DNA的復(fù)制多媒體課件

1、 分子生物學(xué)The replication of DNA 第五講 DNA的復(fù)制 一、DNA的復(fù)制 二、RNA的反轉(zhuǎn)錄 三、DNA的轉(zhuǎn)座 脫氧核糖核酸（DNA）是生物界遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物有機(jī)體的遺傳特征以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序即遺傳信息。在細(xì)胞分裂前通過(guò)DNA的復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代。在后代的個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，以執(zhí)行各種生命功能。使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀，這種遺傳信息的傳遞方向，是從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)，即所謂的生物學(xué)“中心法則”。80年代以后，在某些致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)遺傳信息也存在于

2、RNA分子中，由RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA。這個(gè)中心法則加入了新的內(nèi)容。這也就是我們前面提到過(guò)的，目前被生物界認(rèn)可的遺傳信息傳遞的中心法則。 復(fù)制轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯DNARNAPRO生理功能遺傳信息傳遞的中心法則第五講 DNA的復(fù)制（一）、DNA的復(fù)制（二）、復(fù)制的起始階段（三）、DNA復(fù)制的延長(zhǎng)階段以及參與的 酶和蛋白質(zhì)分子 （四）、DNA復(fù)制的終止階段（五）、復(fù)制的幾種主要方式（六）、真核生物復(fù)制DNA復(fù)制（the Replication of DNA）親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈 DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補(bǔ)配對(duì)的游離的dNTP, 合成

3、出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過(guò)程。 （一）、DNA的復(fù)制 1、DNA半保留復(fù)制的機(jī)理 2、DNA的半不連續(xù)復(fù)制 1、DNA半保留復(fù)制的機(jī)理Semi-ConservationReplicationDNA作為遺傳物質(zhì)的基本特點(diǎn)就是在細(xì)胞分裂前進(jìn)行準(zhǔn)確的自我復(fù)制，使DNA的量成倍增加，這是細(xì)胞分裂的物質(zhì)基礎(chǔ)。1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，模型指出，DNA分子由兩條多核苷酸鏈組成，兩條鏈的堿基配對(duì)規(guī)則：G只能與C配對(duì)，A只能與T配對(duì)，以氫鍵相連，所以兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，一條鏈上的核苷酸排列順序決定了另一條鏈上的核苷酸排列順序。就是說(shuō)，DNA分子的每一條鏈都

4、含有合成它的互補(bǔ)鏈所需的全部信息。 這就說(shuō)明DNA的復(fù)制是由原來(lái)存在的分子為模板來(lái)合成新的鏈。曾經(jīng)有許多關(guān)于DNA復(fù)制方式的學(xué)說(shuō)，包括半保留復(fù)制，全保留復(fù)制以及分散復(fù)制等。Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)就推測(cè)，DNA在復(fù)制時(shí)首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂開(kāi)，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。Three replication hypotheses1958年Maselson和Stahl利用氮標(biāo)記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制。他們將大腸桿菌放在含有N15標(biāo)

5、記的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到N15 DNA。然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含有N14標(biāo)記的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)不同代數(shù)時(shí)，收集細(xì)菌，裂解細(xì)胞，用氯化銫密度梯度離心法觀察DNA所處的位置。由于N15標(biāo)記的DNA的密度比普通DNA的密度大，在氯化銫密度梯度離心時(shí)，兩種密度不同的DNA分布在不同的區(qū)帶。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在全部由N15標(biāo)記的培養(yǎng)基中得到的N15DNA顯示為一條重密度帶，位于離心管的管底。當(dāng)轉(zhuǎn)入N14標(biāo)記的培養(yǎng)基中繁殖后第一代，得到了一條中密度帶，這是N15DNA和N14DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個(gè)區(qū)帶，這表明它們分別為N14DNA分子 和N14N15DNA雜合分子。隨著以后在N14

6、培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強(qiáng)，而中密度帶逐漸減弱，離心結(jié)束從管底到管口，CsCL溶液密度，不同重量的DNA分子就停留在于其相當(dāng)?shù)腃sCL密度處，在紫外光可以看到DNA分子形成的區(qū)帶。為了證實(shí)第一代雜交分子確實(shí)是一半N15DNA一半N14DNA：將這種雜交分子經(jīng)加熱變性，對(duì)于變性前后的DNA分別進(jìn)行CsCL密度梯度離心。結(jié)果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶（N15DNA）和低密度帶（N14DNA）。它們的實(shí)驗(yàn)只有用半保留復(fù)制的理論才能得到圓滿的解釋。 (CsCl gradient centrifuge) N15 N14 DNASemi-Conservati

