蛋白使用常見問題

1、蛋白使用常見問題1、蛋白為什么要凍干？?jī)龈蓪?duì)蛋白的影響有哪些？答：蛋白質(zhì)對(duì)熱敏感，凍干能使絕大部分蛋白質(zhì)的活性保留下來，提高蛋白的穩(wěn)定性并延長(zhǎng)保存時(shí)間， 同時(shí)降低運(yùn)費(fèi)。凍干有可能會(huì)造成蛋白的活性部分損失，聚集和其它變性問題。但可以通過添加保護(hù)劑（穩(wěn)定劑，添 加劑，輔料）和控制凍干的各種條件來盡可能降低這些負(fù)面的影響。溫馨提示：武漢華美提供的蛋白產(chǎn)品一般為凍干粉，它們?cè)谑覝貤l件下非常穩(wěn)定（至少1個(gè)月）。盡管 如此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20口，以確保蛋白100%的活性。2、凍干前為什么向蛋白溶液中加保護(hù)劑？ 一般凍干保護(hù)劑有哪幾種？你們的產(chǎn)品通常加的保護(hù)劑是什么？答：保護(hù)劑是用

2、來在凍干和儲(chǔ)存過程中保護(hù)蛋白的。常用的保護(hù)劑或穩(wěn)定劑有糖類，多元醇，聚合物， 表面活性劑，某些蛋白和氨基酸等。我們通常加8% （質(zhì)量比體積）的海藻糖和甘露醇作為凍干保護(hù) 齊U。海藻糖可明顯阻止蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變以及凍干過程中蛋白質(zhì)的伸展和聚集；甘露醇也是一種普 遍應(yīng)用的凍干保護(hù)劑和填充劑，可以降低某些蛋白的凍干后聚集情況。溫馨提示：對(duì)于大多數(shù)蛋白，重懸后在4口僅能短期保存（約1周）。如想長(zhǎng)期保存，請(qǐng)先配制成稀釋液 （其中必須含有載體蛋白，如0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS），然后分裝凍存于-20oC或-80oC。一定要避免反復(fù)凍融，因每次凍融均會(huì)引起蛋白的部分失活。3、為什么我的

3、管內(nèi)幾乎看不見蛋白產(chǎn)品？答：武漢華美的蛋白產(chǎn)品中不含載體蛋白或其它添加物（如牛血清白蛋白（BSA），人血清白蛋白（HSA） 和蔗糖等，并以最低含鹽量的溶液進(jìn)行凍干時(shí)，常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干 過程中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。溫馨提示：在打開管蓋前，我們建議您在小離心機(jī)中快速離心20-30秒，使附著在管蓋或管壁上的蛋 白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準(zhǔn)確無誤，雖然有時(shí)您無法看到蛋白粉末， 但管中的蛋白含量仍是非常精確的。4、應(yīng)如何確定細(xì)胞因子的種屬交叉活性?答：1）除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子對(duì)小鼠細(xì)胞均有活性。2）許多小鼠細(xì)胞因子也

4、可作用于人類 細(xì)胞，但比活性可能低于對(duì)應(yīng)的人類細(xì)胞因子。3） IL-7等為數(shù)不多的人類細(xì)胞因子作用于小鼠細(xì)胞時(shí)比對(duì) 應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子活性更強(qiáng)。4)干擾素，GM-CSF,IL-3和IL-4等細(xì)胞因子種屬特異，對(duì)非同源細(xì)胞幾乎 沒有活性。5)相反，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守，在不同動(dòng)物種屬 細(xì)胞上均具有很好的活性。5、應(yīng)如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品？第1步：開蓋前離心試劑管。凍干粉在運(yùn)輸過程中可能會(huì)因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以 在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。一 般需要3000-3

5、500rpm離心5min，效果良好。第2步：用無菌水重懸至0.1-1.0mg/ml，不可振蕩。這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉。蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離 子強(qiáng)度。產(chǎn)品說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解 液的pH值和離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者 根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。一定要溶解到指定的濃度。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說明書上所 標(biāo)明的濃度范圍，一般為0.1-1.

6、0mg/ml。但這一濃度范圍對(duì)于不同的重組蛋白是不同的。高于或低于該濃 度范圍時(shí)細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超 過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集 (aggregation)，最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。一定不能振蕩(vortex)。這里所說的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。請(qǐng)用放至室溫的緩沖液作為溶劑。 加緩沖液后，蓋好瓶塞，輕輕用手翻轉(zhuǎn)瓶子或把瓶子放在一個(gè)緩慢搖擺的搖床上。這樣做來保證緩沖液能 夠接觸到瓶子的整個(gè)內(nèi)壁。讓瓶子在室溫放置至少10- 15分鐘，然后可以

7、進(jìn)行分裝或使用。第3步：該重懸液在2-8oC最長(zhǎng)可保存1周。用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在 2-8oC，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性最長(zhǎng)可保持1周。這對(duì)一個(gè)周期為 5-7天的實(shí)驗(yàn)，如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞 因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。其實(shí)，說明書上推薦的濃度對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)來講是比較高的。所以用戶通常會(huì)將該溶液進(jìn)一步稀釋后 再放在4oC保存，待1周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進(jìn) 行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子

8、或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組 蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。第4步：如要長(zhǎng)期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進(jìn)一步 稀釋，然后分裝凍存于-20oC至-80oC。如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對(duì)細(xì)胞因子或重組 蛋白進(jìn)行長(zhǎng)期保存。方法是：將巳重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1%BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS（胎牛血清），5%HSA（人血清白蛋白）的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20oC至 -80oC,即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為 任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