利用酶法測(cè)定稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)

1、利用酶法測(cè)定稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)周慧穎 歐陽(yáng)林娟 彭小松 朱昌蘭 陳小榮 傅軍如 邊建民 胡麗芳 賀浩華 賀曉鵬*（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南昌 330045）摘 要 支鏈淀粉是淀粉粒各級(jí)結(jié)構(gòu)形成和稻米理化特性的主要決定因素，本研究對(duì)酶法測(cè)定稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的酶解最適反應(yīng)條件進(jìn)行了探索和優(yōu)化。研究結(jié)果表明，測(cè)定-淀粉酶水解率時(shí)，對(duì)于0.1 g的支鏈淀粉，-淀粉酶的最適用量為500 U，反應(yīng)時(shí)間為48 h，反應(yīng)溫度為37 ；測(cè)定平均鏈長(zhǎng)時(shí)，對(duì)于22 mg的支鏈淀粉，普魯蘭酶的最適用量為4 U，反應(yīng)時(shí)間為24 h，反應(yīng)溫度為37

2、 ；測(cè)定A:B值時(shí)，對(duì)于1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的-極限糊精溶液，異淀粉酶的最佳用量為100 U，普魯蘭酶的用量為1 U，最適反應(yīng)時(shí)間均為24 h。在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用酶法對(duì)8個(gè)稻米品種支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，8個(gè)品種中-淀粉酶水解率、平均鏈長(zhǎng)、平均外鏈長(zhǎng)、平均內(nèi)鏈長(zhǎng)、A:B值的變幅分別為為51.22%62.86%、18.3120.83、11.3814.82、4.575.93、1.051.67。關(guān)鍵詞 稻米 支鏈淀粉結(jié)構(gòu) -淀粉酶 異淀粉酶 普魯蘭酶中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-0174（ ） - - Determination of A

3、mylopectin Fine Structure in Rice by Enzymatic MethodZhou Huiying Ouyang Linjuan Peng Xiaosong Zhu Changlan Chen Xiaorong Fu Junru Bian Jianmin Hu Lifang He Haohua He Xiaopeng*（College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University Key Laboratory of Crop Physiology Ecology and Genetic Breeding, Minist

4、ry of Education/ Collaboration Innovation Center for Double-season Rice Modernization Production, Nanchang 330045, China）基金項(xiàng)目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（GJJ11398），江西省科技廳自然科學(xué)基金（20114BAB204007），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201403002-4）收稿日期：2017-08-26作者簡(jiǎn)介：周慧穎，女，1990年出生，博士，作物遺傳育種通訊作者：賀曉鵬，男，1972年出生，副教授，作物遺傳育種Abstract Amylopectin is

5、the determinant of starch granule structure and starch physiochemical properties. In this study, the optimum reaction conditions for enzymatic determination of amylopectin structure in rice were explored and optimized. The results showed that the optimal dosage of -amylase was 500 U for 0.1 g of amy

6、lopectin, the reaction time was 48 h and the reaction temperature was 37 when the -amylolysis was determined. For the 22 mg of amylopectin, the optimum dosage of pullulanase was 4 U, the reaction time was 24 h and the reaction temperature was 37 when the average chain length was determined. For 1 mL

7、 concentration of 1 mg/mL -limit dextrins, the optimum dosage of isoamylase was 100U, the optimum dosage of pullulanase was 1 U, the reaction time of both was 24 h when the A: B value was determined. On the base of condition optimization, the fine structure of amylopectin in eight rice varieties was

8、 determined by enzymatic method. The results showed that the hydrolysis rate of -amylase, average chain, length average exterior chain length, average internal chain length, A chain and B chain ratio varied from 51.22% to 62.86%, 18.31 to 20.83, 11.38 to 14.82, 4.57 to 5.93, 1.05 to 1.67, respective