7、onReplicationM. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.1、DNA半保留復(fù)制的證據(jù) 模板：能提供合成一條互補(bǔ)鏈所需要精確信息的核酸鏈。 2、DNA的半不連續(xù)復(fù)制 （semi-discontinuous eplication） 在體內(nèi)，DNA的兩條鏈都能作為模板，同時(shí)合成出兩條新的互補(bǔ)鏈。由于DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，一條鏈的走向?yàn)?3，另一條鏈為35。但是所有已知DNA聚合酶的合成方向都是53，而不是35。這就很難說(shuō)明，DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈如何能夠同時(shí)作為模板合成其互補(bǔ)鏈。為了解釋這一現(xiàn)象，日本學(xué)者崗崎提出了半不連

8、續(xù)復(fù)制模型。 。 3535OK !How ?53531968年，崗崎用3H脫氧胸苷短時(shí)間標(biāo)記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心法得到了許多3H 標(biāo)記的，后人稱為崗崎片斷的DNA。延長(zhǎng)標(biāo)記時(shí)間后，崗崎片度可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腄NA鏈，因此，這些片斷必然是復(fù)制過(guò)程的中間產(chǎn)物。但是岡崎等最初不能確定DNA鏈的不連續(xù)只發(fā)生在一條鏈上還是兩條鏈都如此。對(duì)崗崎片斷進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果測(cè)得的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)超過(guò)新合成DNA的一半，似乎兩條鏈都是不連續(xù)的。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，這是由于尿嘧啶代替胸腺嘧啶摻入DNA造成的。DNA中的尿嘧啶可被尿嘧啶DNA-糖苷酶切除，隨后該處的磷酸二脂鍵斷裂，一些核苷酸被水解，造成一個(gè)缺口，最后缺口空隙被填補(bǔ)

9、和修復(fù)，在此過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生一些類似崗崎片斷的DNA片斷。dUTP : dTTP = 1 ：300 in cell -A-T-G -C-AUGUdut gene dUTPase 少數(shù)dUTP DNA 中不能有U ?-A-T-突變頻率 = 1/1200 ?。?A- -A- -U- - - Ungase ungU尿嘧啶-N-糖基酶 UUdenature dump fragment 1200base Okazaki fragment ung dump fragment longer dut dump fragment shorterAA當(dāng)用缺乏糖苷酶的大腸桿菌變異株（ung-進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，尿嘧啶不再被切

10、除。）此時(shí)，新合成的DNA有一半放射性標(biāo)記出現(xiàn)于崗崎片斷中，另一股直接進(jìn)入大的片斷。由此可見(jiàn)，當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)的，另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的，因此稱為半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuous replication） 。前導(dǎo)鏈(leading strand)：以復(fù)制叉向前移動(dòng)的方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，一條模板鏈?zhǔn)?5走向，在其上DNA能以53方向連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈。 滯后鏈(lagging strand)：另一條模板鏈?zhǔn)?3走向，在其上DNA也是從53方向合成，但是與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，所以隨著復(fù)制叉的移動(dòng)，形成許多不連續(xù)的片斷，最后完成一條完整的DNA鏈，這條鏈稱為滯后鏈。DNA的半不

11、連續(xù)復(fù)制DNA復(fù)制的過(guò)程可以人為地劃分成3個(gè)階段:第一階段為DNA復(fù)制的起始階段，這個(gè)階段包括起始點(diǎn)，復(fù)制方向以及引發(fā)體的形成；第二階段為DNA鏈的延長(zhǎng)，包括前導(dǎo)鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補(bǔ)空缺及連接岡崎片段；第三階段為DNA復(fù)制的終止階段。DNA復(fù)制的整個(gè)過(guò)程中需要30多種酶及蛋白質(zhì)分子參加，我們將在DNA復(fù)制的各個(gè)階段著重介紹它們的作用。（二）、復(fù)制的起始階段 1、復(fù)制的起點(diǎn) 2、復(fù)制的方向 3、復(fù)制的速度 4、DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì) 1、復(fù)制的起點(diǎn)（origin of replication）很多實(shí)驗(yàn)都表明：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開(kāi)始的，這一部位

