研究生植物組織培養(yǎng)

1、.：.；第一章 植物組織培育的運(yùn)用植物組織培育可運(yùn)用于以下幾個(gè)方面 ：1挽救瀕于滅絕的植物；2快速繁衍稀有植物或有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物；3、消費(fèi)脫毒苗；4、利用組織培育的資料作為植物生物反響器；多種中草藥資源匱乏，產(chǎn)量缺乏，甚至瀕于滅絕。利用組織和細(xì)胞培育的方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)消費(fèi)；可不再依靠于自然環(huán)境，不僅可以處理現(xiàn)有困難，而且可以經(jīng)過挑選高產(chǎn)有效成分的細(xì)胞系，來(lái)提高其藥用價(jià)值。如用培育的人參懸浮細(xì)胞來(lái)消費(fèi)人參皂苷。利用培育的植物細(xì)胞和組織作為生物反響器，也可消費(fèi)某些蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素、疫苗等。5、組織培育結(jié)合超低溫可經(jīng)濟(jì)有效地保管植物種質(zhì)資源 6、組織培育是轉(zhuǎn)基因技術(shù)不可或缺的組成部分；7、作

2、物育種1單倍體育種：采用花藥培育可縮短雜合體純化所需的時(shí)間，節(jié)省土地，假定兩個(gè)雜交親本在n個(gè)獨(dú)立遺傳的位點(diǎn)上彼此不同，經(jīng)過花藥培育，在實(shí)際上只需有2n個(gè)F1代花粉植株，就有能夠得到一個(gè)所需求的基因組合，而傳統(tǒng)育種方法，那么至少要有4n個(gè)F1植株才干得到一個(gè)所需求的基因組合。2在遠(yuǎn)緣雜交中，經(jīng)過離體授粉或原生質(zhì)體交融有能夠抑制受精前妨礙，經(jīng)過幼齡合子胚培育可以抑制受精后妨礙，經(jīng)過體細(xì)胞交融還有能夠制造出細(xì)胞質(zhì)雜種。3經(jīng)過細(xì)胞培育，在細(xì)胞程度上進(jìn)展突變體選擇，可在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而提高選擇效率，節(jié)省時(shí)間和土地面積。 4體細(xì)胞無(wú)性系變異是除有性雜交和理化誘變之外的第三個(gè)變異

3、來(lái)源。 8、用人工種皮包被體細(xì)胞胚制造人工種子，為稀有和珍貴物種的繁衍提供了一種高效的手段。9、用于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、胚胎學(xué)、基因工程、植物發(fā)育等的根底研討。10、試管花第二章 植物組織培育的開展簡(jiǎn)史一、 探求階段(20世紀(jì)初至20世紀(jì)30年代中) 20世紀(jì)初，德國(guó)植物生理學(xué)家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織可不斷分割，直至分到單個(gè)細(xì)胞的觀念，并想象離體細(xì)胞具有再生完好植株的潛力。Haberlandt初次進(jìn)展了離體細(xì)胞培育的實(shí)驗(yàn)，在1902年發(fā)表的“植物離體細(xì)胞培育實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，提出了胚囊液在組織培育中的作用和看護(hù)培育法等科學(xué)的預(yù)見。 1904年Hannig在無(wú)機(jī)鹽和

4、蔗糖溶液中培育了蘿卜和辣根菜的胚，并使這些胚在離體條件下長(zhǎng)到成熟。Laibach(1925，1929)把由亞麻種間雜交構(gòu)成的不能成活的胚剖出，在人工培育基上培育至成熟，從而證明了胚培育在植物遠(yuǎn)緣雜交中利用的能夠性；1922年，美國(guó)的Robbins和德國(guó)的Kotte分別報(bào)道培育離體根尖獲得某些勝利。1934年，White勝利離體培育了番茄的根尖。 二、 奠基階段(20世紀(jì)30年代中至50年代末) 1、White1934年在番茄根培育實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用的培育基包含無(wú)機(jī)鹽、酵母浸出液和蔗糖。他后來(lái)(1937)用3種B族維生素吡哆醇、硫胺素和煙酸，取代酵母浸出液獲得勝利。認(rèn)識(shí)了B族維生素對(duì)植物生長(zhǎng)的重要意義。

5、2、Gautheret(1934)在山毛柳等構(gòu)成層組織的培育中發(fā)現(xiàn)，雖然在含有葡萄糖和鹽酸半胱氨酸的Knop溶液中，這些組織可以不斷增殖幾個(gè)月，但只需在培育基中參與了B族維生素和IAA以后，構(gòu)成層組織的生長(zhǎng)才干顯著添加。1939年Gautheret延續(xù)培育胡蘿卜根構(gòu)成層獲得初次勝利。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜，也建立了類似的延續(xù)生長(zhǎng)的組織培育物。因此，Gautheret、White和Nobecourt一同被譽(yù)為植物組織培育的奠基人。3、Skoog(1944)以及Skoog和崔澂等(1951)發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷不但可以促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，而且還能解除培育基

6、中生長(zhǎng)素(IAA)對(duì)芽構(gòu)成的抑制造用，誘導(dǎo)芽的構(gòu)成，從而確定了腺嘌呤與生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根構(gòu)成的主要條件之一。 4、1952年，Morel和Martin初次證明，經(jīng)過莖尖離體培育，可以由已受病毒侵染的大麗花中獲得無(wú)病毒植株。 5、1953-1954年，Muir進(jìn)展單細(xì)胞培育獲得初步勝利。把萬(wàn)壽菊和煙草的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培育基中，放在搖床上振蕩，構(gòu)成了由單細(xì)胞和細(xì)胞聚集體組成的細(xì)胞懸浮液。Muir等還用機(jī)械方法由細(xì)胞懸浮液和容易散碎的愈傷組織中分別得到單細(xì)胞，把它們置于一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培育，使細(xì)胞發(fā)生了分裂。 6、1955年，Miller等由鯡魚精子DNA中分別出一種初次為人所

7、知的細(xì)胞分裂素，并把它定名為激動(dòng)素(kinetin)。7、1957年，Skoog和Miller提出了植物激素控制器官構(gòu)成的概念，指出在煙草髓組織培育中，根和莖的分化是生長(zhǎng)素對(duì)細(xì)胞分裂素比率的函數(shù)。8、1958年，Steward等以胡蘿卜為資料，初次經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明了Haberlandt關(guān)于細(xì)胞全能性的想象，成為了植物組織培育研討歷史中的一個(gè)里程碑。9、1958-1959年，Reinert和Steward分別報(bào)道，在胡蘿卜愈傷組織培育中構(gòu)成了體細(xì)胞胚。 三、迅速開展階段(20世紀(jì)60年代至如今) 1、根底研討： 1965年，Vasil和Hildebrandt用一種化學(xué)成分確定的培育基，由分隔培育的煙

8、草單細(xì)胞獲得了完好的再生植株，進(jìn)一步證明了植物細(xì)胞的全能性 。2、原生質(zhì)體培育獲得艱苦突破： 1960年Cocking等用真菌纖維素酶分別植物原生質(zhì)體獲得勝利。1971年，Takebe等初次獲得了煙草原生質(zhì)體再生植株。1972年，Carlson等經(jīng)過兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體的交融，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種。3、花藥培育獲得顯著成果： 1964年，Guha和Maheshwari報(bào)道，在毛曼陀羅中經(jīng)過離體花藥培育由小孢子直接發(fā)育成胚。 1967年，Bourgin和Nitsch經(jīng)過花藥培育獲得了完好的煙草植株。 4、微繁技術(shù)得到廣泛運(yùn)用 1960年，Morel建立了一個(gè)離體無(wú)性繁衍蘭花的方法，繁衍系數(shù)