9、ly.Keywords rice, amylopectin structure, -amylase, isoamylase, pullulanase支鏈淀粉作為稻米淀粉最主要的組分，是稻米品質(zhì)和淀粉理化特化的主要決定因素1-3。支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)包括平均鏈長(zhǎng)(CL)、平均外部鏈長(zhǎng)(ECL)、平均內(nèi)部鏈長(zhǎng)(ICL)、A:B值（每條B鏈上所具有的A鏈數(shù)目）、鏈長(zhǎng)和鏈長(zhǎng)分布等參數(shù)4。目前對(duì)稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究主要是利用凝膠層析法、熒光糖電泳法（基于毛細(xì)管電泳、基于測(cè)序儀）等測(cè)定支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)和鏈長(zhǎng)分布5-7。利用酶法測(cè)定支鏈淀粉結(jié)構(gòu)是采用-淀粉酶、異淀粉酶、普魯蘭酶等三種酶對(duì)支鏈淀粉進(jìn)行酶解，

10、從而獲得-淀粉酶水解率、CL、ECL、ICL、A:B值等支鏈淀粉結(jié)構(gòu)參數(shù)，這些參數(shù)可更好地反映支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)。已有研究利用酶法對(duì)葛根8、銀杏9及慈姑10的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定，而在水稻中利用酶法測(cè)定支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)鮮見(jiàn)研究報(bào)道。此外，前人在利用酶法測(cè)定葛根、銀杏及慈姑的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的具體過(guò)程中，酶解反應(yīng)條件存在一定差異，如在測(cè)定-淀粉酶水解率時(shí)采用的-淀粉酶用量分別是500、500、325 U，測(cè)定A:B值時(shí)采用的異淀粉酶用量分別是2、80、80 U，且對(duì)酶解的最佳反應(yīng)時(shí)間沒(méi)有明確。本試驗(yàn)對(duì)酶法測(cè)定稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的酶解反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，以期對(duì)稻米支鏈淀粉結(jié)構(gòu)和特性的測(cè)定和研究

11、提供技術(shù)支撐。1 材料和方法1.1 材料和儀器秈稻品種為昌恢121、南京11、桂朝2號(hào)、昌恢T025；粳稻為寧粳1號(hào)、常粳06-3、武育粳7號(hào)、日本晴。昌恢121、昌恢T025為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的恢復(fù)系材料，其它品種均引自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。同期成熟種子收獲后曬干，存放3個(gè)月以上，用精米機(jī)充分研磨成精米后進(jìn)一步磨成米粉，采用賀曉鵬等11的方法進(jìn)行支鏈淀粉的分離和純化，得到純支鏈淀粉粉末后密封保存。-淀粉酶（EC 3.2.1.2）、普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）、異淀粉酶（EC 3.2.1.68）：Sigma-Aldrich公司。SCINO-CT410旋風(fēng)式樣品磨：瑞典FOSS公司；TU-1810

12、D紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析公司。1.2 -淀粉酶酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化及稻米支鏈淀粉-淀粉酶水解率的測(cè)定每個(gè)供試品種取5 mL離心管4個(gè)，加入純化的支鏈淀粉0.1 g分散于5 mL濃度為0.02 mol/L，pH 5.0的醋酸緩沖溶液中，分別加入300、400、500、600 U的-淀粉酶，同時(shí)加入12滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 水浴保溫約48 h后，將反應(yīng)液沸水浴滅酶25 min，冷卻后測(cè)定體系中的還原力（麥芽糖當(dāng)量），以還原力不再增加的最低酶用量為優(yōu)化酶用量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。每個(gè)供試品種取5 mL離心管1個(gè)，加入純化的支鏈淀粉0.1 g分散于5 mL濃度為0.02 mol/L，pH