12、叫做復(fù)制起始點(diǎn)常用ori或o表示。細(xì)胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開(kāi)始就會(huì)連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細(xì)胞中全部基因組DNA的復(fù)制。復(fù)制子（The replicon ）：DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開(kāi)始直到終點(diǎn)為止，每個(gè)這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元。在原核生物中，每個(gè)DNA分子只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而只有一個(gè)復(fù)制子。而在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時(shí)開(kāi)始的，所以每個(gè)DNA分子上有許多個(gè)復(fù)制子。DNA復(fù)制起始點(diǎn)有結(jié)構(gòu)上的特殊性。例如：大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點(diǎn)Oric由422個(gè)核苷酸組成，其中有9個(gè)核苷酸或13個(gè)核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識(shí)別的位置，大腸桿菌染色體DNA是

13、環(huán)狀雙鏈DNA。DNA是環(huán)狀雙鏈DNA，它的復(fù)制是典型的型復(fù)制。從一個(gè)起點(diǎn)開(kāi)始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)兩個(gè)復(fù)制方向相遇時(shí)，復(fù)制就停止。二、復(fù)制的起始階段復(fù)制叉（ replication fork ）：DNA分子中正在進(jìn)行復(fù)制的分叉部位。它由兩條親代鏈及在其上新合成的子鏈構(gòu)成。 大多數(shù)生物體內(nèi)DNA的復(fù)制都是從復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始以雙向等速形式進(jìn)行。少數(shù)為雙向不等速或單向方式進(jìn)行復(fù)制。復(fù)制叉2、復(fù)制的方向（1）、定點(diǎn)開(kāi)始雙向復(fù)制（2）、定點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制（3）、兩點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制（1）、定點(diǎn)開(kāi)始雙向復(fù)制 這是原核生物和真核生物DNA復(fù)制最主要的形式，從一個(gè)特定位點(diǎn)解鏈，沿著兩個(gè)相反的方向各生長(zhǎng)出兩條鏈。

14、1、復(fù)制子（2）、定點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制 質(zhì)粒colE1是個(gè)典型的例子，復(fù)制從一個(gè)起始點(diǎn)開(kāi)始，以同一方向生長(zhǎng)出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制叉。（3）、兩點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制（3）、兩點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制 腺病毒DNA的復(fù)制是從2個(gè)起點(diǎn)開(kāi)始的，形成2個(gè)復(fù)制叉，各以一個(gè)單一方向復(fù)制出一條新鏈。（3）、兩點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制（3）、兩點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制3、復(fù)制的速度有雙向等速的，也有雙向不等速的。 4、DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì) （1）、DNA雙螺旋解旋（2）、引發(fā)體的形成 （1）、DNA雙螺旋解旋 DNA在復(fù)制時(shí)，其雙鏈?zhǔn)紫冉忾_(kāi)，形成復(fù)制叉?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些酶和蛋白質(zhì)能使DNA雙鏈變得易于解開(kāi)，或者可以使超螺旋分

15、子松弛。1）、單鏈結(jié)合蛋白（SSB） 2）、 DNA解鏈酶（DNA helicase） 3）、DNA的解鏈過(guò)程 單鏈結(jié)合蛋白（SSB） 其作用是保證解鏈酶解開(kāi)的單鏈在復(fù)制完成前保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán).DNA解鏈酶（DNA helicase）DNA解鏈酶能通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA。它分解ATP的活性依賴于單鏈DNA的存在。如果雙鏈DNA中有單鏈末端或切口，則DNA解鏈酶可以首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動(dòng)。大部分DNA解鏈酶可沿滯后鏈模板的53方向并隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，只有另一種解鏈酶（Rep蛋白）是沿著前導(dǎo)鏈模板的3

16、5方向移動(dòng)。因此推測(cè)Rep蛋白和特定DNA解鏈酶分別在DNA的兩條鏈上協(xié)同作用，解開(kāi)雙鏈DNA。 DNA helicasesDNA的解鏈過(guò)程 DNA在未復(fù)制前處于超螺旋結(jié)構(gòu)，首先在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下解開(kāi)負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開(kāi)雙鏈。在解鏈過(guò)程中除了解鏈酶，還有一些特異蛋白，如DnaA，一旦局部解開(kāi)雙鏈，就必需有SSB蛋白來(lái)穩(wěn)定解開(kāi)的單鏈，以保證局部不會(huì)恢復(fù)成雙鏈。接著由引發(fā)酶等組成的引發(fā)體會(huì)馬上作用于兩條單鏈DNA。不論前導(dǎo)鏈還是滯后鏈都需要一段RNA引物以開(kāi)始子鏈DNA的合成。（2）、引發(fā)體（primosome）的形成DNA復(fù)制起始的關(guān)鍵步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前