9、極高。由于這一方法有宏大的適用價(jià)值，很快被蘭花消費(fèi)者所采用，迅速建立起“蘭花工業(yè) 。第三章 植物組織培育有關(guān)的根本概念一、植物細(xì)胞全能性(totipotency) 細(xì)胞全能性:指一個(gè)活的植物細(xì)胞，只需有完好的膜系統(tǒng)和細(xì)胞核，它就會(huì)有一整套發(fā)育成一個(gè)完好植株的遺傳根底，在一個(gè)適當(dāng)?shù)臈l件下可以經(jīng)過分裂、分化再生成一個(gè)完好植株。從實(shí)際上講，只需是一個(gè)活的細(xì)胞，都有再生出一個(gè)完好植株的潛力，但實(shí)踐情況并非如此簡(jiǎn)單。就目前所知，細(xì)胞的再生潛力與其分化程度呈負(fù)相關(guān)，就是說(shuō)細(xì)胞分化程度越高其再生才干越低，所以應(yīng)盡量選取幼嫩的植物組織作為培育的實(shí)驗(yàn)資料。 二、細(xì)胞分化、脫分化與再分化 細(xì)胞分化分生性細(xì)胞在形狀

10、構(gòu)造和功能上發(fā)生永久性(不可逆轉(zhuǎn)性)適度變化的過程。脫分化由失去分裂才干的細(xì)胞回復(fù)到分生性形狀并進(jìn)展分裂，構(gòu)成無(wú)分化的細(xì)胞團(tuán)即愈傷組織的過程。 再分化由無(wú)分化的愈傷組織細(xì)胞再轉(zhuǎn)變成為具有一定構(gòu)造，執(zhí)行一定生理功能的細(xì)胞團(tuán)和組織，構(gòu)成一個(gè)完好的植物體或植物器官的過程。 三、器官發(fā)生 器官發(fā)生由愈傷組織的部分細(xì)胞先分化產(chǎn)生芽(或根)，再在另一種培育基上產(chǎn)生根(或芽)，構(gòu)成一個(gè)完好植株。第四章 植物組織培育所需的根本設(shè)備與條件一個(gè)理想的植物組織培育室應(yīng)包括：1、化學(xué)藥品室；2、培育基配制室；3、滅菌室；4、接種室；5、培育室；6、培育物的檢測(cè)和察看記錄室。 一、化學(xué)藥品室 應(yīng)配置幾個(gè)藥品櫥、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、

11、萬(wàn)分之一和百分之一的電子天平。室內(nèi)還應(yīng)放一臺(tái)大容量的冰箱，用來(lái)分門別類地保管激素、抗生素和各種需低溫保管的物品。組織培育所需主要藥品的存放要求如下： 1、可室溫存放的藥品：無(wú)機(jī)物、蔗糖、 鹽酸、氫氧化鈉，95酒精，瓊脂。 2、宜于零上低溫存放的化學(xué)藥品: 有機(jī)物、激素3、該當(dāng)在一20下保管的藥品： 液體抗生素等。 二、培育基配制室 需求大于40m2的一個(gè)房間或更大些，為了方便起見可將房間分為兩個(gè)區(qū):一是玻璃器皿的清洗、消毒、枯燥區(qū)：二是培育基配制區(qū)：應(yīng)有大型實(shí)驗(yàn)臺(tái)假設(shè)干個(gè)，還應(yīng)配備常溫冰箱一臺(tái)，電爐(1000W，2000W)，微波爐，放置移液管、微量移液器的架子，酸度計(jì)等。 三、滅 菌 室 滅

12、菌室面積可小一些，其內(nèi)除放滅菌鍋外，最好還有暫時(shí)存放培育基、培育器皿的架子，也應(yīng)有自來(lái)水安裝。滅菌室可根據(jù)滅菌鍋的多少，任務(wù)量大小來(lái)確定面積，要求房間能有較好的通風(fēng)散熱條件，且要配備專門的電源線路，由于電熱滅菌鍋的耗電量很大。 四、接 種 室 接種室是對(duì)培育的植物資料進(jìn)展無(wú)菌操作的地方，應(yīng)有超凈任務(wù)臺(tái)、放置培育容器的架子等。整個(gè)房間最好設(shè)有緩沖間和雙層門窗，以防灰塵和微生物。房間內(nèi)最好裝有紫外燈或經(jīng)常噴灑殺菌劑，以抑制過多微生物生長(zhǎng)。任務(wù)人員在進(jìn)入接種室之前在緩沖間內(nèi)改換衣服、鞋帽、穿好任務(wù)服，戴上口罩、防塵帽，換上拖鞋才干進(jìn)入接種區(qū)，進(jìn)入接種區(qū)之后隨手把活動(dòng)門關(guān)上。 五、培育室 培育室最重要

13、的是要恒溫、恒濕，無(wú)塵且空氣流通。溫度應(yīng)維持在(253)，相對(duì)濕度應(yīng)在5060%。培育室內(nèi)有規(guī)律地安放培育架或搖床。培育室內(nèi)一切光照和黑暗應(yīng)由定時(shí)器自動(dòng)控制。整個(gè)培育室內(nèi)還應(yīng)裝有一個(gè)或多個(gè)紫外燈，以便能定時(shí)對(duì)整個(gè)房間進(jìn)展殺菌處置，特別是在夏天潮濕、霉雨季節(jié)，最好每天在晚上用紫外燈殺菌30 min以上。培育室內(nèi)的地面、墻壁、培育架及一切器物的外表都應(yīng)經(jīng)常清洗、擦拭以防過多灰塵和微生物繁殖。 六、培育物的檢測(cè)與察看記錄室 對(duì)培育物進(jìn)展及時(shí)的檢測(cè)和察看記錄是研討植物組織培育的重成部分之一，如不及時(shí)察看記錄或?qū)ε嘤锏男螤?、?gòu)造、生理變化以及培育基變化等進(jìn)展及時(shí)檢測(cè)，就不能夠獲得準(zhǔn)確有效一手資料，也就

14、不能及時(shí)地發(fā)現(xiàn)和找出問題，提出處理問題的方法和改良培育的方案。檢測(cè)與察看記錄室最好單獨(dú)設(shè)立一個(gè)房里面擺放實(shí)體解剖鏡、普通光學(xué)顯微鏡、顯微照相和記錄設(shè)備 。第五章 植物組織培育常用培育基成分及培育基配制目前所運(yùn)用的培育基有10余種之多，大部分都是在前人研討的根底上經(jīng)過分析綜合和改良而成的。例如，White培育基是Uspenski和Uspenskaia(1925)的藻類培育基演化的結(jié)果，被廣泛用于根的培育；Gautheret培育基是建立在Knop營(yíng)養(yǎng)液(1865)根底上的。以后的培育基大部分是在White和Gautheret培育基的根底上改良而成。一、培育基的成分一、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分(包括大量元素，微

15、量元素和鐵鹽)1、大量元素：普通指在培育基中的濃度大于O.5mmolL的元素。氮：常以硝態(tài)氮(N03)或氨態(tài)氮(NH4)，或兩者相互配合的方式存在。缺氮時(shí)愈傷組織會(huì)出現(xiàn)花樣素苷的顏色，愈傷組織內(nèi)部不能構(gòu)成導(dǎo)管。 磷：常以NaH2P04H2O、KH2P04或(NH4)H2P04的方式提供。鉀：常以KCl、KN03或KH2P04方式。 鈣：常以CaCl22H2O、Ca(N03)2。鎂：常以MgS047H2O的方式，既提供了鎂也提供了硫。缺硫時(shí)培育的植物組織會(huì)明顯的退綠；缺磷或鉀時(shí)細(xì)胞會(huì)過度生長(zhǎng)，愈傷組織表現(xiàn)出極其蓬松形狀。 2微量元素：指小于O.5mmolL的元素。 主要包括鐵(Fe)、錳(Mn)