13、5.0的醋酸緩沖溶液中，加入優(yōu)化酶用量的-淀粉酶，同時(shí)加入12滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 水浴保溫，測(cè)定4 h至60 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解反應(yīng)所產(chǎn)生的還原力，以還原力不再增加的最短時(shí)間為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。在酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，測(cè)定反應(yīng)體系中的總糖和還原力，重復(fù)3次，以不加酶的樣品同樣處理作為對(duì)照，計(jì)算稻米支鏈淀粉-淀粉酶水解率，公式如下：-淀粉酶水解率還原力（麥芽糖當(dāng)量）100/總糖 （麥芽糖當(dāng)量）1.3 普魯蘭酶反應(yīng)條件的優(yōu)化及稻米支鏈淀粉CL、ECL、ICL的測(cè)定每個(gè)供試品種取5 mL離心管4個(gè)，稱取22 mg純支鏈淀粉，加入濃度為0.05 mol/L, pH

14、5.0的醋酸緩沖液5 mL，充分混勻后加入2、4、6、8 U的普魯蘭酶，液面以12滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 水浴保溫約24 h后，將反應(yīng)液沸水浴滅酶20 min，冷卻后測(cè)定體系中的還原力，以還原力不再增加的最低酶用量為優(yōu)化酶用量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。每個(gè)供試品種取5 mL離心管1個(gè)，稱取22 mg純支鏈淀粉，加入濃度為0.05 mol/L, pH 5.0的醋酸緩沖液5 mL，充分混勻后加入優(yōu)化酶用量的普魯蘭酶，同時(shí)加入12滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 水浴保溫，測(cè)定4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間段內(nèi)酶解反應(yīng)所產(chǎn)生的還原力，以還原力不再增加的最短時(shí)間為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。在酶用量

15、和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，測(cè)定反應(yīng)體系中的總糖和總還原力，重復(fù)3次，以不加酶的樣品同樣處理作為對(duì)照計(jì)算CL，同時(shí)根據(jù)所測(cè)定的-淀粉酶水解率可以計(jì)算出支鏈淀粉的ECL和ICL，公式如下：CL=產(chǎn)物中的總糖（葡萄糖當(dāng)量）/產(chǎn)物中的總還原力（葡萄糖當(dāng)量）ECLCL -淀粉酶水解率+2.0ICL(CL-ECL)-1.01.4 -淀粉酶和普魯蘭酶酶解溫度的確定根據(jù)所購(gòu)-淀粉酶和普魯蘭酶的質(zhì)檢報(bào)告，-淀粉酶和普魯蘭酶的推薦反應(yīng)溫度分別為20 和25 ，杜先鋒8，敖自華9等采用-淀粉酶、普魯蘭酶進(jìn)行水解反應(yīng)時(shí)，采用的反應(yīng)溫度均為37 。為此，在-淀粉酶和普魯蘭酶酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)置20、37 和

16、25、37 兩種溫度，測(cè)定不同品種在兩種反應(yīng)溫度下酶解產(chǎn)生的還原力，明確-淀粉酶和普魯蘭酶酶解反應(yīng)的最佳溫度。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。1.5 支鏈淀粉A:B值酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化及測(cè)定將測(cè)定-淀粉水解率時(shí)的最終反應(yīng)液加入3倍體積無(wú)水甲醇，冰浴30 min后6 000 r/min離心5 min，傾去上清液，加入75%的甲醇沖洗沉淀，37 恒溫干燥后用研缽磨成細(xì)粉，獲得支鏈淀粉-極限糊精。稱取5 mg -極限糊精粉末于2 mL離心管中，加入200 L蒸餾水，沸水浴中加熱攪拌10 min后，加入濃度為0.04 mol/L，pH 4.5的醋酸緩沖液，再次置沸水浴中加熱攪拌10 min，冷卻至室溫，制成1

17、mg/mL的-極限糊精溶液。每個(gè)供試品種取2 mL離心管5個(gè)，量取-極限糊精溶液1 mL，首先分別加入2、10、50、100、150 U的異淀粉酶進(jìn)行第一步脫支水解，37 水浴保溫，24 h后將反應(yīng)液置沸水浴中25 min滅酶，冷卻后測(cè)定反應(yīng)液中的還原力，以還原力不再增加的最低酶用量為異淀粉酶優(yōu)化酶用量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。每個(gè)供試品種取2 mL離心管1個(gè)，量取-極限糊精溶液2 mL，加入優(yōu)化酶用量的異淀粉酶，同時(shí)加入12滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 水浴保溫，測(cè)定4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間段內(nèi)酶解反應(yīng)所產(chǎn)生的還原力，以還原力不再增加的最短時(shí)間為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)反應(yīng)液中的還原力為C1。每個(gè)