17、導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開(kāi)始，隨從鏈DNA的合成也隨著開(kāi)始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，所以它的起始只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此為起點(diǎn)，一直合成下去，相對(duì)簡(jiǎn)單。而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由DnaB、DnaC和單鏈結(jié)合蛋白組成。（2）、引發(fā)體的形成1）、引物酶2）、引發(fā)體引物酶（primase）它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成，即引物的合成。引物：是短RNA片段，一般十幾個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸不等，它能與單鏈DNA配對(duì)，并且提供了一個(gè)自由的3OH末端，該末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個(gè)磷酸二脂鍵的位置。DNA聚

18、合酶需要一個(gè)3OH末端以起始復(fù)制（primase）引發(fā)體引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n,n,n,DnaB、C和I共同組成，只有這6種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起并與引發(fā)酶進(jìn)一步組裝成引發(fā)體才能發(fā)揮其功效。引發(fā)體像火車頭一樣在滯后鏈分叉的方向上漿進(jìn)，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)的引發(fā)生成滯后鏈的引物RNA短鏈，再由DNA聚合酶三作用合成DNA，直至遇到下一個(gè)引物或崗崎片斷為止。Primosome （consists of six proteins） PriA (dual role) displace SSB from S.S DNA and helicase DnaT required at prepriming stage

19、DnaB is central component, action with DnaC DnaC is central component, action with DnaB PriB function is unknown PriC function is unknown DnaG primasereplisome （2）、引發(fā)體的形成（三）、DNA復(fù)制的延長(zhǎng)階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子 1、DNA聚合反應(yīng)和DNA酶2、與超螺旋松馳有關(guān)的酶：DNA的復(fù)制DNA的復(fù)制實(shí)際上就是以DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，將有力的四種脫氧單核苷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP，簡(jiǎn)寫(xiě)為dNT

20、P）聚合成DNA的過(guò)程。 這是一個(gè)非常復(fù)雜的酶促反應(yīng)，需要許多酶和蛋白質(zhì)參與，現(xiàn)在分別敘述它們?cè)贒NA復(fù)制中作用。Substrates required for DNA synthesis+n1dATPn4dTTPn3dCTP+n2dGTP+DNA+Mg2+DNA聚合酶DNAdAMPdTMPdCMPdGMP(n1+n2+n3+n4)PPi1、DNA聚合反應(yīng)和DNA酶1957年，Arthur kornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶I，簡(jiǎn)寫(xiě)為DNA pol I。后來(lái)又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。實(shí)驗(yàn)證明大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要過(guò)程靠DNA polIII，而DNA p

21、olI和 DNA polII在DNA錯(cuò)配的修正和修復(fù)中起作用。這種酶的共同性質(zhì)是： 需要DNA模板，因此這類酶又稱為依賴DNA的DNA聚合酶。需要RNA或DNA作為引物，即DNA聚合酶不能從頭催化DNA的起始。催化dNTP加到生長(zhǎng)中的DNA鏈的3-OH末端，因而DNA的合成方向是53三種DNA聚合酶都是多功能酶，它們?cè)贒NA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程的不同階段發(fā)揮作用。1、DNA聚合反應(yīng)和DNA酶（1）、原核生物DNA聚合酶（2）、真核生物DNA聚合酶（1）、原核生物DNA聚合酶1）、DNA合酶I2）、DNA合酶3）、DNA合酶1）、DNA合酶I DNA pol I 是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD

22、。酶分子中含有一個(gè)Zn2，是聚合活性必須的。A、DNA聚合酶的53聚合活性 B、DNA聚合酶的35外切酶活性校對(duì)作用 C、DNA聚合酶的53外切酶活性切除修復(fù)作用A、DNA聚合酶的53聚合活性 這是DNA聚合酶最主要的活性，在引物RNA 3-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐個(gè)將核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3-OH與5-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被3-5外切酶活

23、性位點(diǎn)所識(shí)別并切除之。1）、DNA合酶I B、DNA聚合酶的35外切酶活性校對(duì)作用 這種酶活性的主要功能是從35方向識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。這種功能稱為校對(duì)功能，這是保證聚合作用的正確性不可缺少的，因此，對(duì)于DNA復(fù)制中極高的保真性至關(guān)重要。1）、DNA合酶I C、DNA聚合酶的53外切酶活性切除修復(fù)作用53外切酶活性就是從53方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5-脫氧核苷酸。這種酶活性只對(duì)DNA上配對(duì)部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是53。每次能切除10個(gè)核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中