16、、銅(Cu)、鋅(Zn)、氯(C1)、硼(B)和鉬(Mo)等。 鐵作為一種微量元素，對(duì)植物也是必需的，但由于Fe的特殊性質(zhì)，即很不穩(wěn)定、易沉淀，需求在酸性條件下才干比較穩(wěn)定，故在培育基配制時(shí)經(jīng)常把Fe鹽單獨(dú)配制，且常以螯合物的方式，把FeS04和它的螯合劑乙二胺四乙酸鈉(Na2EDTA)先分別配成溶液，再相互混合使構(gòu)成螯合鐵，以防止沉淀和協(xié)助 被植物吸收。 二、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分 維生素: 除維生素B1、維生素B6、煙酸之外，在部分培育基中還添加維生素C(抗壞血酸)、維生素H(生物素)等。甘氨酸(氨基乙酸)和肌醇(環(huán)己六醇):肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的方式參與由Ca介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，在某些

17、植物或某些組織的培育中還加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、西紅柿汁和酵母浸出物等。 三、碳水化合物用作碳源的碳水化合物通常為蔗糖或葡萄糖，用量通常為24%，高者可達(dá)5，亦可用市售的白糖所替代。 幾乎一切的培育物在蔗糖作為碳源時(shí)生長(zhǎng)都比較好，只需少數(shù)植物或組織在葡萄糖或果糖作為碳源的培育基上生長(zhǎng)更適宜。也有用麥芽糖、半乳糖、甘露糖、山梨醇和乳糖作為碳源的。 四、植物生長(zhǎng)調(diào)理物質(zhì) 在植物組織培育中運(yùn)用的生長(zhǎng)調(diào)理物質(zhì)主要有生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類兩大類，少數(shù)培育基中還添加赤霉素GA3等。1生長(zhǎng)素：主要被用于誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分裂和根的分化。常用的生長(zhǎng)素有：NAA(萘乙酸)，IAA(吲

18、哚乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，NOA(萘氧乙酸)，2，4一D(2，4一二氯苯氧乙酸)，2，4，5一T(2，4，5一三氯苯氧乙酸)。對(duì)愈傷組織增殖最有效的是2，4一D，特別是對(duì)單子葉植物。但2，4-D是一種極有效的器官發(fā)生抑制劑，不能用于啟動(dòng)根和芽分化的培育基中。 2細(xì)胞分裂素 運(yùn)用細(xì)胞分裂素的主要目的是刺激細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的分化、葉片擴(kuò)展和莖長(zhǎng)高，抑制根的生長(zhǎng)。 常用的天然CTK主要有：玉米素,玉米素核苷，二氫玉米素 。常用的人工合成CTK主要有: 激動(dòng)素(KT)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、2ip(異戊烯氨基嘌呤)、和TDZ(thidiazuron，噻二唑苯基脲)等 。3赤霉素 ：主要是GA

19、3。用時(shí)需過濾滅菌；促進(jìn)試管苗伸長(zhǎng)。 五、瓊脂或其他支持物 除液體懸浮培育外，一切的培育物都應(yīng)生長(zhǎng)在固體或半固體的培育基上,以防止培育物沉人液體培育基，因缺氧而死亡。瓊脂是一種極為理想的支持物。它是由海藻得來(lái)的多糖類物質(zhì)，但并不是培育基中的必需成分，只是作為一種凝固劑使培育基變成固體或半固體形狀。六、其他添加物 ：酵母提取物，椰乳，香蕉粉，橘子汁，活性炭，浸透調(diào)理劑、水解酪蛋白、水解乳蛋白等。1活性炭：能從培育基中吸附許多有機(jī)物和無(wú)機(jī)物分子，可去除培育中植物組織在代謝過程中產(chǎn)生的、對(duì)培育物有不良或毒副作用的物質(zhì)，也可以調(diào)理激素的供應(yīng)?；钚蕴窟€有刺激胚胎發(fā)生(如煙草花藥培育)或組織生長(zhǎng)和形狀發(fā)生

20、的作用。2浸透調(diào)理劑：常選用一些代謝微弱的糖來(lái)充任，如甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇等，這些糖根本上不被培育的植物組織所吸收，而只存留在培育基中，起到調(diào)理浸透的作用。3抗生素：培育的植物組織內(nèi)部攜帶有病原物，外表消毒不處理問題時(shí)，可在配置培育基時(shí)添加抗生素，如加200300U的慶大霉素可使細(xì)菌污染遭到很好的控制。 二、培育基的選擇 1選擇適宜的培育基 根本培育基： MS培育基適宜于大多數(shù)雙子葉植物，B5和N6培育基適宜于許多單子葉植物， White培育基適于根的培育 激素濃度和相對(duì)比例確實(shí)定 先參考已有的報(bào)道，看能否有用一樣植物、一樣組織或相近者做過勝利或失敗的實(shí)驗(yàn)，假設(shè)有那么直接作為參考；假

21、設(shè)沒有，那么在建立激素配比中，將每一種擬運(yùn)用的激素選擇35個(gè)程度，再按隨機(jī)組合的方式建立起如下的實(shí)驗(yàn)方案。 三、培育基的配制 一、配制母液二、配制培育基 (三)、配制培育基時(shí)應(yīng)留意的有關(guān)問題 1、高溫滅菌的根本過程 檢查滅菌鍋內(nèi)有無(wú)足夠量的水，最好用蒸餾水或去離子水，由于自來(lái)水含有較多的礦物質(zhì)，容易使鍋內(nèi)構(gòu)成水垢，影響鍋的運(yùn)用壽命。將需求滅菌的器皿、培育基等放入鍋內(nèi)，不要裝得太滿，以不超越鍋的容量34為宜。 2、高溫下培育基成分的降解 經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新穎溶液的10。NAA、2，4一D、激動(dòng)素和玉米素在高溫下是比較穩(wěn)定的。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成D-葡萄糖和D-

22、果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培育的植物組織生長(zhǎng)的物質(zhì)。高溫可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反響。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性，但假設(shè)培育基的pH值高于5.5，那么維生素B1會(huì)被迅速降解。 第六章 無(wú)菌操作技術(shù)與設(shè)備一、干熱滅菌 干熱滅菌就是在180的烘箱內(nèi)對(duì)器皿進(jìn)展殺菌處置，是一種徹底殺死微生物的方法。適宜于干熱滅菌的器皿和物品有：玻璃器皿，如三角瓶、燒杯、量筒等；金屬物品，如鑷子、解剖刀、剪刀等；可以高溫滅菌的塑料制品。二、濕熱滅菌濕熱滅菌就是人們平常所說(shuō)的蒸汽滅菌。滅菌的溫度為121，壓力為103.4 kPa，滅菌時(shí)間除液體外要求在121下維持15 min以上。液體滅菌時(shí)間可根據(jù)體積而定，

23、體積越大，需求時(shí)間越長(zhǎng)，如2.5L需20min，10L需28min，25L需31min。 濕熱滅菌時(shí)應(yīng)留意以下問題：1、不能隨意延伸滅菌時(shí)間，由于延伸時(shí)間會(huì)使一些化合物過多分解，特別是蔗糖會(huì)分解為單糖，使培育基pH降低，瓊脂不能很好的凝固；2、假設(shè)滅菌鍋沒有吹干程序，從鍋內(nèi)取出的紙制品、紗布等最好立刻轉(zhuǎn)到60的溫箱中吹干；3、由于錫箔紙不透氣，引薦運(yùn)用牛皮紙或報(bào)紙等包裝物品，以利于水分快速蒸發(fā)；4、滅菌鍋所裝蒸餾水或去離子水應(yīng)經(jīng)常改換，以防止微生物污染和水中雜質(zhì)過多，給滅菌鍋和要滅菌的物品帶來(lái)不利影響； 三、微過濾滅菌是使需求滅菌的液體經(jīng)過一個(gè)微孔濾膜，以除去液體中的微生物、微顆粒等，過濾的范

