造血干細(xì)胞研究以及應(yīng)用

1、關(guān)于造血干細(xì)胞的研究及應(yīng)用第一張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一：造血干/祖細(xì)胞的研究 1.造血活動與造血假設(shè) 2.造血干細(xì)胞與造血祖細(xì)胞 3.造血干/祖細(xì)胞的性能測試 4.造血干/祖細(xì)胞的分離純化 5.造血祖細(xì)胞的體外擴增與定向誘導(dǎo)分化二.造血干祖細(xì)胞的應(yīng)用與前景內(nèi)容第二張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月造血活動血細(xì)胞的生成 在胎兒，血細(xì)胞的生成開始于卵黃囊（02月），之后，在肝臟和脾臟（27月），骨髓（59月）為造血的主要場所。出生后，骨髓成為終身造血的大本營。 第三張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月血細(xì)胞類型與壽命 類型 1.淋巴系細(xì)胞： B淋巴細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞

2、 2.髓系細(xì)胞: 單核/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞，巨核細(xì)胞，紅細(xì)胞 3.血小板 壽命 人類紅細(xì)胞120d,中性粒細(xì)胞36 h,血小板9.6d第四張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月造血假設(shè) 以上事實都支持了這樣的假設(shè)：在造血細(xì)胞中存在著一類原始的造血干細(xì)胞，它們能自我更新，并向各系細(xì)胞分化，從而維持機體正常的造血功能，使人體有恒定的血細(xì)胞數(shù)量。第五張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一 造血干細(xì)胞（HSC）概念的提出： 1. 20世紀(jì)50年代，Lorentz等的骨髓移植實驗成功，表明在造血細(xì)胞中存在一類原始的造血細(xì)胞即造血干細(xì)胞。第六張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. 196

3、1年，Till和McCulloch發(fā)現(xiàn)將正常小鼠的骨髓細(xì)胞輸注給受致死劑量X線照射小鼠，經(jīng)911天后，受者小鼠脾臟表面生成了肉眼可見的由骨髓紅系細(xì)胞，粒系細(xì)胞，巨核系細(xì)胞或三者混合組成的脾集落，又稱脾結(jié)節(jié)。每一個脾集落稱為一個脾集落生成單位（CFU-S)。第七張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 應(yīng)用染色體C帶顯色和單個脾集落移植技術(shù)證明，每個脾集落中的細(xì)胞都是起源于單一細(xì)胞，通過它的增殖和分化而形成集落。這類生成脾集落的原始細(xì)胞稱為脾集落生成細(xì)胞，它具備了多能造血干細(xì)胞或淋巴系-髓系干細(xì)胞的基本特性。 脾集落生成細(xì)胞是一類最早被認(rèn)識的造血干細(xì)胞，也是目前惟一能被測試的一類造血干細(xì)胞。然

4、而，各個脾集落生成細(xì)胞的功能又是不均一的。第八張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 造血干細(xì)胞（HSC）與造血祖細(xì)胞（HPC） HSC 主要區(qū)別：高度的自我更新和維持能力 不能擴增 在體內(nèi)長期或永久地重建造血，永不消亡 HPC高度擴增能力部分早期HPC和全部的晚期HPC喪失自我更新和自我維持能力分化到終末必然調(diào)亡關(guān)系：HSC HSC 所有特征不變HPC 邊增殖邊分化來維持成熟血細(xì)胞的數(shù)量第九張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月造血干/ 祖細(xì)胞的性能測試 造血干細(xì)胞性能測試 1.經(jīng)典方法-脾集落測試法 2.HSC的自我更新和造血重建能力的測試 3.HSC的無限增殖和多向分化能力的測試

5、 造血祖細(xì)胞性能測試 第十張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Till和McCulloch于1961年建立的脾集落技術(shù)到目前為止只能應(yīng)用于小鼠等嚙齒類動物，諸如兔，犬和人等均不能用這一方法檢測。只能通過測定造血祖細(xì)胞的數(shù)量來相對說明造血干細(xì)胞的數(shù)量，至于性能則更難說明。 一般利用一些具有細(xì)胞遺傳標(biāo)志的HSC來生成脾集落，根據(jù)脾集落遺傳標(biāo)志的情況來研究造血干細(xì)胞的性能，主要有兩種細(xì)胞遺傳標(biāo)志： 1.輻射誘發(fā)的畸變?nèi)旧w：可能對細(xì)胞的正常增殖與分化有影響，因此很難評估造血干細(xì)胞的性能。 2.吳祖澤等利用天然性染色體作為細(xì)胞遺傳標(biāo)志1.經(jīng)典方法-脾集落測試法第十一張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2