24、可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段5末端DNA引物的去除依賴此種外切酶活性。 DNA pol I的53聚合活性和53外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從53方向移動(dòng)，這種反應(yīng)叫做缺刻平移，利用此反應(yīng)可在體外對(duì)DNA片段進(jìn)行放射性P標(biāo)記制成探針，進(jìn)行核酸的分子雜交實(shí)驗(yàn)。1）、DNA合酶I 1）、DNA合酶I 2）、DNA合酶 此酶分子量為120KD，每個(gè)細(xì)胞約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNa pol的5%。活性53聚合活性35外切活性而沒(méi)有53外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。3）、DNA合酶 這是在DNA復(fù)制過(guò)程中起主要作用的聚合酶，它是由一個(gè)多亞基組成的蛋白質(zhì)分子，其分子量

25、600kDa整個(gè)酶分子形成一個(gè)不對(duì)稱的二聚體，每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中只有1000個(gè)酶分子，但催化dNTP參入DNA鏈的速率卻是最快的，約為9000核苷酸/每分鐘/每個(gè)酶分子。這也證明DNa pol 是DNA復(fù)制過(guò)程中主要發(fā)揮作用的酶。在大腸桿菌染色體DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶全酶并不是單獨(dú)起作用的，而是與引發(fā)體等構(gòu)成一個(gè)復(fù)制體(replisome)。3）、DNA合酶 由于復(fù)制體的存在，先導(dǎo)鏈和隨從鏈可以同時(shí)復(fù)制。DNa pol 是由多亞基組成的不對(duì)稱二聚體，它可能同時(shí)負(fù)責(zé)先導(dǎo)鏈和隨從鏈的復(fù)制。隨著DNA pol向前移動(dòng)，先導(dǎo)鏈的合成逐漸延長(zhǎng)的同時(shí)，崗崎片段也在不斷延長(zhǎng)。當(dāng)崗崎片段合成到前一個(gè)片

26、段的5端時(shí)，這岡崎片段就釋放出來(lái)，由于復(fù)制叉向前移動(dòng)又可將另一部分隨從鏈的模板置換出來(lái)，由引發(fā)體合成新的引物，然后進(jìn)行新的崗崎片段的合成。由此模型不難看出：隨從鏈的合成需要周期性的引發(fā)，因此其合成進(jìn)度總是與前導(dǎo)鏈相差一個(gè)崗崎片段的長(zhǎng)度。 崗崎片段完成后，其5端的RNA引物由DNa pol的53外切酶活性切除，由此造成的空隙再由DNA pol的53聚合活性催化dNTP得到填補(bǔ)。所以DNA的復(fù)制是在DNa pol和DNA pol互相配合下完成的。原核DNA聚合酶（E.coli)聚合酶聚合酶聚合酶5 3 聚合酶活性3 5 外切酶活性5 3外切酶活性作用+DNA損傷的修復(fù)和岡崎片段之間間隙的填補(bǔ)，實(shí)踐

27、上其產(chǎn)生的“缺口平移”（nick trans-lation）技術(shù)也用于分子雜交時(shí)的核酸分子探針的標(biāo)記+-DNA的修復(fù)+-DNA復(fù)制中子鏈的延長(zhǎng)，為主導(dǎo)聚合酶（2）、真核生物DNA聚合酶 1）、DNA聚合酶 2）、DNA聚合酶 3）、DNA聚合酶 2）、DNA聚合酶 它能以人工合成的多聚脫氧核糖核苷酸為模板，而以適當(dāng)?shù)墓丫勖撗鹾颂呛怂徭湠橐锖铣蒁NA。此酶活性水平穩(wěn)定，可能主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。 1）、DNA聚合酶 是真核生物的復(fù)制酶，它在細(xì)胞內(nèi)的活性變化與DNA復(fù)制有明顯的平行關(guān)系，在細(xì)胞分裂的S期達(dá)到高峰。 3）、DNA聚合酶 它能有效利用人工合成的多聚核糖核酸作為模板，以脫氧核

28、糖核酸鏈為引物合成DNA，但不是反轉(zhuǎn)錄酶。它在分裂細(xì)胞中的活性有明顯的變化，細(xì)胞進(jìn)入S期后，它活性升高2倍，然后回到正常水平。它可能在分裂細(xì)胞DNA復(fù)制調(diào)控方面起作用。2、與超螺旋松馳有關(guān)的酶 DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開(kāi)始向一個(gè)方向復(fù)制時(shí)，局部的DNA雙鏈必須打開(kāi)，主要靠解鏈酶的作用，打開(kāi)后的單鏈還需要單鏈結(jié)合蛋白與其結(jié)合，在復(fù)制叉向前移動(dòng)時(shí)造成其前方DNA分子所產(chǎn)生的正超螺旋，必須由拓?fù)洚悩?gòu)酶來(lái)解決。下面分別介紹它們的作用。拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)是一類改變DNA拓?fù)湫再|(zhì)的酶。在體外可催化DNA的各種拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)。而在生物體內(nèi)它們可能參與DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。在DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制叉