24、圍是0.025lOm。這種方法對(duì)于高溫滅菌容易引起分解的物質(zhì)最為適宜，如容易分解的維生素、激素、植物組織提取物、抗生素等。微過濾滅菌的關(guān)鍵部分是微孔濾膜，如要徹底去除細(xì)菌、酵母等微生物，最好運(yùn)用0.22m的濾膜。如要獲得原生質(zhì)體，那么可運(yùn)用O.45m的濾膜。 四、化學(xué)藥物滅菌 1、鑷子、解剖刀等器具的滅菌：將預(yù)備運(yùn)用的鑷子、解剖刀等浸入75%酒精中，器具的大半部分都被酒精浸泡。運(yùn)用時(shí)取出鑷子或解剖刀，放在酒精燈上加熱至酒精完全除去為止，用完后再放回75%酒精中。2、外植體的滅菌：將植物資料先用自來(lái)水加洗潔精少許浸泡10min以上，浸泡期間要悄然攪動(dòng)幾次，以便使植物資料與溶液充分接觸，然后用自來(lái)

25、水沖洗10 min左右。在超凈任務(wù)臺(tái)上，將資料在70酒精中進(jìn)展外表預(yù)消毒30秒，倒掉酒精，再用O.1升汞(HgCl2)進(jìn)展消毒8分鐘左右，或用1次氯酸鈉(NaOCl)或次氯酸鈣Ca(OCl)2消毒20 min左右，詳細(xì)時(shí)間要根據(jù)資料而定。然后用無(wú)菌水沖洗34次，每次2 min左右。次氯酸鹽在pH6.O左右時(shí)活性較高，高于8.0時(shí)幾乎無(wú)活性；通常往消毒液中添加幾滴吐溫20或吐溫80等外表活性劑，以提高滅菌效果。 五、抗生素滅菌 首先必需弄清楚要?dú)⑺赖氖钦婢?、?xì)菌還是病毒，是哪類真菌、哪類細(xì)菌或病毒；其次應(yīng)知道運(yùn)用的抗生素能否對(duì)培育的植物組織有不良影響；最后要確定抗生素的運(yùn)用濃度、運(yùn)用時(shí)期和處置時(shí)

26、間的長(zhǎng)短?？股氐倪\(yùn)用只能是用作預(yù)防微生物污染的方法，而不能用于殺死微生物，因此在運(yùn)用時(shí)最好加在培育基當(dāng)中，而不宜作為一種殺菌劑單獨(dú)運(yùn)用。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已成為植物基因轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要方法，在轉(zhuǎn)基因過程中的除菌和抑菌都離不開抗生素，所以運(yùn)用抗生素已逐漸成為植物組織培育中的滅菌技術(shù)之一。六、無(wú)菌操作中其他應(yīng)留意的問題 留意防止紫外線的危害 植物組織培育室和超凈任務(wù)臺(tái)上的紫外燈開放時(shí)間不可太長(zhǎng)，最好在30min之內(nèi)。超凈任務(wù)臺(tái)上的紫外燈封鎖以后不要立刻走近任務(wù)臺(tái)，最好讓無(wú)菌風(fēng)吹23 min后再開場(chǎng)操作。 第七章 離體快速繁衍方法微繁在無(wú)菌條件下進(jìn)展植物的無(wú)性繁衍。1960年，Morel提出了一個(gè)離體

27、無(wú)性繁衍蘭花的方法，繁衍系數(shù)極高。使微繁技術(shù)真正適用化。 一、無(wú)菌培育物的建立 1、外植體的選擇：莖段、莖尖、葉片、嫩芽、鱗莖的鱗片、花器官等。 留意：1、在生長(zhǎng)季節(jié)開場(chǎng)時(shí)由活潑生長(zhǎng)的枝條上切取的外植體，通常能產(chǎn)生最好的效果。2、對(duì)于需求低溫、高溫或特殊的光周期才干突破休眠的鱗莖、球莖、塊莖和其他器官，該當(dāng)在取芽之前進(jìn)展必要的處置。2、消毒二、莖芽的增殖一莖芽增殖的類型1、器官型(organ type) 以芽增殖芽的方法，其遺傳性狀穩(wěn)定，成為目前快速繁衍中采用的主要方法。2、器官發(fā)生型(organogenesis type) 外植體先脫分化構(gòu)成愈傷組織，再分化出器官的方式。3、胚狀體發(fā)生型(e

28、mbryoid type) 體細(xì)胞增殖發(fā)育的順序與受精卵發(fā)育極為類似，經(jīng)過原胚一球形胚一心形胚一魚雷胚一子葉胚5個(gè)時(shí)期，最后發(fā)育成完好的植株。胚狀體可從愈傷組織構(gòu)成，也可不經(jīng)過脫分化直接從子葉、下胚軸和花藥培育構(gòu)成。經(jīng)過胚狀體的培育可以獲得大量的植株，大大提高繁衍率4、原球莖型(protoeomb type) 目前蘭花的快速繁衍主要靠原球莖的分化方式。 5、球莖芽型(globose stem bud type) 觀葉海棠的葉柄外表可產(chǎn)生一個(gè)個(gè)圓球形的小突起球形莖，小突起的一端產(chǎn)生芽和葉片，另一端長(zhǎng)出根，最后構(gòu)成完好的小植株。 6 塊莖型(tuber type) 花葉芋的葉片或葉柄上，先構(gòu)成類似

29、愈傷組織的小硬粒突起，并逐漸構(gòu)成粒狀的芋塊。隨后粒狀芋塊上分化出新的14個(gè)小突起。由小突起上分化出芽原基。隨著小芋塊的增大，分化出的芽也越密集并構(gòu)成許多小苗，在小苗基部與芋塊交界處分化出白色的根。 7 鱗莖型(bulb type) 百合的鱗莖切塊基部近軸面或在邊緣直接構(gòu)成帶根的小鱗莖。如卷丹鱗片的頂部、中部和基部均能誘導(dǎo)分化出小鱗莖。郁金香鱗莖旁又會(huì)分化出小鱗莖。二器官發(fā)生型 1 愈傷組織構(gòu)成的條件 誘導(dǎo)愈傷組織常用的生長(zhǎng)素是2，4一D，IAA和NAA，常用的細(xì)胞分裂素是KT和6-BA。在禾谷類植物中，只用2，4一D就能勝利地誘導(dǎo)愈傷組織。多數(shù)情況下誘導(dǎo)愈傷組織既需求生長(zhǎng)素，也需求細(xì)胞分裂素。

30、黑暗條件下有利于愈傷組織的構(gòu)成，光照對(duì)組織的愈傷化有抑制造用。 2 愈傷組織形狀的調(diào)控 優(yōu)良愈傷組織須具備的特性： (1)高度的胚性或再分化才干，以便得到再生植株；2容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系；3旺盛的自我增殖才干，以便建立大規(guī)模的愈傷組織無(wú)性系。4經(jīng)過長(zhǎng)期繼代保管不喪失胚性，以便對(duì)它們進(jìn)展各種遺傳操作。 愈傷組織情況調(diào)整的戰(zhàn)略 1選擇適當(dāng)?shù)幕蛐秃屯庵搀w。如禾谷類植物愈傷組織培育的勝利，是由于選擇了未成熟胚和幼穗作為外植體，它們的根和幼葉雖然也能構(gòu)成愈傷組織，但都是非胚性的。2選擇正確的培育基，特別是正確的植物激素種類和濃度，及二者之間正確的配比。 3采用某些特殊的理化要素