6、022年6月2.HSC的自我更新和造血重建能力的測試早期，根據(jù)存在于骨髓，脾臟及肝臟等造血組織和器官中，以及的形態(tài)類似于淋巴細(xì)胞等特點，通過分離單個核細(xì)胞，以此群體細(xì)胞的特性研究來推測的性能。人類移植技術(shù)的成功，無疑是對人類HSC具有自我更新能力和長期造血重建能力的最有力證明。隨著現(xiàn)代化技術(shù)手段的迅猛發(fā)展，實驗動物學(xué)的發(fā)展為HSC的研究提供了很好的模型，為性能研究提供了更為直接的證據(jù)。第十二張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月動物體內(nèi)實驗驗證1.HSC 羊胎內(nèi)移植2.重癥聯(lián)合免疫缺陷癥(SCID) 或人免疫缺陷（HID）小鼠體內(nèi)移植3. SCID-Hu Thymus 動物模型體內(nèi)移植4.

7、SCID-Hu Bone動物模型體內(nèi)移植 第十三張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.SCID-Hu Bone動物模型體內(nèi)移植（1）先將一小段人胎肱骨埋于 SCID小鼠皮下，約8周后移植物的血管已基本長好。（2）小鼠經(jīng)射線全身照射后，把HLA不相符合的人類HSC待測樣品立即注射到移植物的骨髓腔內(nèi)。（3）再過8周，取出移植物，一部分樣品用作檢測骨髓腔內(nèi)細(xì)胞中的人類HSC和HPC，另一部分樣品再一次注入第二個受射線照射的帶有人肱骨移植物的SCID-HU Bone 動物模型體內(nèi)。（4）再過8周，檢測第2次移植物內(nèi)是否有人類HSC，早期HPC，髓系祖細(xì)胞，B細(xì)胞祖細(xì)胞及其前體細(xì)胞，便可證明注入

8、第1個胎骨移植物的原始樣品是否含有高度自我更新能力的人類造血干細(xì)胞。 第十四張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.HSC的無限增殖和多向分化能力的測試 早期研究還是以脾集落入手。1984年，吳祖澤等以天然性染色體作為標(biāo)志物，研究了小鼠骨髓中HSC的增殖與分化特性。具體過程如下： （1）取與受體小鼠性別相反的正常小鼠骨髓的有核細(xì)胞輸入到經(jīng)致死劑量射線照射的受者小鼠，第13天后，受者小鼠生成脾集落。 （2）之后將取自一個脾集落的細(xì)胞輸入到經(jīng)致死劑量射線照射的，與第一受者小鼠性別相同的第二受者小鼠體內(nèi)，經(jīng)過78周后，測試第二受者小鼠脾，淋巴結(jié)的T 細(xì)胞，B細(xì)胞,骨髓中的細(xì)胞及脾集落的雄，雌核

9、型分布，并將其骨髓細(xì)胞輸注到經(jīng)致死劑量照射的，與第一，二受者小鼠性別相同的第三受者 （3）經(jīng)8周后再測試第三只受者小鼠脾，淋巴結(jié)的T細(xì)胞，B細(xì)胞，骨髓中的細(xì)胞及脾集落的雌，雄核型分析。 第十五張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 結(jié)果表明： 1.通過最初一個脾集落生成細(xì)胞在第一受者小鼠脾臟內(nèi)生成的一個脾集落，在第二，三受者小鼠中不斷增殖，脾集落生成細(xì)胞在數(shù)量上以指數(shù)形式不斷增加。每一個脾集落都是單一細(xì)胞增殖和分化的結(jié)果。 2.脾集落生成細(xì)胞不僅在經(jīng)射線照射的受者小鼠內(nèi)具有重建髓細(xì)胞的能力，同時，也具有重建淋巴組織中T細(xì)胞，B細(xì)胞的能力。 第十六張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月隨

10、著各種實驗技術(shù)手段的不斷發(fā)展 裴雪濤等利用FACS自動細(xì)胞分選系統(tǒng)分選出單個CD34+細(xì)胞亞群細(xì)胞CD34+CD38+及CD34+CD38-，在96孔板無血清體系中加入各種細(xì)胞因子（如SCF,IL,GM-CSF,G-CSF及EPO）刺激，進(jìn)行培養(yǎng)。 結(jié)果表明: CD34+CD38-單個細(xì)胞可形成原代集落，并可向紅系，粒系，巨噬系，巨核系等細(xì)胞分化。并證明了它的性能接近于造血干細(xì)胞，同時也證明了HSC具有多向分化的能力。第十七張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月造血祖細(xì)胞性能測試起始于1965年P(guān)luznik和Sachs建立的小鼠骨髓細(xì)胞體外瓊脂培養(yǎng)技術(shù)。即在CSF 的作用下，造血細(xì)胞可在