29、行進(jìn)的前方DNA分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓?fù)涿缚伤神Y超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進(jìn)及DNA的合成。DNA復(fù)制完成后，拓?fù)涿赣挚蓪NA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質(zhì)。 （四）、DNA復(fù)制的終止階段DNA在復(fù)制過(guò)程中，合成出的前導(dǎo)鏈為一條連續(xù)的長(zhǎng)鏈。隨從鏈則是由合成出許多相鄰的片段，在連接酶的催化下，連接成為一條長(zhǎng)鏈。連接作用是在連接酶催化下進(jìn)行的。連接酶(ligase)的作用是催化相鄰的DNA片段以3、5磷酸二酯鍵相連接。連接反應(yīng)中的能量來(lái)自ATP(或NAD)。連接酶先與ATP作用，以共價(jià)鍵相連生成E-AMP中間體。中間體即與一個(gè)DNA片段的5磷酸相連接形成E-AMP-5DN

30、A。然后再與另一個(gè)DNA片段的3-OHH末端作用，E和AMP脫下，兩個(gè)DNA片段以3、5磷酸二酯鍵相連接。隨從鏈的各個(gè)DNA片段就是這樣連接成一條DNA長(zhǎng)鏈。 已有研究證明大腸桿菌染色體DNA有復(fù)制終止位點(diǎn)此處可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus，這個(gè)蛋白質(zhì)可能是通過(guò)阻止解鏈酶(Helicase)的解鏈活性而終止復(fù)制的。詳細(xì)的機(jī)制還不完全清楚。DNA復(fù)制完成后，靠拓?fù)涿笇NA分子引入超螺旋結(jié)構(gòu)。 （五）、復(fù)制的幾種主要方式1、線狀DNA雙鏈的復(fù)制；2、環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制： 1）型復(fù)制； 2）滾環(huán)型復(fù)制； 3）D-環(huán)型；1、線狀DNA雙鏈的復(fù)制線狀雙鏈DNA上復(fù)制叉生長(zhǎng)方式有單一起始點(diǎn)或多

31、個(gè)起始點(diǎn)，在此形成復(fù)制眼，從復(fù)制眼開(kāi)始復(fù)制叉可以單向(如腺病毒)及雙向(如T7)。真核生物都為多復(fù)制眼起始的雙向復(fù)制。2、環(huán)形DNA雙鏈的復(fù)制 型大腸桿菌DNA環(huán)狀分子半保留復(fù)制的中間產(chǎn)物就是型。復(fù)制的起點(diǎn)涉及到DNA雙鏈的解旋和松開(kāi)，形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉。 復(fù)制從ori開(kāi)始以順時(shí)針和逆時(shí)針雙向進(jìn)行時(shí)，復(fù)制的中間產(chǎn)物在電鏡下表現(xiàn)為型。2、環(huán)形DNA雙鏈的復(fù)制 滾環(huán)型環(huán)形DNA雙鏈復(fù)制的一種，為單向復(fù)制。復(fù)制過(guò)程中，首先形成共價(jià)閉環(huán)的雙鏈分子（RF型），然后其正鏈由一核酸內(nèi)切酶在特定位置切開(kāi)，游離出3羥基和5磷酸基。5磷酸末端在酶的作用下固著在細(xì)胞膜上，隨后在DNA聚合酶的作用下，以環(huán)狀負(fù)鏈

32、為模板，從正鏈的3羥基末端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長(zhǎng)，通過(guò)滾環(huán)形成新的正鏈。2、環(huán)形DNA雙鏈的復(fù)制 D環(huán)型單向復(fù)制：雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，但兩條鏈的合成高度不對(duì)稱，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下呈D環(huán)形狀。待一條鏈復(fù)制到一定程度，露出另一條鏈的復(fù)制起點(diǎn)，另一條鏈才開(kāi)始復(fù)制。這表明：兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)并不總在同一點(diǎn)上，當(dāng)兩條鏈的起點(diǎn)分開(kāi)一定距離時(shí)就產(chǎn)生D-環(huán)復(fù)制。（六）、真核生物DNA的復(fù)制 1、真核生物與原核生物DNA復(fù)制的區(qū)別 2、端粒和端粒酶（六）、真核生物DNA的復(fù)制 1、真核生物與原核生物DNA復(fù)制的區(qū)別 （1）、真核生物有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn) （2）、真核生物的染色體在

