重組體選擇和鑒定

1、關于重組體的選擇與鑒定第一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月何為重組體？轉化子：在DNA分子克隆中，通常將導入外 源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉化子；重組體：含有重組DNA分子的轉化子；目的重組體：含有外源目的基因的重組體。第二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月為什么要對重組子進行選擇與鑒定 在轉化反應中,并非所有的細胞中都轉入重組DNA分子,即使所有的受體細胞都變?yōu)檗D化體,所獲得的轉化子仍是多種類型的DNA分子,因為在連接反應中會有以下幾種情況發(fā)生:載體和一個或數(shù)個串聯(lián)目的基因連接載體發(fā)生自連目的DNA分子發(fā)生自連未發(fā)生連接反應的載體和目的DNA片段第三張，PPT共

2、二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月為什么要對重組子進行選擇與鑒定 因此,在成千上萬個轉化子中，真正含有期望的重組DNA分子的比例很少，為了將含有外源DNA的宿主細胞和不含外源DNA的宿主細胞分開，以及將含有正確重組子的宿主細胞和含有其他外源DNA的宿主細胞分開，就需要設計出最易于篩選重組子的方案并加以驗證。第四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月常用的選擇方法第五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月直接選擇法第六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳學表型篩選方法一抗藥性篩選 分類：（1）抗藥性基因不失活（2）抗藥性基因失活常用的抗藥性選擇標記： 氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（

3、Cm） 卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet或Tc） 鏈霉素（Sm或Str）第七張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月抗藥性基因不失活基本原理： 外源基因片段插入載體的位點在抗藥性基之外， 不導致抗藥性基因的失活，仍能編碼抗藥性基因產(chǎn)物。含有這種重組子的轉化細胞可以在含有相應抗生素的瓊脂平板上生長成菌落，未能接受載體DNA的細胞因不能 生長而被排除。第八張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月抗藥性基因不失活實驗步驟：（1）培養(yǎng)基中加入千分之一的抗性藥物，再倒平板；（2）將轉化后的菌液均勻涂布在平板上；（3）放在37培養(yǎng)箱培養(yǎng)1216小時；（4）觀察菌落生長情況。第九張，PPT共二十九頁，

4、創(chuàng)作于2022年6月抗藥性基因不失活第十張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月抗藥性基因失活基本原理： 如果外源基因片段插入載體的位點在抗藥性基因中 間，導致抗藥性基因失活，這個抗藥性標志就會失活。檢測外源DNA插入作用的一種通用的方法是插入失活效應 。第十一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月抗藥性基因失活例如： 非重組的pBR322質粒DNA上的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因都是正常的。帶有這種質粒的受體菌可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素的雙抗性平板上生長。但是, 如果在該質粒的氨芐青霉素抗性基因內插入外源片段, 就會造成氨芐青霉素抗性基因失活, 攜帶這種質粒的宿主菌可以在四環(huán)素的平板上

5、生長, 而不能在氨芐青霉素抗性平板上生長。 第十二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月抗藥性基因失活第十三張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月抗藥性基因失活注意事項：（1）以Amp、Tc等抗生素作為選擇藥物時， 37培養(yǎng)時間約1216h，超過時間視為雜菌（假轉化子菌落）。（2）挑選單菌落作為轉化子以便進一步實驗 驗證。挑的菌落在培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。第十四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 遺傳學表型篩選方法二-半乳糖苷酶顯色法基本原理： 許多質粒載體具有-半乳糖苷酶顯色反應的檢測功能。 當外源DNA插入到它的lacZ基因（編碼-半乳糖苷酶）上時，可造成-半乳糖苷酶的失活，就可

6、通過大腸桿菌轉化子菌落在添加X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化鑒別出重組子和非重組子。（X-gal是-半乳糖苷酶的顯色底物）第十五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 遺傳學表型篩選方法二-半乳糖苷酶顯色法 舉例：pUC質粒：帶有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多種限制性核酸酶單一識別位點的多克隆位點，但并沒有破壞lacZ的閱讀框架。 大腸桿菌菌株：帶有-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下，pUC質粒和大腸桿菌編碼的-半乳糖苷酶片段都沒有活性。第十六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 遺

7、傳學表型篩選方法二 -半乳糖苷酶顯色法 當質粒轉化大腸桿菌后,可形成具有酶活性的蛋白質,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷）誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pUC質粒的多克隆位點上后，則會導致讀碼框架改變，表達蛋白失活，因此，在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。因此，根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應，可將重組質粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。第十七張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳學表型篩選方法二-半乳糖苷酶顯色法第十八張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳學表型篩選方法二-半乳糖苷酶顯色法注意事項：（1）由于被轉

8、化的基因產(chǎn)物作用于X-gal需要較長 時間，因此，觀察和確定轉化子菌落的培養(yǎng)時間可適當延長。與37溫箱取出后放4 冰箱幾小時后觀察效果更好；（2）為了防止假陽性需挑菌進一步驗證。第十九張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月間接選擇法第二十張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月依賴于重組子結構特征分析的篩選法之一快速裂解菌落鑒定分子大小基本原理： 由于外源片段插入的重組質粒與載體大小不同，故可以利用瓊脂糖凝膠電泳將重組體分離出來。第二十一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月依賴于重組子結構特征分析的篩選法之一快速裂解菌落鑒定分子大小優(yōu)點：直觀快捷，適用于插入片段較大的重組子的篩選。

9、缺點：不能鑒別插入片段大小相近的非目的基因片段。第二十二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月依賴于重組子結構特征分析的篩選方法二限制性內切酶酶切法基本原理： 根據(jù)已知的外源DNA序列的限制酶切圖譜，選擇一兩種內切酶切割質粒，電泳后比較電泳結果（DNA的帶數(shù)和長度）?；蛴煤线m的內切酶酶切插入片段，再用其它酶酶切這個片段，電泳后比較電泳結果是否符合預計的結果。第二十三張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月依賴于重組子結構特征分析的篩選方法二限制性內切酶酶切法第二十四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月依賴于重組子結構特征分析的篩選方法三PCR法基本原理： 在載體DNA分子中，外源D

10、NA插入位點兩側的序列多為已知，通過與插入位點兩側已知序列互補的引物，從單克隆中提取少量質粒DNA作為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析確定是否為重組子。第二十五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月依賴于重組子結構特征分析的篩選方法三PCR法注意事項： 如需檢測插入片段及其方向，則使用載體特異引物和方向插入特異引物或互換。 如只需確認是否存在插入片段，可用2個插入片段特異引物。 擴增反應前在94變性兩分鐘，有利于細菌的裂解，提高PCR產(chǎn)物擴增的成功。第二十六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月依賴于重組子結構特征分析的篩選方法四菌落雜交篩選主要原理 用體外標記基因DNA或相應的RNA為探針同轉化后的菌落進行原位雜交，篩選含重組DNA的克隆。這個方法可以快速地從數(shù)百個菌落中挑選出含有重組DNA的克隆。 該方法的優(yōu)點是通用性比較強，可以用來檢測任何一種插入的DNA序列。這種方法依據(jù)的是核酸分子雜交的原理，而不以插入的DNA序列能否實現(xiàn)基因表達為前提，因此，只要有可利用的標記探針就可檢測出重組質粒DNA。第二十七張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月總 結 重組子的篩選