18、樣品重復(fù)測(cè)定3次。在異淀粉酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，每個(gè)供試品種取2 mL離心管4個(gè)，取異淀粉酶水解后的反應(yīng)液 1 mL，再次分別加入0.6、0.8、1、1.2 U的普魯蘭酶第二步脫支水解，37 水浴保溫，24 h后將反應(yīng)液置沸水浴中25 min滅酶，冷卻后測(cè)定反應(yīng)液中的還原力，以還原力不再增加的最低酶用量為普魯蘭酶優(yōu)化酶用量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。在異淀粉酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，每個(gè)供試品種取2 mL離心管1個(gè)，取異淀粉酶水解后的反應(yīng)液1 mL，向每個(gè)供試品種的體系中加入優(yōu)化酶用量的普魯蘭酶，測(cè)定4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解反應(yīng)所產(chǎn)生的還原力，以還原力不再增加的最短時(shí)間為優(yōu)化

19、反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)反應(yīng)液中的還原力為C2，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。根據(jù)測(cè)定的C1、C2可計(jì)算出稻米支鏈淀粉的A:B值，公式如下：C1=B+0.5AC2=B+A2 結(jié)果與分析2.1 稻米支鏈淀粉-淀粉酶水解率測(cè)定的最適反應(yīng)條件2.1.1 -淀粉酶水解率測(cè)定的最適酶用量圖1為8種稻米支鏈淀粉分別加入300、400、500、600 U -淀粉酶的反應(yīng)體系37 酶解48 h后的還原力（麥芽糖當(dāng)量）測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)體系中的還原力相應(yīng)增大，當(dāng)酶用量為500 U時(shí)開(kāi)始，體系中的還原力基本保持恒定，隨后酶用量的增加體系中的還原力不再增大?？梢?jiàn)，對(duì)于0.1 g的稻米支鏈淀粉，測(cè)定-淀粉

20、酶水解率時(shí)-淀粉酶的最適酶用量為500 U，與測(cè)定葛根、銀杏支鏈淀粉-淀粉酶水解率的酶用量（500 U）相同8-9，大于測(cè)定慈姑支鏈淀粉-淀粉酶水解率的酶用量（325 U）10。注：圖中數(shù)據(jù)為平均值，短線表示均方差，不同小寫(xiě)字母代表處理間達(dá)顯著差異水平（P0.05），余同。圖1 稻米支鏈淀粉-淀粉酶水解率測(cè)定時(shí)-淀粉酶用量與還原力生成的關(guān)系2.1.2 -淀粉酶水解率測(cè)定的最適反應(yīng)時(shí)間圖2為8種稻米支鏈淀粉加入-淀粉酶500 U，37 水浴酶解后，4 h至60 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解反應(yīng)體系中還原力（麥芽糖當(dāng)量）的測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，不同品種支鏈淀粉的水解程度均相應(yīng)增

21、大，水解初期，還原力增加較快，而后逐漸緩慢，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到48 h后開(kāi)始，反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的還原力基本上達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)值，水解程度達(dá)到最大，隨后還原力不再而增加?？梢?jiàn)，對(duì)于0.1 g的稻米支鏈淀粉，測(cè)定-淀粉酶水解率時(shí)的最適酶解時(shí)間為48 h。圖2 稻米支鏈淀粉-淀粉酶水解率測(cè)定時(shí)酶解反應(yīng)時(shí)間與還原力生成的關(guān)系2.1.3 -淀粉酶水解率測(cè)定的最適反應(yīng)溫度圖3為8種稻米支鏈淀粉在20 和37 兩種水浴溫度下（酶用量500 U，反應(yīng)時(shí)間48 h）的還原力的測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，反應(yīng)體系溫度為37 時(shí)，8個(gè)品種的還原力均大于20 時(shí)的還原力。可見(jiàn)，對(duì)于0.1 g的稻米支鏈淀粉，測(cè)定-淀粉酶水解率時(shí)

