細(xì)胞凋亡的免疫檢測(cè)技術(shù)

1、細(xì)胞凋亡的免疫檢測(cè)技術(shù)(Apoptosis immunoassay technique )一、概述細(xì)胞凋亡(apoptosis,Apo )是細(xì)胞增殖的反面，探討的是細(xì)胞死亡的方式與機(jī)制。凋亡一詞來(lái)源于希臘語(yǔ)。原指花瓣、葉片的脫落。自 1972年Kerr首次提出細(xì)胞凋亡的概念以來(lái)， 隨著細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)的研究發(fā)展，最近幾年人們對(duì)細(xì)胞凋亡的重大理論意義 和實(shí)際意義有了更深的理解。細(xì)胞凋亡是指在一定的生理和病理情況下，機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過(guò)基因調(diào)控而使細(xì)胞自動(dòng)消亡的過(guò)程。不同類(lèi)型白細(xì)胞，在發(fā)生凋亡時(shí)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程也不一致，存在著一定的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的差異，但若干基本變化是大同小異的。

2、其特征為：整個(gè)胞體呈濃縮狀，有特異性胞漿大泡，胞質(zhì)、核質(zhì)深染，核碎裂后被細(xì)胞膜包裹而形成凋亡小體(apoptosis body)。它有別于細(xì)胞死亡(necrosis,Nec)。在瓊脂糖凝膠電泳上顯示出特殊的DNA梯狀圖譜。它的出現(xiàn)主要是由于一種鈣-鎂依賴(lài)性核酸內(nèi)切酶激活后，裂解染色質(zhì)核小體(nucleosome)之間的連接 DNA,將核小體切割成 180bp 200bp或其倍數(shù)的片段所致。Apo是不可逆的過(guò)程，散在分布于組織中，形成的凋亡小體，除核裂解外，外有膜包繞，內(nèi)有完整的細(xì)胞器，母亡小體在組織中很快被鄰近組織細(xì)胞吞噬，并在溶酶體中被降解。因此，Apo不引起周?chē)M織炎癥及損傷。Apo是機(jī)體

3、自己?jiǎn)?dòng)，由細(xì)胞本身主動(dòng)控制，由基因指導(dǎo)的細(xì)胞自我消亡過(guò)程。因此，又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)。光鏡下，Apo的典型形態(tài)學(xué)特征是核染色質(zhì)廣 泛凝聚，細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，有凋亡小體存在，細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)如微絨毛等丟 失及細(xì)胞表面明顯的迂曲。體內(nèi)細(xì)胞凋亡過(guò)程發(fā)展非常迅速，細(xì)胞常在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成Apo并降解，凋亡細(xì)胞僅出現(xiàn)數(shù)分鐘就消失，故不適宜應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法(普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)法、熒光顯微鏡檢測(cè)法、凋亡小體的電鏡觀察及凋亡指數(shù)和細(xì)胞活力的定量測(cè)定)來(lái)檢測(cè)。在生物化學(xué)方面，利用電泳技術(shù)證明核體斷片的“ DNA梯狀圖譜”作為檢測(cè)群體細(xì)胞發(fā)生 凋亡的一個(gè)指標(biāo)。

4、經(jīng)過(guò)人們多年的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)( TDT assay orTUNEL reaction)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其靈敏度高，特異性強(qiáng)，能早期顯示未發(fā)生典型變化 的凋亡細(xì)胞。它是檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞早期出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的好方法。近幾年，人們又發(fā)現(xiàn)了能更快、更敏感、檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量更多的并能從更多方面證明凋亡和壞死的流式細(xì)胞分析術(shù)(flowcytometry ,FCM包括亞G1”峰檢測(cè)法和末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù))等。本章僅介紹免疫學(xué) 檢測(cè)方法。二、ELISA 法(一) 原理細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是由于鈣-鎂依賴(lài)性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA,產(chǎn)生180bp200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2

5、A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應(yīng)用小鼠抗 DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，可特異性檢測(cè)細(xì)胞溶解物中的核小體片段。(二)材料與試劑.采用Boehringer Mannheim公司試劑盒，丑物標(biāo)記的小鼠抗組蛋白單克隆抗體。.過(guò)氧化物酶(-POD)標(biāo)記的小鼠抗 DNA單克隆抗體.鏈霉親合素包被的微孔板4. DNA-組蛋白復(fù)合物，作為陰性對(duì)照。. ABTS底物.溶解緩沖液.溫育緩沖液.底物緩沖液 （三）樣品.培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物細(xì)胞裂解步驟：收集細(xì)胞，離心后，用200。溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用 30min。.培養(yǎng)

6、細(xì)胞的上清液.血漿（血清） （四）操作方法.取樣品離心后（1 000r/min,10min ），吸取20 6上清液，加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板 孔中。.另加入80科l免疫反應(yīng)試劑含抗DNA POD抗組蛋白生物素及溫育緩沖液（按1 ： 1 ： 18混合），室溫下孵育 2h （置搖床上，250r/min ）。3.取上清，用300科溫育 緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液。4.加入100 dl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合（置搖床上）。5.盡快作比色分析（10min20min內(nèi)），用底物緩沖液作空白對(duì)照，以波長(zhǎng)405nm , 參考波長(zhǎng)492nm進(jìn)行檢測(cè)。（五）結(jié)果判定按下列公式計(jì)算細(xì)胞釋放的單

