酵母菌液態(tài)深層通風發(fā)酵講義

1、酵母菌液態(tài)深層通風發(fā)酵、實驗目的1、了解通風攪拌罐的發(fā)酵過程2、學習發(fā)酵過程各生理指標的測定二、實驗器材1分光光度計2發(fā)酵罐罐體系統(tǒng)罐身：由硼硅玻璃和不銹鋼加工制成。密封件：機械密封、硅橡膠“ O型圈。罐蓋布局取樣放料口取樣回r 口液位電板pH電極接口接箱口消泡電班為度電極2。電極接口接地電極補料口三乾喬料口閥門系統(tǒng)示意圖（背面）控溫夾套控溫夾套由控溫夾套、1加熱器、2測溫電極、3水位電極等組成。滅菌罩滅菌罩（參見圖1）由不銹鋼罩體、AQ-安全閥、P2-壓力表、17測溫電極（3） 等組成。管閥系統(tǒng)管閥系統(tǒng)（參見圖1）由EWF冷卻水電磁閥、7冷凝器進水閥、W溢流水閥、 W2-排水排汽閥、S滅菌罩

2、進蒸汽閥、S2一夾套進蒸汽閥、25蒸汽回汽管、 G-氣路調節(jié)閥、不銹鋼管路、優(yōu)質膠管、接頭等組成。輔助設備：由空氣壓縮機、蒸汽發(fā)生器組成。輔助設備屬于選購設備系統(tǒng)安裝：發(fā)酵罐應安裝在通風良好、空氣潔凈的房間，房間內應經常消毒。將罐體與控制電箱放置在平整桌面上，調節(jié)支撐腳確保水平與垂直度。連接進水、排水、空氣進氣管，并用卡箍固定挾緊，進水端要加水過濾器。將攪拌電機、PH電極、DO電極、泡沫電極、測溫電極、水位電極、加熱器、 電磁閥的電纜接頭連接好。接插好黃綠接地線，保證罐體有良好的接地!2.3發(fā)酵罐電氣系統(tǒng)（圖3）開機和關機（參見圖3）在確認發(fā)酵罐管路部分和電氣部分連接無誤后，方可開機進行操作！

3、開機順序：接通電源，待控制柜上紅色電源指示燈亮后再打開控制柜右下方 的紅色電源開關，（注意：紅色電源指示燈亮后表示控制柜的接線柱電源端子已 有電，千萬不可用手觸摸該接線端子，以防發(fā)生觸電事故?。┤缓蟠蜷_控制柜右 側的工控機電源開關啟動工控機；進入windows桌面后點擊組態(tài)王程序并繼續(xù)進 入發(fā)酵程序后暫停操作；（關于發(fā)酵控制程序的操作請另見發(fā)酵控制系統(tǒng)操作說 明書）。根據(jù)實際需要分別打開控制柜右側的攪拌電機、加熱器和蠕動泵、電磁 閥的電源開關；（工控機電源和攪拌電機、加熱器、蠕動泵包括電磁閥的電源開 關是分開安裝的，如果不需要運行這些部件，則相應的電源開關可以關閉，在此 情況下，工控機仍可以開

4、機運行，但不能驅動執(zhí)行機構）然后繼續(xù)進行發(fā)酵控制 參數(shù)的設定，（關于發(fā)酵控制程序的設定請另見發(fā)酵控制系統(tǒng)操作說明書）。待 所有控制參數(shù)設定完畢并確認無誤后再根據(jù)要求選擇點擊各操作界面上的自動 或手動運行按鈕進入發(fā)酵培養(yǎng)。特別注意：攪拌電機的電源必須在發(fā)酵程序運行 前打開，否則可能會造成攪拌電機飛車，損毀攪拌系統(tǒng)。關機順序：關機時必須先點擊各操作界面上的停止按鈕， 確認所有控制項目全部 停止后再點擊返回按鈕回到主菜單界面退出發(fā)酵程序；繼續(xù)退出組態(tài)王程序后再退出windows,關閉工控機電源并關閉紅色電源開關，(此時控制柜上紅色電源 指示燈亮著，控制柜的接線柱電源端子仍然帶電)最后切斷電源，(此時

