應(yīng)用生物化學(xué)5-蛋白質(zhì)組學(xué)-2-DE

1、蛋白質(zhì)組學(xué)-雙向電泳(Proteomics-2DE) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院One Genome Many ProteomesOne Genome Many Proteomes卵 毛蚴 母胞蚴 子胞蚴 成蟲 童蟲 尾蚴 （人、牛、鼠等）（釘螺）（釘螺）Central dogmaDNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制翻譯中心法則基因表達(dá)調(diào)控From Genes to ProteinsSequence databasesWhat could happen+Gene ExpressiondatabasesWhat would happenProtein Expressiondatabases+What i

2、s happening蛋白質(zhì)組(proteome)是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個(gè)詞的雜合,意指proteins expressed by a genome，即“一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。 1. Concept 在人類基因組計(jì)劃中大約有30,000個(gè)基因被鑒定出來。一個(gè)基因=平均4個(gè)左右的剪接變異體，約120,000或更多的獨(dú)立蛋白。+翻譯后修飾和蛋白相互作用，蛋白質(zhì)組比基因組復(fù)雜10倍以上。 1. Concept Proteomics 指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)

3、，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞或組織內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。 生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得2. 雙向電泳的實(shí)驗(yàn)原理雙向電泳在第一向分離中蛋白質(zhì)先按其等電點(diǎn)分開（isoelectric point pI值）。pI值就是使蛋白質(zhì)不帶凈電荷，且在電場(chǎng)中不發(fā)生遷移的特定pH值。這項(xiàng)將蛋白

4、質(zhì)按其等電點(diǎn)分離的技術(shù)稱為等電聚焦（IEF）。2. 雙向電泳的實(shí)驗(yàn)原理 雙向電泳的第二向電泳是在第一向垂直方向上進(jìn)行SDS分離。 +pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10第一向：等電聚焦+pH 3pH 7.5pH10pH 3pH 7.5pH10chargesize第二向：SDS電泳pIM.Wt.2-D ElectrophoresisPH 3PH 10Intuitive Spot Detection Wizard差別分析示意圖Sample 1 aSample 1 bSample 1 cPresent in (

5、a) and (c) not (b)Present only in (a)Stronger in (b) than (a) or (c)First Dimension IEFSecond Dimension SDSGel StainingSpot ExcisionImaging and Analysis雙向電泳流程Sample PreparationExcision / digestionDigestion ProtocolDe-stain50mM ammonium bicarbonate / 50% acetonitrileReduce10mM dithiothreitol in 100mM

6、 ammonium bicarbonate, 30 minutesAlkylate55mM iodoacetamide in 100mM ammonium bicarbonate, 20 minutesWash100mM ammontium bicarbonate（重碳酸銨）DehydrateAcetonitrile（乙晴）Digest6ng/uL Trypsin in 50 mM ammonium bicarbonate (25uL) , 5 hours at 37C全自動(dòng)蛋白切取儀Mass spectrometry50007500100001250015000025507510002550

7、751000255075100025507510002550751000255075100500075001000012500ControlControlControlTreated15000TreatedTreatedMALDI-TOF-MS A Road Map to Discovery肽指紋圖譜搜庫(kù)AWPSGSAWPGYFRB1 1 MAERRVPFTF LTSPSWEPFR DWYHGSRLFD QSFGMPHIPE DWYKWPSGSA WPGYFRLLPS 61 ESALLPAPGS PYGRALSELS SGISEIRQSA DSWKVTLDVN HFAPEELVVK TKDNI

8、VEITG 121 KHEEKQDEHG FISRCFTRKY TLPPGVEATA VRSSLSPDGM LTVEAPLPKP AIQSSEITIP 181 VTVEAKKEEP AKKC說明：A顯示HSP27的肽指紋圖譜，其中匹配的肽段已標(biāo)注肽段質(zhì)量。B1-B4顯示HSP27其中一個(gè)肽段的串級(jí)肽序列圖譜，匹配序列以不同顏色顯示。C顯示HSP27的氨基酸序列，其中匹配的序列以下劃線標(biāo)出。LLPSESALLPAPGSPYGRB2VPFTFLTSPSWEPFRB33. 蛋白質(zhì)組學(xué)與疾病研究 通過測(cè)定體液和組織的蛋白質(zhì)組,我們可以尋找特異疾病的生物標(biāo)記,即疾病特異性蛋白(disease speci

