微生物實驗課件：實驗一 細菌的形態(tài)學檢查

1、實驗一、細菌的形態(tài)學檢查一.明確臨床微生物教學實驗室守則二.不染色標本檢查三.細菌涂片的制備和革蘭染色一.臨床微生物教學實驗室守則1.為了做好個人防護，進入實驗室必須先穿實驗服和不漏腳趾的鞋。有條件應佩戴口罩、帽子和手套。不要佩戴戒指、手鐲，長頭發(fā)要挽起。2.實驗室內禁止飲食、吸煙、隨意以手撫摸頭面部等行為。必要的書籍、文具和眼鏡等帶入后，不要放在操作臺上應放在非污染區(qū)。3.每項微生物學實驗，都要堅持無菌操作，最好在生物安全柜內進行。這樣，既防止臨床標本及純培養(yǎng)物被污染，又防止病原微生物感染人體或污染環(huán)境。4.用過的吸管、滴管、試管、玻片等帶菌器材，應放在指定的地方。5.禁止酒精燈互相點燃，以

2、防止發(fā)生意外。6.若發(fā)生割破手指，菌液進入口、眼或帶菌材料破損、污染環(huán)境和物品等事故時，應立即報考老師，及時進行處理。7.實驗完畢，應清理好自己實驗臺桌面。離開實驗室前，應脫下實驗服，放入專用容器內，在消毒液中將手浸泡510分鐘（用洗手液7步洗手法或用肥皂洗三遍手），并用自來水沖洗干凈。8.每次實驗結束后留下值日生，把實驗室環(huán)境打掃干凈。并且關好水、電、門、窗后方可離開。二.不染色標本檢查【目的要求】 掌握細菌的運動情況，以便觀察細菌的動力。【器材和試劑】1.菌種 號銅綠假單胞菌和號金黃色葡萄球菌的4h新鮮肉湯培養(yǎng)物，各2ml。2.培養(yǎng)基 肉湯培養(yǎng)基。3.其他 潔凈載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精

3、燈 、顯微鏡等?！驹怼?細菌未染色時無色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周圍環(huán)境的不同來進行觀察，由于不染色的細菌遮光性強，所以，要觀察視野的光線應相對暗一些，以便能看到細菌。鞭毛是細菌的運動器官，在新鮮的肉湯培養(yǎng)物中，有鞭毛的細菌，可見其從一處快速移到另一處（發(fā)生位置的移動），稱之為動力陽性；而無鞭毛的細菌，由于受到肉湯中水分子的撞擊在原地小范圍內做往復的顫動，稱之布朗運動，其動力則為陰性。從而可以簡單間接反映細菌是否有鞭毛。也在細菌鑒定的過程中起到重要作用?！静襟E和方法】壓滴法1.接種環(huán)滅菌：先把接種環(huán)以15角在酒精燈外焰燒灼直到金屬絲燒紅，然后將接種環(huán)金屬絲柄也回旋通過火焰燒灼滅菌

4、。放涼待用。2.用接種環(huán)分別取號菌和號菌的菌懸液23環(huán)，置于潔凈載玻片兩端。（也可以分別取標本，分別觀察）（加蓋玻片好些）3.先用低倍鏡找到觀察部位，再換高倍鏡觀察細菌的運動(適當關小光圈使背景應稍暗些)?！窘Y果記錄】號菌動力：號菌動力：【注意事項】1.為觀察明顯的運動狀態(tài)，使用標本盡量新鮮。2.在操作過程中注意避免產(chǎn)生氣泡。3.不染色標本的觀察注意顯微鏡的光線調節(jié)，稍暗的視野有利于觀察。4.將用過的玻片放進玻片缸里，在開始下一個實驗。三、細菌涂片制備和革蘭染色【目的要求】1.掌握細菌涂片制作的方法。2.掌握細菌的革蘭染色原理和方法?！酒鞑暮驮噭?.菌種 號銅綠假單胞菌和號金黃色葡萄球菌菌2

5、培養(yǎng)基 血瓊脂平板（Blood Ager)3試劑 革蘭染色液4其他 潔凈的載玻片、生理鹽水、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡等?！静襟E和方法】1.細菌涂片制備（1）涂片：用已滅菌的接種環(huán)各取生理鹽水1環(huán)分別置于一張潔凈載玻片兩端，再將接種環(huán)滅菌，冷卻后在固體培養(yǎng)基BA上分別沾取號菌和號菌單個菌落少許，在玻片兩端鹽水中分別磨勻，菌膜大小一般以1cm2左右為宜，隨后將接種環(huán)在燒灼滅菌。(2)干燥：最好在室溫下自然干燥；或將標本面向上，置于酒精燈火焰16cm高處緩慢烘干，切不可在火焰上燒干。(3)固定：將上述已干的涂片面向上緩慢通過酒精燈火焰1次，自然冷卻，反復3次，等待染色。固定的目的殺死細菌；使菌體與玻片