33、全部完成之前，各個(gè)起點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能再開(kāi)始，而快速生長(zhǎng)的原核生物種，復(fù)制起點(diǎn)上可以連續(xù)開(kāi)始新的DNA復(fù)制，表現(xiàn)為雖只有一個(gè)復(fù)制單元，但可以有多個(gè)復(fù)制叉。（六）、真核生物DNA的復(fù)制 2、端粒和端粒酶 1）、端粒 2）、端粒酶 3）、端粒與衰老 4）、端粒酶與腫瘤2、端粒和端粒酶端粒端粒：真核生物線性染色體3末端的一種特殊結(jié)構(gòu)。核苷酸重復(fù)序列富含G，和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重復(fù)序列，長(zhǎng)度515kb。作用：A 保護(hù)染色體末端免于化學(xué)修飾或核酸酶降解；B解決染色體復(fù)制時(shí)末端丟失問(wèn)題端粒酶 能將端粒加到DNA末端的核糖核蛋白復(fù)合物，由多條肽鏈與一個(gè)RNA分子組

34、成，端粒酶的蛋白質(zhì)組分具有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，但其逆轉(zhuǎn)錄酶活性只限于應(yīng)用端粒酶特異的RNA作為模板。端粒酶端粒與衰老 實(shí)驗(yàn)：在無(wú)端粒酶活性的成纖維細(xì)胞中表達(dá) 端粒酶時(shí)，端粒的縮短和細(xì)胞的衰老都受到抑制。結(jié)論：細(xì)胞的衰老是由端粒驅(qū)動(dòng)的。 體外培養(yǎng)的細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度隨細(xì)胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度便失去對(duì)染色體的保護(hù)作用。細(xì)胞隨之發(fā)生衰老和死亡。端粒與衰老 可把端?？闯梢幻骁?，端粒的長(zhǎng)度是鐘上的刻度，記載了細(xì)胞分裂的次數(shù)，稱為“端粒鐘”，或有絲分裂鐘 或“生命的時(shí)鐘”，可通過(guò)測(cè)定端粒的長(zhǎng)度預(yù)測(cè)細(xì)胞的壽命。 胚胎細(xì)胞和生殖細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度并不隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無(wú)限的分裂能力，原因在于

35、端粒酶的存在。端粒與腫瘤人體內(nèi)除了生殖細(xì)胞和少數(shù)一些體細(xì)胞如淋巴細(xì)胞等細(xì)胞外，絕大多數(shù)體細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到端粒酶的活性，而在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中能檢測(cè)到端粒酶的活性。腫瘤的端粒長(zhǎng)度很短，其繼續(xù)縮短導(dǎo)致染色體融合、細(xì)胞死亡，而端粒酶的激活可以維持端粒的長(zhǎng)度，維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖。端粒酶的表達(dá)可能是腫瘤形成和發(fā)展的共同途徑。端粒酶與惡性腫瘤之間有相關(guān)性使之在腫瘤的診斷和治療上有望成為新的靶目標(biāo)?？梢酝ㄟ^(guò)各種途徑抑制端粒酶的活性有效抑制大多數(shù)腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。二、 逆轉(zhuǎn)錄酶 （一）、逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn) （二）、逆轉(zhuǎn)錄酶的性質(zhì) （三）、逆轉(zhuǎn)錄酶的功能 （四）、逆轉(zhuǎn)錄酶的基因組復(fù)制 （五）、逆轉(zhuǎn)

36、錄酶的生物學(xué)意義（一）、逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。表明：RNA腫瘤病毒的RNA復(fù)制過(guò)程中要合成DNA。Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，但不能抑制一般RNA病毒的復(fù)制。 表明：轉(zhuǎn)錄對(duì)于RNA病毒增殖是必需的。Temin提出前病毒假說(shuō)：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制和致癌中的中間物。1970年，Temin 在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。（二）、逆轉(zhuǎn)錄酶的性質(zhì) 它是由亞基和亞基組成，含有鋅離子； DNA合成反應(yīng)要求有模板和引物； 以四種脫氧核苷三磷酸為底物；

37、 DNA合成方向也為53； 需要適當(dāng)濃度的鎂離子和還原劑。（三）、逆轉(zhuǎn)錄酶的功能RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H的活力；沿35和53兩個(gè)方向核酸外切酶的活力。（四）、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組復(fù)制過(guò)程 1、由病毒（）RNA作為模板合成互補(bǔ)的（）DNA鏈； 2、切除RNA-DNA雜種分子中的RNA ，然后由（）DNA 鏈作為模板合成（） DNA； 3、形成雙鏈DNA；乙肝病毒基因組的復(fù)制其復(fù)制需通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程經(jīng)RNA中間體實(shí)現(xiàn) ，其DNA聚合酶也是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA DNA RNA乙肝病毒：DNARNA DNA試管內(nèi)cDNA的合成常用于獲得或研究真核