31、，改動(dòng)愈傷組織誘導(dǎo)培育基和培育條件。如在玉米幼胚愈傷組織培育中，經(jīng)過在培育基中添加5mgL或10 mgL AgNO3，抑制組織內(nèi)乙烯的作用。4復(fù)原態(tài)氮具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，硝態(tài)氮具有抑制細(xì)胞分裂的作用。添加培育基中的氨態(tài)氮(或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有機(jī)方式的復(fù)原態(tài)氮)可明顯促進(jìn)細(xì)胞分裂；添加培育基中的硝態(tài)氮或減少?gòu)?fù)原態(tài)氮，可顯著抑制細(xì)胞分裂。 3 影響莖芽分化的要素 化學(xué)要素 1細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素 在莖芽誘導(dǎo)中，2ip在通常情況下是最為有效的。2生長(zhǎng)素能抑制芽的構(gòu)成: 在煙草中，濃度低到5molL的IAA即足以完全抑制莖芽的自發(fā)分化。當(dāng)與激動(dòng)素或腺嘌呤結(jié)合運(yùn)用時(shí)，生長(zhǎng)素可以抵消它們促

32、進(jìn)莖芽構(gòu)成的作用。3赤霉素對(duì)于莖芽的分化有抑制造用:在煙草中，假設(shè)把正在分化的愈傷組織在黑暗條件下以GA3處置，時(shí)間即使短至3060min，也會(huì)減少芽的分化，而且在處置之后48h，一切的擬分生組織或莖芽全都不復(fù)存在。 物理要素 1瓊脂濃度： 在培育煙草薄層組織時(shí)，當(dāng)瓊脂為l時(shí)，只能構(gòu)成花；隨著瓊脂濃度的下降，花的構(gòu)成頻率減少，營(yíng)養(yǎng)芽的分化出現(xiàn)。在液體培育基中，那么只能愈傷化和分化營(yíng)養(yǎng)芽 ；2浸透壓： 在由馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體獲得的愈傷組織中，只需在培育基里參與0.2O.3 molL甘露醇以使浸透壓堅(jiān)持在200到400毫浸透壓摩爾時(shí)，才能夠出現(xiàn)莖芽的分化。 3光照： 高強(qiáng)度的光照對(duì)煙草莖芽的構(gòu)成有

33、抑制造用。天竺葵愈傷組織只需在光照和黑暗周期交替(1516 h光照最好)條件下才干分化莖芽，培育在延續(xù)光照下的愈傷組織總是白色的，不表現(xiàn)器官發(fā)生。光質(zhì)對(duì)器官分化也有影響。在煙草中藍(lán)光促進(jìn)莖芽分化，紅光刺激生根。 4溫度： Skoog(1944)在533的范圍內(nèi)研討了溫度對(duì)煙草愈傷組織生長(zhǎng)和分化的影響，發(fā)現(xiàn)直到33時(shí)愈傷組織的生長(zhǎng)都隨溫度的上升而添加，但只需在18時(shí)最適宜莖芽的分化，在33時(shí)不能構(gòu)成莖芽。 其他因子：培育資料的染色體組，供體植株和外植體的生理形狀，外植體的細(xì)胞發(fā)育形狀，培育物的歷史以及內(nèi)生激素程度。 三影響莖芽增殖的要素1、無(wú)機(jī)鹽程度 對(duì)有些植物來(lái)說(shuō)，MS培育基中的無(wú)機(jī)鹽程度或有

34、毒或太高。如烏飯樹的莖芽在只含14強(qiáng)度MS無(wú)機(jī)鹽的培育基中能長(zhǎng)得很好，無(wú)機(jī)鹽程度再高或是有毒或是并沒什么好效果。2、激素 CTK 為了獲得強(qiáng)壯的莖芽應(yīng)適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素濃度。細(xì)胞分裂素運(yùn)用的 濃度范圍是O.55 mgL，大多數(shù)適當(dāng)?shù)臐舛仁? 2 mgL。GA 為促使莖的伸長(zhǎng)，有時(shí)參與GA； 生長(zhǎng)素 在進(jìn)展莖芽繁衍時(shí)，IAA、NAA運(yùn)用的濃度范圍是0.11mgL。3、瓊脂 微繁所用的培育基通常都用0.6 %O.8的瓊脂固化。但在卡特蘭和大多數(shù)鳳梨科植物中，只需在液體培育基中才干把培育建立起來(lái)。運(yùn)用液體振蕩培育的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)是莖芽一邊增殖一邊彼此離散，不用用人工把成簇的莖芽切開。4、光照和溫度光的

35、作用只是滿足某些形狀發(fā)生過程的需求，因此10005000 lx的光強(qiáng)即已足夠。光周期嚴(yán)厲地說(shuō)也是不重要的。每天16 h光照8 h黑暗交替照明，即可產(chǎn)生令人稱心的效果。培育室的溫度普通恒定在25左右。 三、離體枝條的生根 1、試管內(nèi)生根 1生根培育基應(yīng)降低鹽的濃度，減少到12MS或14MS。 2誘導(dǎo)生根需求有適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素，最常用的是NAA和IBA，濃度普通為O.1 10.O mgL。3對(duì)于難生根的植物，可嘗試把它們的下端浸在高濃度生長(zhǎng)素溶液中假設(shè)干時(shí)間(由幾秒到幾小時(shí))之后，再插于無(wú)激素培育基中。4在生根培育基中減少蔗糖濃度(如減到1)和添加光照強(qiáng)度，能刺激小植株經(jīng)過光協(xié)作用制造食物的才干，以便

36、由異養(yǎng)型過渡到自養(yǎng)型。5枝條在離體條件下生根所需的時(shí)間由10d到15d不等。根長(zhǎng)15mm左右時(shí)移栽最為方便，更長(zhǎng)的根在移栽時(shí)易斷，會(huì)降低植株的成活率。 2、試管外生根 在有些植物中，可以把在離體條件下構(gòu)成的枝條當(dāng)做微插條處置，使它們?cè)谕林猩?。在這種情況下，須把插條的基部切口先用規(guī)范的生根粉或混在滑石粉中的IBA處置；有些植物如月季，那么可先在試管內(nèi)誘導(dǎo)枝條構(gòu)成根原基，然后再移栽土中，遮蔭保濕，待其生根。試管外生根由于減少了一個(gè)無(wú)菌操作步驟，因此可降低本錢。 無(wú)根苗的嫁接 試管內(nèi)嫁接(微體嫁接): 即以試管苗的0.1O.2mm長(zhǎng)的莖尖為接穗 ，以在試管內(nèi)預(yù)先培育出來(lái)的帶根無(wú)菌苗為砧木，在無(wú)菌條

37、件下借助顯微鏡進(jìn)展嫁接，之后繼續(xù)在試管內(nèi)培育，愈合后成為完好植株再移入土中。 試管外嫁接: 無(wú)籽西瓜試管苗嫁接到瓠子上后，在溫度為2530，相對(duì)濕度根本飽和的條件下，3d后傷口長(zhǎng)出愈傷組織，1周后成活并長(zhǎng)出新葉。 四、壯苗、煉苗和移栽 需壯苗、煉苗的緣由 ：試管苗生長(zhǎng)在恒溫、高濕、弱光、無(wú)菌和有完全營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的條件下，雖有葉綠素，但營(yíng)異養(yǎng)生活，在形狀解剖和生理特性上都有很大脆弱性，如無(wú)角質(zhì)層或蠟質(zhì)層，氣孔開張過大且不具備封鎖功能等。這樣的試管苗假設(shè)未經(jīng)充分鍛煉，一旦被移出試管，投入到一個(gè)變溫、低濕、強(qiáng)光、有菌和短少完全營(yíng)養(yǎng)的條件下，必定要被劇變的環(huán)境所吞噬。 壯苗： 是移栽成活的首要條件，在培育