9、fic proteins, DSPs)。 DSPs水平的變化對(duì)于疾病診斷、治療和判斷愈后具有重要意義,還可以成為研究藥物的藥理或毒理作用的靶點(diǎn)。疾病的蛋白質(zhì)組研究怎樣利用蛋白質(zhì)組學(xué)來開發(fā)藥物?差異表達(dá)的蛋白提取蛋白質(zhì),進(jìn)行結(jié)晶處理用x射線晶體衍射技術(shù)揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)能夠阻斷蛋白質(zhì)活性的藥物為疾病的預(yù)后、診斷、預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)，最終目標(biāo)是治療靶向藥物、合理設(shè)計(jì)藥物和早期“標(biāo)記”的鑒定。ProteomeProteomicsProtein進(jìn) 展各國(guó)政府支持，國(guó)際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：1996年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（Australia Proteome Analysis F

10、acility，APAF） 美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCI）投資1 000萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。NCI和FDA共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。英國(guó)建立三個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心對(duì)已完成或即將完成全基因組測(cè)序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。 Celera公司投資上億美元獨(dú)自啟動(dòng)了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的工作。 1997年召開了第一次國(guó)際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會(huì)議 1998年在美國(guó)舊金山召開了第二屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議 1999年1月在英國(guó)倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會(huì)議 我國(guó)也于1998年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在

11、中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì) 2003成立了中國(guó)人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO），并分別于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召開了中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，2004年10月在中國(guó)北京召開了第三屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議。 科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國(guó)“973”計(jì)劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。我國(guó)在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展。Central dogmaNormal geneexpressionmRNA經(jīng)翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表

12、達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome) 蛋白質(zhì)是基因功能的實(shí)施者，因此對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究將為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供直接的基礎(chǔ)。表達(dá)蛋白質(zhì)組(expressional)側(cè)重于研究一個(gè)細(xì)胞或組織中所有蛋白質(zhì)的表達(dá)狀況，包括表達(dá)參考圖譜的構(gòu)建、蛋白質(zhì)鑒定與數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建、蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)的測(cè)定、以及不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的比較分析等ProteomicsGenomicsTranscriptomicsSystems BiologyBioinformaticsStatisticsIntegrated view of the complex bio

13、logical systemsGel StainingFirst Dimension IEFSecond Dimension SDSImaging and AnalysisSpot ExcisionSample Preparation3. Proteomics Experimental Workflow蛋白質(zhì)分子在溶液中由于其末端氨基、末端羧基及側(cè)鏈的游離基團(tuán)而成為帶電顆粒，并可在電場(chǎng)內(nèi)移動(dòng)，其移動(dòng)方向取決于蛋白質(zhì)分子所帶靜電荷。不同蛋白質(zhì)分子根據(jù)其氨基酸組成及所在溶液的pH值，攜帶的靜電荷不盡相同，致使它們?cè)陔妶?chǎng)中的遷移率各異，從而達(dá)到分理的目的。（two-dimensional elect

14、rophoresis，2-DE） 將基因體或是由所取得的檢體利用蛋白質(zhì)體技術(shù)將其展現(xiàn)出來,可以對(duì)此生物功能獲得較全面性資訊.當(dāng)人類得到某種感染性疾病時(shí),利用被感染者的血液或病變細(xì)胞當(dāng)作檢體,以蛋白質(zhì)體方法分析與控制組間之差異性蛋白,篩選感染性微生物之標(biāo)的蛋白質(zhì),利用這些標(biāo)的蛋白質(zhì)探討其感染及代謝途徑或是制造出診斷性抗體,相信這將成為研究感染性疾病的新標(biāo)準(zhǔn)模式. 1-1診斷標(biāo)記 蛋白質(zhì)組學(xué)可以用來分析體液中特殊的蛋白,來解說在疾病診斷上的影響,有助於對(duì)疾病成因的了解,病程的控制與研究判斷預(yù)后的結(jié)果 .1-2 疾病診斷患有腦膜炎或是頭部外傷的患者,可以取其脊髓液,透過雙向電泳技術(shù)來鑒定蛋白質(zhì)型態(tài)