7、/低聚核小體片段的特別聚集值：注：mU=吸收值（10-3）=雙孔吸收值的平均 OD值底物OD值，若樣品的吸 收值超過(guò)比色測(cè)定范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測(cè)。三、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（一）原理 凋亡細(xì)胞是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活后，將DNA切割成許多雙鏈 DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn)（缺口） ，暴露出大量3-羥基末端，如用末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將標(biāo)記的dUTP進(jìn)行缺口末端標(biāo)記，則可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞。 主要應(yīng)用的是熒光標(biāo)記法和酶標(biāo)記法。（二）熒光標(biāo)記法.材料與試劑采用德國(guó) Boehringer-Mannheim 公司 In Situ Cell Death Detection

8、 試劑盒，或美國(guó)Oncor公司ApopTagTM試劑盒，包括：生物素標(biāo)記的-Dutp（Biotin-dUTP）或地高辛標(biāo)記的-dUTP（Digoxingeningll-dUTP）l nmol/ 口 TdT 酶（25U/6） 反應(yīng)緩沖液（4）洗 滌緩沖液 異硫氟酸熒光素（FIT。標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素（2.5 pg/m）或抗地高辛 抗體（1 ： 30） （6） PI染液（含 PI 5 g/ml及無(wú)DNA酶活性的 RNA酶0.1%） PBS緩 沖液塑料蓋玻片.樣品懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的甩片或涂片貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞冰凍切片（4）常規(guī)石蠟切片.操作方法（1）固定：培養(yǎng)細(xì)胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固

9、定 30min（4C）后，用80%酒精再固定2h （-20C）。常規(guī)4%中性福爾馬林固定、 石蠟包埋之切片進(jìn)行脫蠟、水水化。（2）洗滌：玻片浸入 PBS緩沖1夜,搖床上洗滌 5min,三次。（3）反應(yīng)：洗滌后的玻片用吸水 水紙吸干細(xì)胞或組織周?chē)郑?0 6/cm 2滴加反應(yīng)液（每50 46反應(yīng)?含TdT酶0.5口,標(biāo)記的-dUTP 1 口），使反應(yīng)液均勻地覆蓋于所有細(xì)胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37C孵育1h。（4）終止反應(yīng)：去掉塑料蓋玻片，將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi)，洗滌兩次，每次5min。（5） FITC標(biāo)記：洗滌后的玻片用吸水水紙吸去細(xì)胞或組織周?chē)?，?0

10、 口/ cm 2滴加FITC反應(yīng)液（含F(xiàn)ITC 2.5科g/ml） ,室溫下避光孵育 10min。（6）洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi)，洗兩次，每次5min。（7） PI復(fù)染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內(nèi)，室溫下避光染色 30min。 （8）封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無(wú)色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察。.結(jié)果判定：用熒光顯微鏡觀察，選用藍(lán)色激發(fā)光（波長(zhǎng) 488nm）, 所有的細(xì)胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細(xì)胞被特異地標(biāo)記上FITC 顯示出黃綠色火光。（三）酶標(biāo)記法.材料與試劑 采用美國(guó)Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase試

11、劑盒，包括： 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體 反應(yīng)緩沖液TdT酶（4）反應(yīng)終止/洗滌液平衡緩沖液（6）蛋白酶 K消化液：20科g/ml蛋白酶 K溶于 PBS 30% H2O2DAB顯色液：0.05%的diaminobenzidine（DAB）溶于 PBS 用前過(guò)濾并加入 0.02% H2O2。 甲基綠染液：0.5%甲基綠溶于 0.1Mol/L枸檬酸鈉，pH調(diào)整到4.0。（10）塑料蓋玻片及玻璃蓋玻片.樣品同熒光標(biāo)記法。.操作方法固定：同熒光標(biāo)記法。內(nèi)源性過(guò)氧化物封閉玻片置于盛有 0.5% H2O2緩沖溶液的染色缸內(nèi)，室溫下作用 20min后，同熒光標(biāo)記法洗滌。 消化：玻片浸于盛有蛋白酶 K消化液

12、的染色缸，室溫下消化15min, 洗滌 同上。 平衡處理：將細(xì)胞或組織周?chē)?體用吸水水紙吸干，滴加平衡緩沖液（按70科/cm2）覆蓋細(xì)胞或組織表面，蓋上塑料蓋玻片，室溫下作用 5min10min。 反應(yīng)：移去蓋玻片，傾去平衡液，用吸水水紙吸干周?chē)后w，滴加反應(yīng)液（按50 口/cm 2, 18 6 TdT酶+366反應(yīng)緩沖液），均勻覆蓋在細(xì)胞或組織上，蓋上塑料蓋玻片，置于濕盒中，37c溫育1h。（6）終止反應(yīng)：移去蓋玻片，將玻片置于盛有終止/洗滌液的 染色缸內(nèi)，37c下洗滌30min （置搖床上振搖）。然后將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi)，洗兩次，每次5min。 地高辛抗體反應(yīng)：用吸水水紙吸干細(xì)胞或組織