38、基中參與一定數(shù)量的生長(zhǎng)延緩劑如多效唑(PP333)，B9或矮壯素(CCC)等，在很多種植物中都是培育壯苗的一項(xiàng)有效措施。煉苗： 壯苗之后那么須開瓶，降低瓶中濕度，加強(qiáng)光照強(qiáng)度，以便促使葉外表逐漸構(gòu)成角質(zhì)，促使氣孔逐漸建立開閉機(jī)制，促使葉片逐漸啟動(dòng)光合功能等。 移栽： 先要悄然地、徹底地洗掉沾在根上的瓊脂培育基，以免栽后發(fā)霉。要選用排水性和透氣性良好的移栽介質(zhì)，例如蛭石、河沙、珍珠巖、腐植土等。移栽后，最初1015 d要經(jīng)過噴霧或罩上透明塑料以堅(jiān)持很高的濕度(90%100)。 五、微繁中存在的一些問題 1、物種的局限性很多難于用傳統(tǒng)方法繁衍的重要樹木，包括假設(shè)干裸子植物，離體繁衍技術(shù)還未過關(guān)。2

39、、無(wú)性系變異 在商業(yè)性微繁當(dāng)中，一旦無(wú)菌培育曾經(jīng)建立，人們就禁不住以此為起點(diǎn)延續(xù)繁衍假設(shè)干世代，結(jié)果就有能夠使培育早期發(fā)生的變異(芽變或偶爾變異)累積起來(lái)。假設(shè)是經(jīng)過愈傷組織進(jìn)展微繁的話，經(jīng)過長(zhǎng)期繼代培育之后，再生植株中出現(xiàn)變異的能夠性更大。3、培育物污染在植物大規(guī)模微繁期間，即使外植體在一開場(chǎng)進(jìn)展了嚴(yán)厲的外表消毒，某些慢速生長(zhǎng)的病原菌(特別是內(nèi)生菌)能夠依然存在，但只需在培育物經(jīng)過多次繼代之后，這些污染物才表現(xiàn)出來(lái)并被人們所發(fā)現(xiàn)。4、玻璃化玻璃化景象是植物組織培育過程中特有的一種生理失調(diào)或生理病變，多數(shù)發(fā)生在植物莖尖培育和離體快繁中。玻璃苗生長(zhǎng)繁衍速度下降，最后甚至死亡。玻璃化的誘因 外植體

40、類型、培育基成分和培育條件等各種內(nèi)外要素都能夠是玻璃化景象出現(xiàn)的緣由，其中比較重要的如瓊脂用量太低或細(xì)胞分裂素濃度過高，培育溫度過高，光照缺乏以及乙烯合成添加等。 5、培育基的褐變 褐變的緣由： 由外植體的切口外表滲出的酚類物質(zhì)氧化后成為醌類物質(zhì)，使培育基變成暗褐色，從而對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。 抑制培育基褐變的措施 1、以幾天的時(shí)間間隔將外植體轉(zhuǎn)到新穎培育基上23次，在這段時(shí)間內(nèi)外植體的切口愈合，酚類物質(zhì)外滲停頓。 2、把由親本植株上直接采集的莖芽，先在一種液體培育基上培育3d，然后再在半固體培育基上培育?；蛴诮臃N的第一個(gè)星期之內(nèi)，每天改換一次液體培育基 。3、在培育基中參與一些抗氧化物，如鹽酸

41、半胱氨酸(100mgL)、抗壞血酸(50100mgL)或者是檸檬酸(150mgL)。 4、運(yùn)用可以吸收酚類化合物的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，用量普通為0.01)、活性炭(O.10.5) 。5、由于光能促進(jìn)酚的氧化，開場(chǎng)時(shí)把培育物置于暗處也能夠有助于減輕褐變的問題。6、適當(dāng)降低培育溫度。 第八章 體細(xì)胞胚胎發(fā)生一、體細(xì)胞胚(somatic embryo)或胚狀體(embryoid)的概念 指在植物組織培育中來(lái)源于一個(gè)非合子細(xì)胞、經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程構(gòu)成的具有雙極性的胚狀構(gòu)造。 胚狀體的特點(diǎn)： 1、不是兩性細(xì)胞交融的產(chǎn)物；2、 不同于孤雌胚或孤雄胚，不是無(wú)交融生殖的產(chǎn)物；3、不同于器官發(fā)生途徑

42、構(gòu)成的莖芽和根，它的構(gòu)成須閱歷與合子胚類似的發(fā)育過程，而且成熟的胚狀體是一個(gè)雙極性構(gòu)造。 二、體細(xì)胞胚發(fā)生研討的歷史離體條件下的體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程最早是在胡蘿卜中由Reinert1958和Steward等1958發(fā)現(xiàn)的。 迄今已在分屬于40余科包括裸子植物的100多個(gè)種植物中有過關(guān)于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的報(bào)道。能產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的外植體有：?jiǎn)伪扼w的小孢子；二倍體組織如莖段、子葉、莖尖、葉柄、貯藏根的韌皮部和木質(zhì)部等；三倍體的胚乳。三、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式 1、從培育中的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織階段，如石龍芮再生植株莖外表長(zhǎng)出不定胚。 2、外植體先愈傷化，然后由愈傷組織

43、細(xì)胞分化成胚，如石龍芮花器愈傷組織成胚，從愈傷組織產(chǎn)生胚狀體最為常見。 A、由外植體外層細(xì)胞直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚 B、由外植體組織內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生體細(xì)胞胚C、愈傷組織表層細(xì)胞分化為體細(xì)胞胚 D，E、多個(gè)或單個(gè)細(xì)胞構(gòu)成體細(xì)胞胚 四、體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生研討的意義 1植物細(xì)胞分化、全能性表達(dá)過程和機(jī)理等艱苦實(shí)際問題的研討提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系 ；2人工種子的制造，是促進(jìn)離體快速繁衍、實(shí)現(xiàn)田間和溫室栽培的重要途徑；3胚性愈傷組織可在適宜的條件下長(zhǎng)期保管，為處理瀕危植物挽救等問題提供了能夠；4胚性愈傷組織具有遺傳穩(wěn)定、再生頻率高的特點(diǎn)，對(duì)于基因工程非常適用； 5體胚發(fā)生過程中眾多體細(xì)胞無(wú)性系變異為突變體的挑

44、選提供了新的來(lái)源； (6)以胚性細(xì)胞為資料制備原生質(zhì)體，為細(xì)胞分化和植株再生等奠定了根底。 五、影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生的要素 1、基因型的影響 2、外植體種類：外植體的類型、所處發(fā)育和生理形狀以及取材部位等要素均影響體胚發(fā)生。甚至外植體形狀學(xué)部位也是影響要素之一。幼嫩的生殖器官較容易由外植體直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎。而幼嫩的營(yíng)養(yǎng)器官那么普通需經(jīng)愈傷組織途徑產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎。 3、預(yù)處置：在一些植物體胚誘導(dǎo)中，如預(yù)先低溫(48)貯藏12個(gè)月。4、培育基種類及其成分培育基種類 體胚誘導(dǎo)中70采用MS培育基。MS培育基中含較高程度的NH4NO3和螯合鐵。對(duì)體胚發(fā)生有促進(jìn)作用。氮源 在胡蘿卜葉柄節(jié)段培

45、育物中，只需當(dāng)培育基里含有一定數(shù)量的復(fù)原態(tài)氮時(shí)，才干出現(xiàn)胚胎發(fā)生過程。在以KN03為獨(dú)一氮源的培育基上建立起來(lái)的愈傷組織，去掉生長(zhǎng)素以后不能構(gòu)成胚。然而，假設(shè)在含有55mmolL KNO3的培育基中參與少量(5mmolL)NH4C1形狀的氮，胚胎發(fā)育過程就會(huì)出現(xiàn)。 碳源 作為外植體的浸透壓調(diào)理物和體胚發(fā)育的能源物質(zhì)，碳源對(duì)體胚發(fā)生有重要影響。在柑橘體胚發(fā)生中，適當(dāng)濃度的甘油大大刺激了愈傷組織的生長(zhǎng)和胚胎發(fā)生，而且能獲得同步控制。蘋果離體葉片培育時(shí)，在保證碳源供應(yīng)的前提下，降低蔗糖濃度有利于直接體胚發(fā)生。高濃度的鉀 在野生胡蘿卜中，高濃度的鉀(20mmolL)是胚胎發(fā)生所必需的。培育基中溶解氧