11、瓊脂上形成集落，每一個集落稱為一個集落生成單位。（CFU）. 造血細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，在不同刺激因子的作用下，可形成人們可以辨認(rèn)的各系細(xì)胞。生成各系集落的細(xì)胞被稱為各系的祖細(xì)胞，或各系的集落生成細(xì)胞（CFC）,如粒系-巨噬系祖細(xì)胞或稱粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落生成細(xì)胞（CFC-GM）。 第十八張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月培養(yǎng)體系如下：有核細(xì)胞+培養(yǎng)液 3.9ml 馬血清 2.5ml GM-CSF 0.8ml(2U) 5%瓊脂 0.4ml第十九張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月人們可以根據(jù)各系祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)，對其性能加以研究。近年來HSC/HPC表面標(biāo)志（即CD抗原）研究的發(fā)展大

12、大促進(jìn)他們的分離，純化，鑒定及性能等研究。CD34抗原表達(dá)一直持續(xù)到晚期HPC。用CD33,CD38,HLA-DR及系特異性單克隆抗體（Lin）可進(jìn)一步精選HSC和HPC。第二十張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月近年來，對造血干細(xì)胞的深入研究表明，HSC除了具有自我更新和多向分化的基本特性外，還具有以下特點: 1.絕大多數(shù)干細(xì)胞處于Go期 2.高度表達(dá)CD34和CDw90抗原 3.缺乏 CD33，CD71等系相關(guān)抗原 4.具有 HLA,CD45RA高相對分子質(zhì)量形式 5.低表達(dá)或不表達(dá)HLA-DR 6.羅丹明123 低吸收率Rh123可選擇性的結(jié)合在各種活細(xì)胞的線粒體上，增殖的細(xì)胞都含

13、有更多更大更活躍的線粒體，故可吸收RH123，顯示明亮的熒光第二十一張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月目前認(rèn)為，高增殖潛能集落生成細(xì)胞（HPP-CFC）和長期培養(yǎng)啟動細(xì)胞（LTC-IC）為早期的造血祖細(xì)胞。 HPP-CFC的性能： 研究表明：可以在體外形成較大的集落，自我更新能力比 CFU-Mix 更強，細(xì)胞多處于靜止?fàn)顟B(tài)，很少進(jìn)入增殖周期，對細(xì)胞周期S期毒劑有耐受性。在較晚時期形成集落的細(xì)胞則為更為早期的細(xì)胞。 有如下特性： 1.具有體內(nèi)外抗細(xì)胞毒藥物5-Fu的作用 2.可重建受致死劑量射線照射小鼠的骨髓造血 3.具有向巨噬系，紅系，粒系以及巨核系等多向分化的潛能 4.應(yīng)答各種細(xì)胞因

14、子第二十二張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月長期培養(yǎng)啟動細(xì)胞（LTC-IC)是指在長期培養(yǎng)體系中培養(yǎng)5周后所測得的集落細(xì)胞，到目前為止，長期培養(yǎng)體系是模仿人體內(nèi)造血微環(huán)境的最佳體外模式。LTC-IC在有基質(zhì)細(xì)胞層的培養(yǎng)中可以維持造血達(dá)幾個月。最近又發(fā)現(xiàn)了較LTC-IC更為原始的造血祖細(xì)胞群延長長期培養(yǎng)啟動細(xì)胞（ELTC-IC），增殖期出現(xiàn)晚，生成更多的子細(xì)胞。第二十三張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.造血干/祖細(xì)胞的分離純化方法: 造血干 /祖細(xì)胞在增殖，分化過程中表面抗原的變化是其分離純化的標(biāo)志，而高親和力單克隆抗體的制備和相關(guān)分離純化技術(shù)的完善是其基礎(chǔ)。其中，CD34抗