22、的最適反應(yīng)溫度為37 。圖3 稻米支鏈淀粉-淀粉酶水解率測(cè)定時(shí)不同反應(yīng)溫度下的還原力2.2 稻米支鏈淀粉鏈長(zhǎng)測(cè)定的最適反應(yīng)條件2.2.1 CL測(cè)定的最適酶用量圖4為8種稻米支鏈淀粉分別加入2、4、6、8 U普魯蘭酶的反應(yīng)體系37 酶解24 h后的還原力（葡萄糖當(dāng)量）的測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)體系中的還原力相應(yīng)增大，當(dāng)酶用量為4 U時(shí)開(kāi)始，體系中的還原力基本保持恒定，隨后酶用量的增加體系中的還原力不再增大?？梢?jiàn)，對(duì)于22 mg的稻米支鏈淀粉，測(cè)定CL時(shí)的普魯蘭酶最適酶用量為4 U，與測(cè)定銀杏支鏈淀粉CL的酶用量（4 U）相同9，大于測(cè)定慈姑支鏈淀粉CL的酶用量（3 U）1

23、0。圖4 稻米支鏈淀粉CL測(cè)定時(shí)普魯蘭酶用量與還原力生成的關(guān)系2.2.2 CL測(cè)定的最適反應(yīng)時(shí)間圖5為8種稻米支鏈淀粉加入普魯蘭酶4 U，37 水浴酶解后， 4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)酶解反應(yīng)體系中還原力（葡萄糖當(dāng)量）的測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，不同品種支鏈淀粉的水解程度均相應(yīng)增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24 h后開(kāi)始，反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的還原力基本上達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)值，水解程度達(dá)到最大，隨后還原力不再增加?？梢?jiàn)，對(duì)于22 mg的稻米支鏈淀粉，測(cè)定CL時(shí)的最適酶解時(shí)間為24 h。圖5 稻米支鏈淀粉CL測(cè)定時(shí)酶解反應(yīng)時(shí)間與還原力生成的關(guān)系2.2.3 CL測(cè)定的最適反應(yīng)溫度圖6為8

24、種稻米支鏈淀粉在25 和37 兩種水浴溫度下（酶用量4 U，反應(yīng)時(shí)間24 h）的還原力測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，反應(yīng)體系溫度為37 時(shí)，8個(gè)品種的還原力均大于25 時(shí)的還原力?？梢?jiàn)，對(duì)于22mg的稻米支鏈淀粉，測(cè)定CL時(shí)的最適反應(yīng)溫度為37 。圖6 稻米支鏈淀粉CL測(cè)定時(shí)不同反應(yīng)溫度下的還原力2.3 A:B值最適反應(yīng)條件的優(yōu)化及測(cè)定2.3.1 A:B值測(cè)定時(shí)異淀粉酶的的最適酶用量圖7為8種稻米-極限糊精溶液分別加入2、10、50、100、150 U異淀粉酶的反應(yīng)體系37 酶解24 h后的還原力（葡萄糖當(dāng)量）測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)體系中的還原力相應(yīng)增大，當(dāng)酶用量為100

25、 U時(shí)，體系中的還原力基本保持恒定，隨后酶用量的增加體系中的還原力不再增大?？梢?jiàn)，對(duì)于1 mL濃度為1 mg/mL的稻米-極限糊精溶液，測(cè)定A:B值時(shí)異淀粉酶的最適酶用量為100 U，高于測(cè)定銀杏、慈姑支鏈淀粉的酶用量（80 U）和葛根支鏈淀粉的酶用量（2 U）8-10。圖7 稻米支鏈淀粉A:B測(cè)定時(shí)異淀粉酶用量與還原力生成的關(guān)系2.3.2 A:B值測(cè)定時(shí)異淀粉酶的最適反應(yīng)時(shí)間圖8為8種稻米-極限糊精溶液加入異淀粉酶100 U，37 水浴酶解后，4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解體系中還原力（葡萄糖當(dāng)量）的測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，不同品種支鏈淀粉的水解程度均相應(yīng)增大，