46、在培育基中溶解氧的含量應(yīng)低于一個(gè)臨界值(1.5mgL)，否那么將有利于生根，而不利于成胚。這是由于低程度的溶解氧在細(xì)胞內(nèi)會(huì)導(dǎo)致高程度的ATP。假設(shè)參與ATP，那么有能夠取代對(duì)低程度溶解氧的需求。 活性炭 在培育基中參與活性炭也能提高胡蘿卜細(xì)胞胚胎發(fā)生的頻率。酵母提取物在培育基中參與酵母提取物能提高胡蘿卜細(xì)胞胚胎發(fā)生的頻率。植物激素 生長(zhǎng)素類：多數(shù)植物誘導(dǎo)胚性愈傷組織需用2.4一D，特別是單子葉植物。而且胚性細(xì)胞發(fā)育時(shí)還必需及時(shí)降低或去掉2，4一D。但低濃度的生長(zhǎng)素是大多數(shù)植物誘導(dǎo)體胚發(fā)生所必需的。細(xì)胞分裂素類：許多植物體胚發(fā)生的誘導(dǎo)必需參與外源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，CTK在裸子植物中起著比生長(zhǎng)素

47、更重要的作用。3零落酸：外源ABA可促進(jìn)枸杞、石刁柏等胚性愈傷組織的構(gòu)成和體胚的發(fā)生。堅(jiān)持秈稻愈傷組織的胚性構(gòu)造，并使其綠苗分化率明顯提高。(4)乙烯及多胺： 低濃度的乙烯利顯著刺激胚胎發(fā)生，高濃度那么抑制胚胎發(fā)生。 外源多胺或其前體可使人參體胚發(fā)生數(shù)添加4倍；外源Put使茄子體胚發(fā)生數(shù)添加6倍，并伴隨內(nèi)源Put添加，而抑制多胺合成和降解那么使體胚發(fā)生數(shù)減少。5赤霉素：抑制許多植物胚狀體的發(fā)生，但對(duì)胚狀體的進(jìn)一步發(fā)育成熟及胚的萌生效果很好 5、培育條件 暗培育對(duì)體胚發(fā)生過程中的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及胚狀體的發(fā)生、發(fā)育和成熟非常關(guān)鍵。 六、體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的生理生化變化 1、ATP酶活性提高，且

48、早期的胚性細(xì)胞中ATP酶反響產(chǎn)物主要堆積于質(zhì)膜和液泡膜上，后期ATP酶活性轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)、液泡和細(xì)胞核中。2、在多數(shù)植物的SE發(fā)生中過氧化物酶(POD)的活性較高，同工酶的種類較多。在大麥中POD、酯酶和酸性磷酸酶同工酶的結(jié)合運(yùn)用可以作為SE發(fā)生的標(biāo)志酶。3、胚性愈傷組織中的可溶性蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織；而非胚性細(xì)胞的游離氨基酸高于胚性細(xì)胞。4、胚性愈傷組織中都存在45KD至55KD的胚胎發(fā)生特異性蛋白質(zhì)的合成。5、體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育過程中，不僅RNA合成速率遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織，且RNA種類豐富。隨著體細(xì)胞胚發(fā)育的進(jìn)程，DNA合成量明顯添加，至球形胚時(shí)DNA的合成量到達(dá)峰值。 6、內(nèi)源激

49、素含量的變化 內(nèi)源IAA含量上升并維持在較高程度是胚性細(xì)胞出現(xiàn)的一個(gè)共同標(biāo)志；在胚發(fā)生早期，較高程度的內(nèi)源CTK對(duì)體胚發(fā)生似乎是必需或有益的；內(nèi)源ABA有利于體胚發(fā)育和成熟。低程度乙烯有利于胚性才干的啟動(dòng)或表達(dá)，高程度乙烯抑制體胚發(fā)生。高程度多胺促進(jìn)體胚發(fā)生。在皇冠草體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，GA3的變化趨勢(shì)和細(xì)胞分裂素根本一樣。 七、人工種子 Murashige于1978年在國(guó)際園藝植物學(xué)術(shù)討論會(huì)上首先提出人工種子的概念。指將植物離體培育中產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或能發(fā)育成完好植株的分生組織芽、愈傷組織等包埋在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和具有維護(hù)功能的外殼內(nèi)構(gòu)成的在適宜條件下可以發(fā)芽出苗的顆粒體。完好的人工種子包括體胚、人

50、工胚乳和人工種皮。 Kitto等用聚氯乙烯包裹胡蘿卜胚狀體于1981年初次制成了人工種子。我國(guó)于1995年初次制成了特種稻的人工種子。我國(guó)將其列入國(guó)家863方案。經(jīng)過20余年的研討，人工種子的研討獲得了很大進(jìn)展，已能在有菌條件下發(fā)芽成苗或用于大田和溫室消費(fèi)。 一研制人工種子的意義 1、快速繁衍遺傳工程植物、自交不親合植物、稀有珍貴物種或遠(yuǎn)緣雜種等； 2、在人工種子的制造過程中還可加人多種生長(zhǎng)調(diào)理劑、有益微生物、農(nóng)藥、除草劑等以提高種類的抗逆境才干；3、人工種子還具有節(jié)約種源、不占用土地，一年四季均可工廠化消費(fèi)的特點(diǎn) 。二人工種子的研討現(xiàn)狀 早期的人工種子研討僅限于胡蘿卜、苜蓿、芹菜等方式作物，

51、當(dāng)時(shí)包埋的資料僅胚狀體；而目前研討范圍己轉(zhuǎn)向水稻、甘薯、棉花等具重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的糧食作物；包埋資料除用胚狀體外還有胚類似物，即用芽、短技、愈傷組織、花粉胚。用這類資料包埋的人工種子變異小、萌生率和成苗率高。如以腋芽為資料進(jìn)展人工種子研討的作物有煙草和花葉芋，也有用毛狀根為培育物制造人工種子的研討 。三人工種子的包埋 Redenhaugh于1984年初次挑選出透水性好的海藻酸鈉作為胚狀體和不定芽的包埋劑。 海藻酸鈉(23.2，WV)在室溫下為液體。當(dāng)體細(xì)胞胚與藻酸鈉混合以后，再滴入到硝酸鈣或氯化鈣溶液(100 mmolL)中，30 min內(nèi)外表即可完全絡(luò)合，構(gòu)成一層耐久的種皮(圖8.4)。此外，在

52、種皮基質(zhì)中還可參與一些對(duì)體細(xì)胞胚有益的物質(zhì)，如能促進(jìn)生長(zhǎng)的微生物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)調(diào)理物質(zhì)、殺蟲劑，以及用于旱地播種的親水性化合物等，作為人工胚乳。 第九章 植 物 脫 毒 技 術(shù)脫毒的重要性 有許多優(yōu)良的傳統(tǒng)種類，由于長(zhǎng)期栽培，尤其是維護(hù)地栽培面積不斷擴(kuò)展，植物周年生長(zhǎng)，寄主與病原媒介密度添加，導(dǎo)致病害日益嚴(yán)重。其中以病毒病最難控制，成為當(dāng)前消費(fèi)上的嚴(yán)重問題。 病毒的侵染，抑制植株生長(zhǎng)，使形狀畸變，產(chǎn)生伸展、花葉、雜斑、條斑等多種病癥，產(chǎn)量下降，質(zhì)量變劣。對(duì)無(wú)性繁衍作物危害更甚，如薯類、大蒜、生姜、芋頭、草莓和花卉等。受病毒侵染的植株，可經(jīng)無(wú)性繁衍器官傳至下一代。病毒隨繁衍代數(shù)添加而綿延不絕，