15、原是HSC/HPC分離純化的主要標(biāo)志。 第二十四張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月CD34細(xì)胞及其亞群的分離純化與性能細(xì)胞表面 CD34抗原是高度糖基化型膜蛋白，主要存在于幼稚造血干/祖細(xì)胞，部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞和少量的內(nèi)皮細(xì)胞表面，其表達(dá)的水平與細(xì)胞的分化密切相關(guān)。目前用于CD34細(xì)胞純化的方法主要有： 1.熒光激活細(xì)胞分選（FACS） 2.免疫吸附分離 （1）單克隆抗體鋪展貼壁 （2）生物素-抗生物素免疫親和層析吸附 （3）免疫磁珠細(xì)胞分選 3.利用細(xì)胞物理學(xué)特性分離 （1）密度梯度離心 （2）淘洗離心第二十五張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一：CD34+細(xì)胞的陰性富集定義：

16、利用各種方法去除成熟的血細(xì)胞和免疫活性細(xì)胞，從而達(dá)到HSC/HPC 的富集。方法： 1.使用不同密度梯度的Ficoll，Percoll淋巴細(xì)胞分離液富集單個核細(xì)胞（MNC），會得到明顯的富集。 2.淘洗離心技術(shù) 3.利用花生凝集素和大豆凝集素富集。 由于這幾種富集方法均屬非特異性分離，分選細(xì)胞的純度和產(chǎn)率均較低。故目前極少用于CD34+細(xì)胞的富集。第二十六張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月CD34+細(xì)胞的陽性富集定義：直接利用 HSC /HPC在增殖，分化過程中表面抗原的變化，通過其特異性單克隆抗體將其分離純化出來，從而達(dá)到的富集，即為陽性富集。方法： 1.FACS分選可獲得高純度的C

17、D34+細(xì)胞，并可對其他方法分選的靶細(xì)胞進(jìn)行純度檢測和25個參數(shù)同時標(biāo)志的亞群細(xì)胞進(jìn)行分選。但該儀器價格昂貴，分選速率較慢，因此主要用于CD34+細(xì)胞亞群（如CD34+CD38-,CD34+HLA-DR-等）的分選。 2.廣泛應(yīng)用于CD34+細(xì)胞純化的方法是抗CD34單克隆抗體介導(dǎo)的免疫吸附，這類方法具有分離速度快，純度高，分離細(xì)胞量大以及經(jīng)濟(jì)和操作簡便等優(yōu)點。第二十七張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月例如： 利用FACS對不同來源的造血細(xì)胞進(jìn)行CD34和CD38雙標(biāo)志參數(shù)分析和分選。得到CD34+CD38+和CD34+CD38-兩個亞群在骨髓，臍帶血和外周血MNC中所占的比例明顯不同

18、。 結(jié)果表明：CD34+CD38+細(xì)胞大多處于造血祖細(xì)胞階段，可形成大量的各系造血細(xì)胞集落，但不能維持長期造血；而CD34+CD38-細(xì)胞則更幼稚或更接近于造血干細(xì)胞。第二十八張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月造血祖細(xì)胞體外擴增與定向誘導(dǎo)分化造血祖細(xì)胞體外擴增 不同的造血因子組合，SCF加IL-1,IL-3,IL-6,EPO 等可刺激造血細(xì)胞擴增。但是，這些細(xì)胞因子的組合在擴增造血細(xì)胞的同時也明顯地加速了造血干/祖細(xì)胞的分化，到21天時絕大部分細(xì)胞已分化成為較成熟的血細(xì)胞。 因此，如何在擴增造血細(xì)胞的同時，又盡可能地保留造血干細(xì)胞，并擴增早期造血祖細(xì)胞，使其在數(shù)量上和功能上滿足臨床治療

19、的需要，這就成為體外擴增研究的重點。第二十九張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月今年來，經(jīng)過各國學(xué)者的不斷努力，這方面的研究已取得了明顯的進(jìn)展。 1.造血生長因子的合理組合。 早期造血細(xì)胞的細(xì)胞因子（SCF，IL-3，GM-SCF） 抑制細(xì)胞凋亡的存活因子（SCF，IL-1，IL-6） 晚期系特異性細(xì)胞因子（G-CSF，EPO，TPO） 2.CD34+CD38-亞群造血祖細(xì)胞的擴增 3.造血負(fù)調(diào)控因子的應(yīng)用 例如：利用TGF-，TNF-，白血病抑制因子阻止細(xì)胞分化的作用。 4.基質(zhì)細(xì)胞支持的體外擴增 5.持續(xù)灌注培養(yǎng)體系第三十張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月造血祖細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化利用造血干/ 祖細(xì)胞具有多向分化的潛能，通過細(xì)胞因子的不同組合，定向地誘導(dǎo)其分化，