6、粘附牢固，以免染色時脫落；使細菌的蛋白凝固，改變細菌對染料的通透性，使染料易于著色。2.革蘭染色法(1)原理a.等電點學說：G+菌等電點低（pH23）而G-菌等電點高（pH45），在同一pH條件下（培養(yǎng)基pH一般是呈中性或弱堿性),環(huán)境pH值均高于細菌的等電點，使細菌NH3+電離受抑制而易于COO-電離，使細菌帶負電荷。但是環(huán)境pH與G+菌的等電點差距大，故G+菌所帶負電荷較G-菌多，其更易與帶正電荷的結晶紫染料結合的牢固且不易脫色，從而G+菌被染成紫色。b.化學學說：G+菌含有大量的核糖核酸鎂鹽，與進入胞漿內的結晶紫及碘的復合物牢固結合，使已著色的細菌不易被95%乙醇脫色；而G-菌含此物質少

7、，故易被乙醇脫色，再被稀釋復紅（沙黃）著色染成紅色。c.滲透性學說：G+菌細胞壁結構較致密，肽聚糖層厚（1550層）并具有三維空間結構，脂質含量少，乙醇不易滲入脫色。而G-菌細胞壁結構較疏松，肽聚糖層?。?2層）且無三維結構，脂質含量多，乙醇溶解脂質后已滲入細胞內，使結晶紫和碘復合物被溶出而脫色。d.綜上所述：革蘭陽性菌被染成紫色； 革蘭陰性菌被染成紅色。(2)步驟（經(jīng)典）a.初染：在固定好并冷卻了的涂片上滴加結晶紫染液，染液的量最好覆蓋整個菌膜，染色1min，用細流水從玻片的一端把游離的染液洗去，然后輕輕甩干玻片。b.媒染：滴加盧戈（Lugol）碘液數(shù)滴，作用1min，用細流水沖洗，輕輕甩干

8、?？纱偈菇Y晶紫與細菌結合更牢固。c.脫色：滴加95%乙醇數(shù)滴，輕輕搖動玻片，使之均勻脫色，然后左手斜持玻片，右手再滴加乙醇，直到流下的乙醇呈無色為止，約0.51.0min，用細流水沖洗，輕輕甩干。d.復染：加稀釋復紅染液（或沙黃）數(shù)滴，染0.5min1.0min，用細流水沖洗，用吸水紙吸干多余水分，或自然干燥。（3）BASO快速染色步驟a.加龍膽紫液染色10s，之后水洗，甩干。b.加碘溶液染色10s，之后水洗，甩干。c.加脫色劑脫色1020s，之后水洗，甩干。d.加沙黃溶液復染10s，之后水洗，用吸水紙吸干水分。 革蘭染色經(jīng)典和快速試劑組成的區(qū)別 經(jīng)典 快速第1液 結晶紫和95%乙醇溶液 結晶

9、紫和95%乙醇溶液第2液 盧戈碘液 盧戈碘液第3液 95%乙醇 丙酮和95%乙醇溶液第4液 稀釋石碳酸復紅液 稀釋沙黃染液 制片 初染 媒染 脫色 復染 革蘭氏陽性菌，用符號“G+”或“GP” （Grams Positive）表示。 革蘭氏陰性菌，用符號“G”或“GN”（Grams Negative）表示。 【結果觀察】1.將上述染過色已干燥的涂片置于載物臺上，先用低倍鏡找到要觀察的視野，后滴加香柏油置油鏡下觀察，調大光圈使視野的光線相對強（將凹面鏡換成平面鏡）。細菌染成紫色為陽性，紅色為陰性。2.同時還可觀察細菌的形態(tài)、排列和大小等生物學特征。3.觀察完后油鏡鏡頭用擦鏡紙滴上乙醚脫油擦凈，顯微鏡放回原處。4.記錄號菌： 號菌：【注意事項】1.操作因素：涂片太厚或太薄，菌體分散不均勻，可影響染色結果。固定時菌體過分受熱。脫色時間要根據(jù)涂片厚薄靈活掌握。2.染液因素：防止染液蒸發(fā)改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后已失去媒染作用；涂片積水過多也會改變染液濃度；脫色劑以95%乙醇為好，濃度降低會減弱其脫色能力。3.細菌因素：細菌菌齡不同，染色結果有差異，如葡萄球菌幼齡菌染成紫色，而老齡菌被染成紅色。一般以1824h的培養(yǎng)物染色效果好。4.每次實驗完，值日生要把每一種染液瓶口用瓶蓋擰緊，以防止染液的揮發(fā)和污染?！靖锾m染色的意義】1.細菌