洛伐他汀檢測方案

1、HPLC檢測茶葉中的洛伐他汀1.洛伐他汀的結構2.性質性狀：白色結晶粉末；熔點：174.5；分子式：C24H36O5(M=404)；溶解性：易溶于氯仿、乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙醇、苯、堿性水溶液，不溶于正己烷、中性及酸性水溶液。3.洛伐他汀標準溶液的配置準確稱取洛伐他汀對照品 19.6mg，甲醇溶解后超聲助溶，置于 100mL 容量瓶中，再用甲醇稀釋定容，搖勻后得洛伐他汀標準液A。密封置于冰箱中貯存，備用。4.洛伐他汀標準曲線的繪制分別量取配置的洛伐他汀標準溶液A 0.5mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL 置 10mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，照高效液相色譜法

2、實驗，分別吸取以上稀釋溶液各 20L，經 0.45m 微孔濾膜過濾后，注入液相色譜儀，記錄相應的峰面積響應值，以洛伐他汀濃度為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制洛伐他汀標準曲線。5.洛伐他汀樣品溶液的制備準確稱取普洱茶茶葉樣品 1.0g，加入 20mL 乙酸乙酯超聲波浸提 10 分鐘后過濾，濾液中加入活性炭除色素，過濾后濃縮，濃縮液用 10mL 甲醇溶解，制成樣品溶液進行測定。6.洛伐他汀的檢測方法普洱茶中的洛伐他汀采用高效液相色譜法進行檢測。采用 C18色譜柱，流動相為甲醇:水=80:20，柱溫為 30，紫外檢測器波長為 237nm，將制備的樣品溶液以進樣量為 20L 進行分析。7.洛伐他汀樣液

3、提取優(yōu)化7.1溶劑浸提準確稱取普洱茶葉樣品 20g 于具塞錐形瓶中，加入 200mL 乙酸乙酯室溫浸提 24h，抽濾，濾液蒸干，殘渣加 50mL 甲醇溶解，甲醇溶液真空抽濾后加石油醚洗滌色素，至石油醚接近無色，甲醇溶液旋轉濃縮至 10mL 甲醇溶液進行測定。方法流程如圖 2-5。 7.2超聲波提取法準確稱取普洱茶茶葉樣品 1.0g，加入 20mL 乙酸乙酯超聲波浸提 10 分鐘后過濾，濾液中加入活性炭除色素，過濾后濃縮，濃縮液用 10mL 甲醇溶解，制成樣品溶液進行測定。方法流程如下圖 2-6。普洱茶中洛伐他汀超聲波提取劑的選擇準確稱取普洱茶茶葉樣品七份各 1.0g，分別加入乙酸乙酯，丙酮，苯

4、，乙酸丁酯，無水乙醇，氯仿各 20mL，使用超聲波清洗儀超聲波浸提 10 分鐘后過濾，濾液中加入活性炭除色素，過濾后濃縮，濃縮液用 10mL 甲醇溶解，制成樣品溶液進行分析。超聲波物料比的選擇準確稱取普洱茶茶葉樣品四份 1.0g，分別按 1:10，1:15，1:20，1:25，的物料比加入乙酸乙酯，使用超聲波清洗儀超聲波浸提 20 分鐘后過濾，濾液中加入活性炭除色素，過濾后濃縮，濃縮液用 10mL 甲醇溶解，制成樣品溶液進行分析。超聲波溫度的選擇準確稱取普洱茶茶葉樣品四份各1.0g，分別加入20mL乙酸乙酯，在不同的溫度下15，20，25，30使用超聲波清洗儀超聲波浸提10分鐘后過濾，濾液中加