5、控制柜上紅色電源指示燈熄滅)。三、試劑1% 3, 5-二硝基水楊酸(DNS試劑：灑石酸鉀鈉100 g溶于400 mL蒸儲 水，加熱中依次加入 NaOH 5 g, 3, 5-二硝基水楊酸5 g ,苯酚1 g ,亞硫酸鈉 0.25 g ,攪拌至溶。冷卻后定容至500 mL,儲于棕色瓶室溫保存。10姍糖溶液NaOH 1mol/l(4)乙酸緩沖液(0.05mol/ml) pH5.0四、操作方法.滅菌準備工作將排水硅膠軟管裝在排水排氣口上。打開排水排汽閥，放盡控溫夾套內的剩余水。關閉溢水閥、冷凝器進水閥、滅菌罩進蒸汽閥、夾套進蒸汽閥、蒸汽回汽管堵 頭和進空氣閥。拔下泡沫電極、液位電極和頂蓋接地線的連接插

6、頭。取出pH DO電極進行校驗，校驗完畢后卸下備用。(該步驟在實罐滅菌時操 作)取出測溫電極。擰下冷凝器進、出水接頭。將進氣過濾器、尾氣過濾器、尾氣濾水瓶安裝到位。取樣放料裝置安裝就位。將補料瓶安裝上呼吸過濾器。打開蒸汽發(fā)生器準備提供蒸汽。.空罐滅菌第一步：裝上pH電極孔、DO電極孔、三針補料口的堵頭并擰緊。第二步：旋松攪拌電機固定螺栓，卸下電機連接電纜，取下電機，橫放在柔軟、 干燥桌面上。注意電機和電纜的連接口不能進水，以免發(fā)生短路！第三步：卸下溫度電極，擰下蒸汽回氣管堵頭，蓋上滅菌罩，擰緊固定螺絲，插 上測溫電極。第四步：點擊系統(tǒng)運行進入組態(tài)王發(fā)酵程序主菜單后選擇滅菌輔助程序，設置滅菌溫度

7、與滅菌時間，點擊開始按鈕進入滅菌程序運行。第五步：打開排水排氣閥，打開滅菌罩進蒸汽閥，然后緩緩打開蒸汽發(fā)生器的出 蒸汽總閥讓蒸汽不斷進入罐內，使罐體溫度不斷升高。操作時應密切注意滅菌罩 上的壓力表指示和控制箱上的溫度指示，保證壓力不超過0.15Mpa,溫度不超過130 Co第六步：當設定的滅菌時間到時，控制柜發(fā)出鳴叫報警，此時將蒸汽總閥和滅菌 罩進蒸汽閥關閉。第七步：當確認罐壓釋放完畢后，將排水排汽閥完全打開，排空夾套內的冷凝水。第八步：滅菌罩溫度下降到 90c時卸下滅菌罩的固定螺栓，小心取下滅菌罩， 擰上蒸汽回氣管堵頭，空消完成。.實罐滅菌空罐滅菌后，應盡快進行實罐滅菌。發(fā)酵罐倒入3.0L的

8、如下成分的培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20.0g/L蛋白凍5.0 g/LNa2HPO4.0 g/LMgSO40.5 g/LKH2PO1.0 g/LpH4.55.5第一步：裝上已校正好的pH DO電極并旋上保護蓋。打開排水排汽閥，關閉滅菌罩進蒸汽閥、冷水閥、冷凝器進水閥、進空氣閥、夾套溢流閥、擰上蒸汽回氣 管堵頭。第二步：放入發(fā)酵培養(yǎng)液，檢查并擰緊頂蓋上所有的連接口，不得有泄漏。第三步：連接好尾氣過濾瓶并在尾氣排放口接上呼吸過濾器，將進氣口、取樣口、 補料口各膠管彎曲夾緊。第四步：打開工控機電源開關，選擇滅菌輔助程序，打開攪拌電機電源開關，設 置滅菌溫度與滅菌時間。第五步：打開排水排汽閥，緩緩打開蒸

9、汽發(fā)生器的蒸汽總閥，打開夾套進蒸汽閥， 讓蒸氣不斷進入夾套內，適時調整排水排汽閥和夾套進蒸汽閥， 使罐體溫度不斷 升高。直到升到120c （注意對應壓力）。操作時應密切注意滅菌罩上的壓力表 指示和控制箱上的溫度指示，保證壓力不超過 0.2Mpa,溫度不超過130C。第六步：當設定的滅菌時間到時切斷蒸汽發(fā)生器的電源。等蒸汽壓力釋放，罐體自然冷卻。當罐內溫度降到 90c以下，確認罐內壓力釋放完畢后，將排水排汽 閥完全打開，排空夾套內的冷凝水。卸下測溫電極的插頭，取下滅菌罩，擰上蒸汽回氣管堵頭，將排水排汽閥關閉，實消完成。.培養(yǎng)準備工作第一步：關閉排水排汽閥，打開溢流水閥，連接好冷凝器進出水管并擰緊