26、當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24 h后開(kāi)始，反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的還原力基本上達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)值，水解程度達(dá)到最大，隨后還原力不再增加?？梢?jiàn)，對(duì)于1 mL濃度為1 mg/mL的-極限糊精溶液，測(cè)定A:B值時(shí)的最適酶解時(shí)間為24 h。圖8 稻米支鏈淀粉A:B值測(cè)定時(shí)異淀粉酶酶解反應(yīng)時(shí)間與還原力生成的關(guān)系2.3.3 A:B值測(cè)定時(shí)普魯蘭酶的最適酶用量圖9為8種稻米異淀粉酶水解反應(yīng)液再次分別加入0.6、0.8、1、1.2 U普魯蘭酶進(jìn)行第二步脫支水解，反應(yīng)體系37 酶解24 h后的還原力（葡萄糖當(dāng)量）測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)體系中的還原力相應(yīng)增大，當(dāng)酶用量為1 U時(shí)，體系中的還原力基本保持恒定，隨

27、后酶用量的增加體系中的還原力不再增大?？梢?jiàn)，對(duì)于1 mL異淀粉酶水解后的反應(yīng)液，測(cè)定A:B時(shí)普魯蘭酶的最適酶用量為1 U，與測(cè)定銀杏支鏈淀粉的酶用量（1 U）相同9，高于測(cè)定葛根支鏈淀粉的酶用量（0.6 U）8。圖9 稻米支鏈淀粉A:B測(cè)定時(shí)普魯蘭酶用量與還原力生成的關(guān)系2.3.4 A:B值測(cè)定時(shí)普魯蘭酶的最適反應(yīng)時(shí)間圖10為種稻米異淀粉酶水解反應(yīng)液再次加入普魯蘭酶1 U，37 水浴酶解后，4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解體系中還原力（葡萄糖當(dāng)量）的測(cè)定結(jié)果。從圖中可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，不同品種支鏈淀粉的水解程度均相應(yīng)增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24 h后開(kāi)始，反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的還原力基

28、本上達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)值，水解程度達(dá)到最大，隨后還原力不再增加?？梢?jiàn)，對(duì)于1 mL異淀粉酶水解后的反應(yīng)液，測(cè)定A:B時(shí)的最適酶解時(shí)間為24 h。圖10 稻米支鏈淀粉A:B值測(cè)定時(shí)普魯蘭酶酶解反應(yīng)時(shí)間與還原力生成的關(guān)系2.4 8個(gè)水稻品種的支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)表1為根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件利用酶法測(cè)定的8個(gè)水稻品種的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)參數(shù)，由表1可見(jiàn)，8個(gè)水稻品種的-淀粉酶水解率變幅為51.22%62.86%，其中昌恢121最大，寧粳1號(hào)最??；CL的變幅為18.3120.83，ECL的變幅為11.3814.82，兩者中均為南京11最大，寧粳1號(hào)最?。籌CL的變幅為4.575.93，寧粳1號(hào)最大，昌恢121最??；A:B

29、值的變幅為1.051.67，常粳06-3最大，昌恢T025最小。表1 參試水稻品種的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)品種-淀粉酶水解率（%）平均鏈長(zhǎng)平均外鏈長(zhǎng)平均內(nèi)鏈長(zhǎng)A:B值寧粳1號(hào)51.2218.3111.385.931.55常粳06-355.3218.5512.265.291.67武育粳7號(hào)53.5218.9612.145.821.57日本晴54.5418.8012.255.551.54昌恢12162.8620.3914.824.571.41南京1161.4120.8314.795.041.42桂朝2號(hào)57.0419.8213.305.511.34昌恢T02559.0319.6313.595.041.053

