變，即達(dá)到磁飽和。此 外，磁化曲線為一條過(guò)原點(diǎn)的單一曲線，說(shuō)明當(dāng)外加磁場(chǎng)為0時(shí)，AEAPS/Dextran-SPION樣品幾乎沒(méi)有剩磁，具有超順磁性。通過(guò)外推法求得所制備樣品的飽和磁化強(qiáng)度為67.36488 emu/g Fe,比飽和磁化強(qiáng)度 69.82151Hg圖 3 AEA

19、PS/Dextran-SPION 的磁化曲線emu/g,比剩余磁化強(qiáng)度為 32.5472emu/g ,剩磁為22.61721Gs （幾乎為0）。AEAPS與Dextran-SPION連接的檢測(cè)結(jié)果直接用SPION進(jìn)行普魯士藍(lán)反應(yīng)時(shí)的 OD490值為陽(yáng)性對(duì)照。當(dāng)檢測(cè)值P與空白（N）的P/N值大于2.1時(shí)判斷為陽(yáng)性。結(jié)果顯示Mab-APF-AEAPS/Dextran-SPION 普魯士藍(lán)反應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)色，OD490為0.120 0.0006 , P/N 值為 2.4 大于 2.1,判定為陽(yáng)性結(jié)果。而 AEAPS/Dextran-SPION、Dextran-SPION、 Mab-APF-Dextran-

20、SPION 結(jié)果P/N值均小于2.1 ,判定為陰性結(jié)果。結(jié)果表明，AEAPS/Dextran修飾的SPION可有效連接AFP抗體，并與AFP抗原發(fā)生特異性反應(yīng)， 而沒(méi)有進(jìn)行AEAPS氨基化的SPION不能 有效連接AFP抗體。因?yàn)榻Y(jié)果也證實(shí) AEAPS與SPION結(jié)合成功。表1 AEAPS與SPION連接的檢測(cè)結(jié)果N0.051 0陽(yáng)性對(duì)照1.002 =0.0006AEAPS/Dextran-SPION0.0620.002Dextran-SPION0.00600.0006Mab-APF-AEAPS/Dextran-SPION0.1200.0006Mab-APF- Dextran-SPION0.0

21、720.00063討論采用化學(xué)共沉淀法制備納米Fe3O4顆粒，其過(guò)程為：Fe3+和Fe2+分別與堿作用，先生成 Fe(OH)3和Fe(OH)2,然后Fe(OH)3和Fe(OH)2再按2:1的比例在堿性條件下反應(yīng)生成Fe3O4納米顆粒。按照反應(yīng)方程式，鐵離子與亞鐵離子的配比應(yīng)該是2:1。然而考慮到Fe2+在反應(yīng)中很容易被空氣中的氧所氧化而成為鐵離子，使Fe”減少，F(xiàn)e”增加，導(dǎo)致Fe3O4晶體中Fe”含量減少，晶體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而 使其純度發(fā)生變化，所以在配置的過(guò)程中適當(dāng)提高Fe所占的比例，以保證按照反應(yīng)方程式中的比例將Fe”反應(yīng)完全，生成納米顆粒。SPION屬于水基磁性液體，又稱磁流體，是

22、一種由納米級(jí)氧化鐵顆粒通過(guò)表面活性劑高度均勻 分散于水相中而形成的穩(wěn)定膠體溶液，即使處在重力、離心力、磁力的作用下也不會(huì)分離，即既有固體材料白磁性，又有液體材料的流動(dòng)性。所以，制備SPION應(yīng)滿足粒徑小、 磁響應(yīng)性強(qiáng)、懸浮穩(wěn)定性好等條件，便于削弱磁偶極矩之間的靜磁作用，使顆粒能在水相載體中作無(wú)規(guī)則的熱運(yùn)動(dòng)。但是 ，由于納米粒子的表面能高，缺少鄰近的配位原子，相互之間容易產(chǎn)生吸附，解決團(tuán)聚問(wèn)題是制備中的 一個(gè)難點(diǎn)。在納米粒子的表面修飾生物相容性的、可溶于水的物質(zhì)，既可以解決團(tuán)聚問(wèn)題，又可以 增加SPION的生物相容性。Tapan k.jain等5在磁性材料表面修飾 pluronic物質(zhì)，該物質(zhì)是

23、 PEO-PPO- PEO三嵌段共聚物，是一類具有生物相容性的、可溶于水的一種極其重要的非離子型大分子表面活 性劑。MRI結(jié)果表明與普通的磁性顆粒作為顯影劑相比，T2馳豫率顯著提高。本試驗(yàn)中AEAPS可使SPION表面氨基硅烷化。氨基硅烷化的優(yōu)點(diǎn)：首先硅烷化的SPION具有生物相容性，且避免了鐵元素的金屬毒性；其次是硅烷化層能夠減弱磁性顆粒間的磁偶相互作用，使得修飾后的磁性顆粒能夠 穩(wěn)定的分散于水溶液中；最為重要的為SPION提供了一個(gè)非常容易功能化的表面，從而使其表面可以共價(jià)連接各種生物分子。與葡聚糖修飾的SPION相比較AEAPS-葡聚糖共修飾的SPION結(jié)合抗體更加容易，原因是單純的葡聚糖修飾的SPION首先需要醛化，然后再經(jīng)還原方能與生物分子連接。而醛化過(guò)程需要使用高碘酸鈉、戊二醛等化學(xué)試劑，一旦進(jìn)行活體試驗(yàn)有可能對(duì)機(jī)體造成毒副作用。 本研究下一步工作就是在 AEAPS修飾的SPION上連接腫瘤特異性抗體，并對(duì)