15、患有呼吸窘迫的病人,因其胸腔充滿液體而壓迫到氣管,可經(jīng)由胸腔穿刺吸出該液體後便可減輕患者的癥狀,再利用雙向電泳技術(shù)分析體液的成分 患有快速癡呆癥者,已在其脊髓液中,檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種不正常的蛋白 (命名為 130 和 131),最近被確定為 Tau g chain,此為臨床上 CJD 所特有的病征. 蛋白質(zhì)體學(xué)的研究也可以幫助我們?nèi)ふ倚碌募膊≈笜?biāo),相信在不久的將來將有助於監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)程,更進(jìn)一步有助於疾病的治療 1-3 新的疾病指標(biāo) 擴(kuò)大性心肌病變(Dilated cardiomyopathy, DCM )是一種嚴(yán)重的心臟疾病,也是現(xiàn)代繁 忙的都市人經(jīng)常易患的疾病,最后將導(dǎo)致心臟失去功能;病人通常

16、都只能期待換心以維持生命. 運(yùn)用蛋白質(zhì)體的方法已經(jīng)鑒定出心肌中150種蛋白質(zhì),比較后發(fā)現(xiàn)有25個(gè)蛋白質(zhì)有明顯的差異;經(jīng)由這些已確認(rèn)的蛋白質(zhì)資料庫(kù)與病人(或高危險(xiǎn)群)的蛋白質(zhì)做比對(duì),或許可以在疾病產(chǎn)生初期達(dá)到早期預(yù)防的目的.心血管疾病 肺癌是最具腫瘤性 (oncological) 的疾病之一.臨床上肺癌的診斷往往已屬晚期.直至目前為止,并無有效的治療方案可得.所以任何有助於肺癌診斷或預(yù)後的發(fā)展都是有助於肺癌的治療方針的. 因此,許多科學(xué)家致力于以雙向電泳技術(shù)研究肺癌.在分析組織病理學(xué)上不同種類的肺癌細(xì)胞時(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同組織病理類型細(xì)胞體會(huì)有不同的蛋白質(zhì)表現(xiàn)圖譜. 另外,發(fā)現(xiàn)有一種專一性的蛋白質(zhì)僅

17、會(huì)出現(xiàn)在原發(fā)性肺腺癌上.例用此技術(shù)將可有效地鑒定出新的腫瘤標(biāo)志 (tumor marker),在鑒別診斷麟狀上皮細(xì)胞肺癌與腺癌時(shí)有相當(dāng)大的助益. 肺癌 人類的腎臟癌是較少見的癌癥,其中源自於近端腎小管上皮細(xì)胞的腎細(xì)胞癌大約占成人惡性腫瘤的3 %.但如同許多實(shí)質(zhì)性腫瘤般,腎細(xì)胞癌發(fā)現(xiàn)時(shí)期均屬癌癥末期,外科手術(shù)已難治愈的階段.并且無適當(dāng)?shù)哪[瘤標(biāo)志可參考. 科學(xué)家在用雙向電泳技術(shù)研究腎臟癌組織的研究中發(fā)現(xiàn)有四種蛋白質(zhì)的表現(xiàn)在腎癌細(xì)胞中會(huì)消失. 雖然該研究沒有發(fā)現(xiàn)特定的標(biāo)志蛋白質(zhì).但尚有許多可能與該癌癥發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)仍待被鑒定.腎臟癌在比較人類正常乳房組織與惡性乳房癌的蛋白質(zhì)分布中,發(fā)現(xiàn)兩者之間有專

18、一性的蛋白質(zhì)差異存在.在腫瘤細(xì)胞中,至少有 22 種蛋白質(zhì)會(huì)不正常的增加,一種蛋白質(zhì)則會(huì)減少.另外也發(fā)現(xiàn)到某些特定的蛋白質(zhì)的表現(xiàn)與 estrogen 與 progesterone 接受器之間有相關(guān)連性.乳癌 結(jié)腸癌是一種常見的癌癥.利用雙向電泳與免疫轉(zhuǎn)漬技術(shù),分析自人類結(jié)腸癌細(xì)胞粗萃取蛋白質(zhì)中分離出的一系列蛋白質(zhì).并將有意義之蛋白質(zhì)點(diǎn)切割出,進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析以鑒定這些蛋白質(zhì) 結(jié)果發(fā)現(xiàn) hsp 70 酸性的 isoforms 在結(jié)腸息肉 (polypous) 與惡性組織 (malignant tissues) 中的表現(xiàn)不論是在量上或質(zhì)上均有相當(dāng)?shù)牟町?此外在慢性發(fā)炎性腸炎的黏膜或 Crohns 腸炎組織中