38、生物基因的方法。提取某一種特定的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：來(lái)自鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒稱為AMV-RT；來(lái)自鼠白血病毒稱為MMLV-RT。病毒RNA復(fù)制的主要方式1、病毒含有正鏈RNA，如灰質(zhì)炎病毒。RNA（+） 蛋白質(zhì)（酶） RNA復(fù)制2、病毒含有負(fù)鏈RNA和復(fù)制酶如狂犬病毒。RNA（） RNA（+） 蛋白質(zhì)、復(fù)制病毒RNA。3、病毒含有雙鏈RNA和復(fù)制酶。如呼腸孤。雙鏈RNA RNA（+） 蛋白質(zhì) RNA（） 雙鏈RNA4、逆轉(zhuǎn)錄病毒。（五）、逆轉(zhuǎn)錄病毒的生物學(xué)意義 1、逆轉(zhuǎn)錄酶存在于所有致癌病毒RNA中。它的存在與RNA病毒引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

39、有關(guān)。了解逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，有助于人們對(duì)RNA病毒致癌機(jī)制的了解，并對(duì)防治腫瘤提供了重要線索。 2、常用于獲得或研究真核生物基因的方法。幾乎所有真核生物mRNA分子3端都有一段多聚腺苷酸，因此加入寡聚dT后，mRNA就可以成為逆轉(zhuǎn)錄酶很好的模板。利用這一方法能夠合成出相應(yīng)于一定mRNA的互補(bǔ)DNA。三、DNA的轉(zhuǎn)座 通常認(rèn)為基因組是相對(duì)穩(wěn)定的，變化只是在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生。同總的穩(wěn)定性相反，由于多態(tài)變異體的存在，在分子水平上，每個(gè)個(gè)體基因組之間具有明顯的差異性。這個(gè)差異產(chǎn)生的主要原因之一，是被稱為轉(zhuǎn)座的一種機(jī)制。轉(zhuǎn)座子：是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。它的標(biāo)志是它不以獨(dú)立的形式

40、存在，而在基因組內(nèi)由一個(gè)部位直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位。轉(zhuǎn)座：一個(gè)轉(zhuǎn)座子由基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置的過(guò)程。轉(zhuǎn)座酶：促進(jìn)轉(zhuǎn)座的酶稱為轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座子常常編碼自己的轉(zhuǎn)座酶，并且每次移動(dòng)時(shí)攜帶轉(zhuǎn)座必須的基因一起在基因內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱為跳躍基因。轉(zhuǎn)座是以很低的頻率發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是隨機(jī)的，不依賴于轉(zhuǎn)座子與靶位點(diǎn)之間任何序列的同源性。轉(zhuǎn)座子有時(shí)插入到一個(gè)結(jié)構(gòu)基因或基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)并引起基因表達(dá)的改變。有時(shí)，轉(zhuǎn)座子也引起基因組序列的重排。研究轉(zhuǎn)座子的意義不僅在于其涉及到DNA的操作機(jī)制，它們的移動(dòng)性也和進(jìn)化有關(guān)，在基因組內(nèi)，它們也許是突變的主要來(lái)源。三、DNA的轉(zhuǎn)座 （一）轉(zhuǎn)座子的類型 （二）轉(zhuǎn)座發(fā)生的機(jī)制 （三）轉(zhuǎn)座作用的遺傳效應(yīng) （一）轉(zhuǎn)座子的類型 1、插入序列 2、復(fù)合式轉(zhuǎn)座子 1、插入序列（IS）最早被鑒定出來(lái)的轉(zhuǎn)座元件是細(xì)菌操縱子中的自主插入序列。這種插入阻止了插入部位基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。類型：前綴IS數(shù)字轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。科學(xué)上用標(biāo)準(zhǔn)命名法對(duì)這些突變進(jìn)行編號(hào)，如：IS1表示有一個(gè)IS1序列插入到噬菌體基因組內(nèi)。 （1）、IS元件的結(jié)構(gòu)特征 IS是獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位，每個(gè)元件只編碼為自身轉(zhuǎn)座所需的蛋白質(zhì)。每種IS元件在序列上皆是不同的，但在結(jié)構(gòu)上具有一些共同的特征。 1）、末端的反向重