5、入活性炭除色素，過濾后濃縮，濃縮液用10mL甲醇溶解，制成樣品溶液進行分析。超聲波提取時間的選擇準確稱取普洱茶茶葉樣品六份各1.0g，分別加入20mL乙酸乙酯，使用超聲波清洗儀超聲波分別浸提5，10，15，20，25，30分鐘后過濾，濾液中加入活性炭除色素，過濾后濃縮，濃縮液用10mL甲醇溶解，制成樣品溶液進行分析。 7.3洛伐他汀HPLC檢測條件的確定 流動相比例的選擇改變流動相流動相比例，甲醇：水=70:30，75:35，80:20，85:15，90:10，保持流速和柱溫不變，流速為1mL/min，柱溫為30，選擇不同流動相比例測定洛伐他汀的保留時間。 流速的選擇改變流速，0.5，0.8，

6、1.0mL/min，流動相比例和柱溫保持不變，流動相比例為甲醇水=80：20，柱溫為30通過改變流速來測定洛伐他汀的保留時間。柱溫的選擇通過設置不同的柱溫箱溫度25，28，30，流動相比例和流速保持不變，流動相比例為為甲醇水=80:2 0，流速為1mL/min來測定洛伐他汀的保留時間。 7.4洛伐他汀穩(wěn)定性研究洛伐他汀在甲醇溶液中的穩(wěn)定性研究分別準確量取配置的洛伐他汀標準溶液A置 10mL 量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得樣品溶液。一份保存在冰箱中，另一份室溫放置。取洛伐他汀樣品溶液參照 6所述方法檢測，每隔一段時間取樣一次，每次進樣 20L，測得峰面積，并計算其 RSD。洛伐他汀在乙

7、酸乙酯溶液中的穩(wěn)定性研究準確稱取洛伐他汀標準品 20mg，用乙酸乙酯定容至 100mL 容量瓶中，然后量取洛伐他汀乙酸乙酯溶液 2mL 置 10mL 量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得樣品溶液。一份保存在冰箱中，另一份室溫放置。所取洛伐他汀樣品溶液參照 6所述方法檢測，每隔一段時間進樣一次，每次 20L 測得峰面積，并計算其 RSD。8.洛伐他汀檢測條件的選擇8.1色譜相關參數甲醇:水（條件）： 75:25；80:20；85:15。流速：1.0ml/L。柱溫（）：25；28；30。8.2 提取參數提取溶劑的選擇：氯仿 丙酮 苯 乙醇 乙酸乙酯 乙酸丁酯。溶劑物料比的選擇：1:10；1:1

8、5；1:20；1:25。提取次數：第次；第次；第次；第次。9.相關結論看出普洱沱茶，普洱熟餅，普洱磚茶這些緊壓茶中洛伐他汀含量普遍高于普洱散茶。這可能是由于普洱緊壓茶是由普洱散茶經高溫蒸壓后制成的，而緊壓茶中有利于微生物的發(fā)酵活動。云南普洱茶渥堆中，滋味由濃強度變?yōu)榇己?，湯色由黃綠變?yōu)榧t褐，香氣由清鮮變?yōu)殛惔?。這一變化是渥堆過程中發(fā)水量、葉溫及微生物因子共同作用的結果。普洱生餅，茗門福豬生普，義犬茗旺生普洱，下關生沱等普洱生茶中均沒有檢測到洛伐他汀，而在其相應的渥堆發(fā)酵成的普洱熟茶中卻檢測到了洛伐他汀，義犬茗旺熟普洱中洛伐他汀含量高達 20.768kg/kg，并且在其他幾種普洱熟茶中檢測到的

9、洛伐他汀含量也不低，這很可能與曬青毛茶在渥堆過程中微生物作用，以及酶促反應有關，周紅杰，李家華等4研究指出普洱茶大生產中各種菌之間關系為，黑曲霉酵母青霉根霉灰綠曲霉細菌土曲霉白曲霉；而在普洱茶模擬試驗中黑曲霉酵母根霉青霉灰綠曲霉細菌土曲霉白曲霉；并且在滅菌試驗中黑曲霉酵母根霉青霉白曲霉土曲霉灰綠曲霉細菌。從以上三個不同處理比較分析可知，無論是大生產試驗、還是模擬試驗、滅菌試驗，黑曲霉數量始終處于優(yōu)勢地位，酵母菌的總數居次，細菌數目極少，沒有致病細菌。高藍，李浩明等57研究指出洛伐他汀由土曲霉和青霉發(fā)酵生產。普洱茶發(fā)酵過程中有少量土曲霉和青霉，土曲霉和青霉代謝可以產生洛伐他汀，這進一步證明了普洱