13、周?chē)后w，滴加70科l過(guò)氧化物酶標(biāo)記的地高辛抗體，均勻覆蓋，加上塑料蓋玻片，室溫下置于濕盒中，孵育30min。 洗滌：置于洗滌緩沖液內(nèi)，洗兩次，每次5min。 用吸水水紙吸干細(xì)胞或組織周?chē)后w，滴加新鮮配制的 DAB顯色液，均勻覆蓋，加上塑料蓋玻片，室溫下 作用3min6min。（10）洗滌：置于蒸儲(chǔ)水水中洗滌 3次，每次3min6min。（11）套染： 將玻片置于盛有甲基綠染液的染色缸中，室溫染色10min。 洗滌：蒸儲(chǔ)水水洗滌 3次（置于搖床上），每次2min。脫水水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二 甲苯，3次，每次2min。明膠甘油封片。4.結(jié)果判定光學(xué)顯微鏡下觀察，所有的

14、細(xì)胞核均著綠色，凋亡的細(xì)胞核染色質(zhì)顯示出特異性的棕黃 色參考上海閃晶分子生物科技有限公司3、真真的心，想你；美美的意，戀你；暖暖的懷，抱你；甜甜的笑，給你；癡癡的眼，看你；深深的夜，夢(mèng)你；滿(mǎn)滿(mǎn)的情，寵你；久久的我，愛(ài)你!不管從什么時(shí)候開(kāi)始，重要的是開(kāi)始以后不要停止；不管在什么時(shí)候結(jié)束，重要的是結(jié)束以后不要后悔。愛(ài)情來(lái)了，你還在猶豫么？5、美女，我注意你好久啦，就是不知道怎么表白。我翻來(lái)覆去，思來(lái)想去，最終想到一個(gè)大膽的辦法，我要俘虜你的心，讓你愛(ài)上我。愛(ài)上了嗎？6、對(duì)你的愛(ài)意，早已飛過(guò)萬(wàn)水千山，飛到你眼前，請(qǐng)你睜開(kāi)眼，仔細(xì)看認(rèn)真聽(tīng)，我的眼睛為你明亮，我的嗓音為你歌唱，來(lái)吧，讓我們一起舞動(dòng)愛(ài)情之

15、歌!7、愛(ài)你沒(méi)商量，你的眼睛眨一下，我就死去，你的眼睛再眨一下，我就活過(guò)來(lái)，你的眼睛不停地眨來(lái)眨去，于是我便死去活來(lái)!8、因?yàn)樯類(lèi)?ài)，找不到詞匯詮釋?zhuān)驗(yàn)樯類(lèi)?ài)，找不到言語(yǔ)概括，因?yàn)樯類(lèi)?ài)，只能發(fā)條短信，輕聲說(shuō)一聲我愛(ài)你”這不是三個(gè)字，而是一輩子!9、我對(duì)你的心是鮮啤酒，清澈甘冽；我對(duì)你的情是葡萄酒，味美甘甜；我對(duì)你的愛(ài)是刀燒酒，熱情濃烈；醉倒在懷，無(wú)限愛(ài)戀。10、人生短短幾十年，不要給自己留下了什么遺憾，想笑就笑，想哭就哭，該愛(ài)的時(shí)候就去愛(ài)，無(wú)謂壓抑自己。人生的苦悶有二，一是欲望沒(méi)有被滿(mǎn)足，二是它得到了滿(mǎn)足。11、一片瓊花天庭落，萬(wàn)里江山披銀河，冰凌也有相思苦，寫(xiě)意窗花含淚說(shuō)，曇花一現(xiàn)夜夢(mèng)短，早有

16、晨光盼春歌。想你，我的心會(huì)和你一起啟程，祈禱每一個(gè)黎明。12、戒指好比愛(ài)情，戴在手上，也是戴在心上；傷在心上，便也傷在手上。不敢碰的，是那心里的傷；不愿摘的，是那難舍的愛(ài)。13、在追求愛(ài)情的列車(chē)上，透過(guò)車(chē)窗，可以欣賞到許多優(yōu)美的景色，但是，請(qǐng)不要留戀，因?yàn)榻K點(diǎn)站才是真正的目的地。但愿我能夠成為你永遠(yuǎn)的終點(diǎn)站!14、愛(ài)一個(gè)人真的好難，讓我歡喜讓我憂！如果不讓我去愛(ài)你的話，我會(huì)更難受，更彷徨。所以為了我自己，我還是愛(ài)著你吧!15、誠(chéng)摯的微笑，每一次心跳，或許寂然無(wú)聲，卻勝過(guò)虛幻的海誓山盟；真情的碰撞，靈魂的契合，或許不夠浪漫，卻勝過(guò)無(wú)數(shù)的真情告白。16、此時(shí)此刻我又想起了你，想你的感覺(jué)是一種酸酸的痛！不能打電話告訴你，只想用文字親親你！