30、 討論利用酶法測(cè)定支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的基本原理首先是利用-淀粉酶作用于支鏈淀粉的-1,4-糖苷鍵形成了-限制糊精，并獲得-淀粉酶水解率；利用普魯蘭酶作用支鏈淀粉的-1,6-糖苷鍵使支鏈淀粉脫支成為直鏈片段，獲得CL；利用異淀粉酶作用于-1,6-糖苷鍵先水解-限制糊精中大于三個(gè)葡萄糖單位構(gòu)成的側(cè)鏈，再用普魯蘭酶進(jìn)一步水解兩個(gè)以上葡萄糖單位構(gòu)成的側(cè)鏈，這樣經(jīng)過(guò)異淀粉酶和普魯蘭酶共同作用后可以使-極限糊精完全脫支，以此通過(guò)計(jì)算得到 A與B 鏈的比值。杜先鋒等8測(cè)定葛根支鏈淀粉-淀粉酶水解率時(shí)，-淀粉酶用量為500 U，反應(yīng)時(shí)間約48 h，反應(yīng)溫度為37 ；測(cè)定A:B值時(shí)，異淀粉酶用量為2 U，反應(yīng)時(shí)間

31、為15 h，普魯蘭酶用量為0.6 U，反應(yīng)時(shí)間為24 h。敖自華等9測(cè)定銀杏支鏈淀粉-淀粉酶水解率時(shí)，-淀粉酶用量為500 U，反應(yīng)時(shí)間約44 h，反應(yīng)溫度為37 ；測(cè)定CL時(shí)，普魯蘭酶用量為4 U，反應(yīng)時(shí)間約24 h，反應(yīng)溫度為37 ；測(cè)定A:B值時(shí)，異淀粉酶用量為80 U，反應(yīng)時(shí)間為20 h，普魯蘭酶用量為1 U，反應(yīng)時(shí)間為15 h。王素雅等10 測(cè)定慈姑支鏈淀粉-淀粉酶水解率時(shí)，-淀粉酶用量為325 U，反應(yīng)溫度為37 ；測(cè)定CL時(shí)，普魯蘭酶用量為3 U，反應(yīng)溫度為37 。本研究表明，0.1 g的稻米支鏈淀粉水解時(shí)，-淀粉酶的最適用量為500 U，反應(yīng)時(shí)間為48 h，反應(yīng)溫度為37 ；測(cè)

32、定CL時(shí)，對(duì)于22 mg的稻米支鏈淀粉，普魯蘭酶的最適用量為4 U，反應(yīng)時(shí)間為24 h，反應(yīng)溫度為37 ；對(duì)于1 mL濃度為1 mg/mL的稻米-極限糊精溶液，先用100 U異淀粉酶對(duì)其進(jìn)行水解，反應(yīng)24 后加熱使酶失活，再用1 U普魯蘭酶進(jìn)行第二步脫支水解，反應(yīng)24 h后進(jìn)行A:B值的測(cè)定可以取得較好的效果。研究結(jié)果對(duì)于了解支稻米鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)，揭示稻米食用品質(zhì)形成的機(jī)理都具有應(yīng)用價(jià)值。4 結(jié)論本文優(yōu)化了酶法測(cè)定稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的各項(xiàng)反應(yīng)條件。在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行了稻米支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的測(cè)定，8個(gè)參試品種中，-淀粉酶水解率的變幅為51.2262.86%，CL的變幅為18.3120.83，ECL

33、的變幅為11.3814.82，ICL的變幅為4.575.93，A:B值的變幅為1.051.67。參考文獻(xiàn)1Kong X, Zhu P, Sui Z, et al. Physicochemical properties of starches from diverse rice cultivars varying in apparent amylose content and gelatinization temperature combinations J. Food Chemistry, 2015, 172: 433-4402彭小松, 朱昌蘭, 王方, 等. 秈粳雜種后代支鏈淀粉結(jié)構(gòu)及其與稻

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