10、茶中的洛伐他汀的形成與加工工藝有關。同一地區(qū)大型茶廠普洱茶中洛伐他汀的含量也要高于私人作坊普洱茶中洛伐他汀的含量。紅茶是先發(fā)酵后殺青，屬前發(fā)酵茶，而普洱茶則是先殺青后發(fā)酵，屬后發(fā)酵茶62。殺青的主要作用是鈍化茶鮮葉中的酶促作用，抑制茶多酚的氧化，這可以為后期發(fā)酵過程中微生物活動提供豐富的養(yǎng)料。同時殺青可以去除低沸點芳香物質和部分水分，這就可能改變茶葉內部的 pH 值，改變微生物的活動條件，從而致使紅茶和普洱茶發(fā)酵過程中發(fā)酵菌種不同。茶葉的發(fā)酵通常是三種條件：濕熱條件，微生物參與，酶促氧化反應。紅茶的發(fā)酵是以酶促氧化為主，濕熱條件為輔。而熟普洱的發(fā)酵就復雜的多，堆子發(fā)酵時是以濕熱發(fā)酵為主，微生物

11、參與為輔，同時有少量的殘存氧化酶促反應。紅茶經發(fā)酵之后殺青干燥，制成成品發(fā)酵已經完成，不會繼續(xù)發(fā)酵。熟普洱在制成成品后仍會繼續(xù)發(fā)酵，并且在存儲過程中茶葉中各物質含量仍會變62目前，生產洛伐他汀所采用的微生物主要有三大類：青霉菌、紅曲霉和土曲霉，其中土曲霉是工業(yè)生產中最常用的菌種63。紅茶發(fā)酵過程中的微生物主要有酵母菌、真菌、細菌等三類微生物，這些微生物是影響紅茶品質的最主要微生物64，普洱茶發(fā)酵過程中的微生物有黑曲霉、酵母、青霉、根霉、灰綠曲霉、細菌、土曲霉、白曲霉等多種微生物4，可見在普洱茶發(fā)酵過程中存在可以代謝合成洛伐他汀的土曲霉。土曲霉發(fā)酵產生洛伐他汀時碳源和氮源至關重要，它們不僅決定菌

12、絲的生長和洛伐他汀的產量，還嚴重影響發(fā)酵工藝的調控63。土曲霉發(fā)酵生成洛伐他汀的碳源主要有乳糖、甘油、葡萄糖等物質。基于Lee Hendrickson73提出的洛伐他汀生物合成路線的推測，醋酸鹽、琥珀酸鹽和檸檬酸鹽對洛伐他汀發(fā)酵的影響也在研究。研究表明土曲霉和紅曲霉洛伐他汀分子中的氧原子除C-8位氧來源于空氣外，其他全部起源于乙酸79-83?？梢娨宜嵩诼宸ニ〉男纬蛇^程中有著極其重要的作用。土曲霉的代謝產物乙酸很有可能是洛伐他汀生物合成的原料。普洱茶中的洛伐他汀完全有可能是在普洱茶的后發(fā)酵過程中土曲霉作用的結果。HPLC 測定普洱茶中的洛伐他汀含量的最佳色譜條件為，采用 C18反相色譜柱，用甲醇和水做流動相，流動相比例為甲醇水=80 2 0，流速 1mL/min，紫外檢測波長 237nm，柱溫為 30，此方法檢出限為 4g/L，且洛伐他汀濃度在9.8g-78.4g/mL 范圍內呈良好的線性 R2=0.995；精密度、重復性良好；加樣回收率穩(wěn)定；溶劑成本低，出峰時間快，且操作簡便快捷。因此本法可作為洛伐他汀含量的測定方法。超聲波法提取普洱茶中的洛伐他汀在相同條件下是傳統浸提方法的 17倍多，并且提取時間短，提取效率高，樣品以及提