10、。第二步：關閉氣路調節(jié)閥，連接空氣壓縮機與發(fā)酵罐的進氣端。第三步：調整壓力調節(jié)閥（空壓機端）將壓力調整至 0.1-0.15MPa。第四步：將進氣過濾器與壓力表用專用氣管連接并用喉箍箍緊。第五步：開氣路調節(jié)閥，然后松開進氣、尾氣口膠管夾頭，將氣量調節(jié)至工藝所 需的流量。第六步：安裝好攪拌電機和頂蓋接地線。第七步：插入測溫電極；取下 DO pH電極上的保護蓋；連接pH電極、DOfe極、 泡沫電極和電機的連接電纜。第八步：進入發(fā)酵程序，設置運行參數(shù)，打開需要運行的攪拌電機、加熱器、電 磁閥、蠕動泵的電源開關，點擊各運行界面的自動或手動按鈕進入發(fā)酵培養(yǎng)。接種培養(yǎng)第一步：準備好的種子液300ml。第二步

11、：酒精盤內放入無水酒精或酒精棉， 點燃后安放于接種口，適當加大通氣 量或減小尾氣流量。第三步：打開接種蓋，將其放入干凈器皿中。第四步：將菌種瓶口放在火焰上燒一下，并在火焰上拔下瓶塞將菌種倒入發(fā)酵罐第五步：將接種蓋放在火焰上燒一下，蓋上接種蓋。第六步：按工藝要求恢復正常的罐壓和通氣量。5檢測在發(fā)酵過程中有pH電極、溶氧電極在線記錄發(fā)酵情況；發(fā)酵前后通過取樣在660nm或者下檢測發(fā)酵液中細菌濃度的變化；總糖測定：總糖標準曲線制作：顯色液制備：將50ml濃硫酸緩緩加入10ml水中冷卻至室溫，加入0.6g苯酚晶體攪拌使 其溶解配成顯色液。標準葡萄糖溶液制備：各配置 0.1 mg/ml、0.15 mg/

12、ml、0.2 mg/ml、0.25 mg/ml、0.3 mg/ml 葡萄 糖溶液。各取上述葡萄糖濃度溶液1ml,分別加5.00ml顯色液，震蕩混勻。置于沸水浴中 保溫3035min,取出，放在冷水浴中，冷卻至室溫。與 4 9 0 n m 處測定其吸 光度值，將O而為縱坐標與葡萄糖濃度為橫坐標做圖。樣品測定：取1.00ml的待測樣品于容量瓶中稀釋適當倍數(shù)， 再從中取1ml,加入5.00ml 顯色液，震蕩混勻。置于沸水浴中保溫 3035min,取出，放在冷水+浴中，冷 卻至室溫。與490 n m處測定其吸光度值。所測得的O曲回歸上述標準曲線，計 算得出發(fā)酵液總糖含量。蔗糖酶產量測定收集發(fā)酵液，離心

13、，收集細胞，經過醋酸緩沖液兩次洗滌，超聲波破碎。離 心收集上精液。表1酶液的酶活力比色管號1234酶液1 mL1 mL1 mL1 mL醋酸 buffer pH52mL1.8 mL1 mL1 mL1 mol/L NaOH1 mL000蔗 糖溶(0.2mol/L)(ml)0.2mL0.2 mL0.2 mL0.2 mL37c準確反應10 min1 mol/L NaOH0mL1 mL1 mL1 mL水楊酸試劑2 mL2 mL2 mL2 mL沸水浴精確反應5 min,冷卻后te谷至25 mLA540緩沖液配制溶液pH緩沖試劑體積ml緩沖試劑體積ml4.00.2mol/L 乙酸鈉1.800.2mol/L 乙酸8.205.00.2mol/L 乙酸鈉7.000.2mol/L 乙酸3.006.00.2mol/L 乙酸鈉9.500.2mol/L 乙酸0.507.00.2mol/L 磷酸氫二鈉6.100.2mol/L磷酸二氫鈉3.90葡萄糖標準曲線的制作2 口 呂勺操作空白標準葡萄糖濃度梯度012345葡萄糖標準液(ml)(1mg/L)0.20.40.60.81.0蒸儲水(ml)2.01.81.61.41.21.0DNSU齊1J (ml)各2.0反應