53、日益增殖，結(jié)果導(dǎo)致植物種性退化，甚至使一些珍稀種類瀕臨絕滅。 植物脫毒技術(shù)的歷史 第一株植物脫毒苗是1952年由法國(guó)人Morel等經(jīng)過大麗花莖尖組織培育獲得的。1955年他們又獲得了馬鈴薯脫毒苗。20世紀(jì)70年代，幾乎一切消費(fèi)馬鈴薯的國(guó)家都在消費(fèi)中運(yùn)用這一技術(shù)。病毒傳染的途徑 1、非介體傳播 經(jīng)過感病植株本身的有性或無(wú)性繁衍資料完成的傳染作用。是植物病毒從感病寄主體經(jīng)過機(jī)械摩擦呵斥的微傷(稱機(jī)械汁液傳染)，或經(jīng)過感病和無(wú)病寄主體細(xì)胞間的有機(jī)結(jié)合傳染的，如帶病的鱗莖、塊莖、塊根、插條、嫁接苗、種子和花粉等。目前了解到由種子傳染的病毒有104種，花粉傳染的病毒有10多種。機(jī)械摩擦主要指田間病健株間

54、的相互摩擦，或人為的接觸摩擦。 2、介體傳播經(jīng)過帶毒或感染的昆蟲或其他生物介體而完成的傳染作用。介體傳播主要是昆蟲，其次是線蟲、螨類和真菌。介體傳毒?；詷O強(qiáng)， 一、蝴蝶蘭種苗消費(fèi)概略蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)在中國(guó)的興起不過十余年，作為花卉業(yè)中的一個(gè)新興類別，蝴蝶蘭不斷遭到中國(guó)花卉市場(chǎng)的喜歡。 目前，歐洲、美國(guó)、日本、韓國(guó)是世界主要的蝴蝶蘭消費(fèi)市場(chǎng)。僅在2005年，全球蝴蝶蘭消費(fèi)量已到達(dá)1.5億株，估計(jì)到2021年，全球?qū)m的需求量將達(dá)2.5億株左右。全球蝴蝶蘭種苗的大幅度增長(zhǎng)主要得益于以荷蘭為代表的歐洲市場(chǎng)和美國(guó)市場(chǎng)的強(qiáng)勁需求。從2004年起，荷蘭市場(chǎng)蝴蝶蘭消費(fèi)量從3500萬(wàn)株上升到2006年的800

55、0多萬(wàn)株。2007年估計(jì)需求在1億株；在美國(guó)蝴蝶蘭已全年消費(fèi)額接近2億美圓。 2006年，國(guó)內(nèi)蝴蝶蘭市場(chǎng)的產(chǎn)量約在4500萬(wàn)株，其中60%左右用于出口，但主要集中在瓶苗與大、中、小苗。國(guó)內(nèi)消費(fèi)的蝴蝶蘭不到2000萬(wàn)株，相對(duì)于寬廣的市場(chǎng)與人口基數(shù)，國(guó)內(nèi)蝴蝶蘭市場(chǎng)還有很大的拓展空間。隨著世界蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)向中國(guó)轉(zhuǎn)移，中國(guó)將成為全球蝴蝶蘭的第一大消費(fèi)基地。二、蝴蝶蘭病毒病種類和病癥1. 病毒種類 蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬植物，因此與蘭科其他屬植物6個(gè)亞科725屬約25000多個(gè)種具有一樣的病毒。 病毒病問題日趨嚴(yán)重 世界范圍內(nèi)已報(bào)道從各種栽培蘭科植物中分別出至少25種病毒。Magee1943最早記載蘭科花卉

56、病毒病。1900 年出版的蘭科植物圖譜上有類似齒蘭環(huán)斑病毒的病癥。 蘭花病毒病分布情況差別極大，但是建蘭花葉病毒Cymbidium mosaic virus， CymMV )和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV )幾乎普及全世界，所以圍繞一些蘭科花卉病毒的研討任務(wù)最主要集中于建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒。 據(jù)報(bào)道，目前國(guó)內(nèi)90蝴蝶蘭種苗帶有以上兩種病毒，臺(tái)灣消費(fèi)的種苗有70帶毒，嚴(yán)重影響到種苗質(zhì)量。Feritas-Astua(1999)等從在圣保羅巴西商貿(mào)農(nóng)場(chǎng)獲得17個(gè)國(guó)家的1777個(gè)樣本用PTA-ELISA和電鏡檢測(cè)CyMV ，ORSV， CMV，

57、CymRSV，VMV (vanilla mosaic)，得出CyMV、ORSV是主要侵染蘭花病毒的，而沒有一個(gè)樣本感染了CMV， CymRSV和 VanMV。 鄭平等1999利用ELISA方法對(duì)426個(gè)熱帶蘭花種類檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了建蘭花葉病毒(CyMV)總感病率為38.0，齒舌蘭屬環(huán)斑病毒(ORSV) 總感病率為27.7，其中蝴蝶蘭、卡特利亞蘭、文心蘭兩種病毒感病率均較高，石斛蘭感病率較低，對(duì)兩種病毒具較強(qiáng)的抗性；大花蕙蘭易感ORSV，感病率高達(dá)42.8。2、主要病毒危害病癥：1 建蘭花葉病毒(CyMV)： 屬于馬鈴薯X病毒屬，能使蘭科花卉產(chǎn)生褪綠斑點(diǎn)及壞死斑，蝴蝶蘭表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)病斑，到開花時(shí)，植

58、株出現(xiàn)花朵畸形、花瓣缺、小花簇生于花梗同一部位等病癥。病癥：植株經(jīng)常產(chǎn)生壞死病癥的傾向，如黑色壞死斑點(diǎn)、壞死條紋等。感病植株除葉部、莖部產(chǎn)生壞死外，花部也會(huì)產(chǎn)生壞死，這是CyMV病毒特有的病癥。壞死斑有時(shí)只出現(xiàn)于葉片下外表而不發(fā)生于上外表，也會(huì)產(chǎn)生黃綠斑駁的嵌紋或黃化條斑形病癥。另外也有部分蘭花種類感染后并不表現(xiàn)任何可識(shí)別病癥。 病毒特性及傳播方式： CyMV在細(xì)胞外的穩(wěn)定性雖然不及煙草花葉屬TMV的病毒，但也是知病毒中性質(zhì)極為穩(wěn)定的一屬。其顆粒體稍可彎曲，長(zhǎng)度約為450nm，細(xì)胞外耐熱溫度為60至70，在室溫條件下可存活25天。 目前尚未發(fā)現(xiàn)可以傳播CyMV的媒介昆蟲，其傳播途徑由機(jī)械性傷口

59、入侵及感染。2齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)： 屬煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，主要危害齒蘭、建蘭、蝴蝶蘭等。蘭科花卉一旦感染ORSV，其葉片常產(chǎn)生黃化條紋或不規(guī)那么褪綠色斑塊，病株花部甚至出現(xiàn)畸形或褪色斑，紅色系花朵褪色斑尤為明顯。可以感染ORSV的蘭花種類超越20個(gè)屬以上。不同的蘭屬或蘭種所產(chǎn)生的病癥會(huì)有所差別。蝴蝶蘭、文心蘭、卡特蘭等易被齒舌蘭環(huán)斑病毒感染，尤其是蝴蝶蘭。 齒蘭環(huán)斑病毒最早在文獻(xiàn)上記載的病癥是環(huán)斑，另外花葉、斑紋、黃化條紋、花樣條斑等。在這些病癥中以花葉與斑紋最為常見。CyMV和ORSV復(fù)合感染同一蘭株的景象極為普遍，病癥會(huì)遠(yuǎn)比單一病毒感染時(shí)嚴(yán)重許多。可以感染ORS

60、V的蘭花種類超越20個(gè)屬以上。不同的蘭屬或蘭種所產(chǎn)生的病癥會(huì)有所差別。蝴蝶蘭、文心蘭、卡特蘭等易被齒舌蘭環(huán)斑病毒感染，尤其是蝴蝶蘭。 病毒特性及傳播方式： ORSV為煙草花葉病毒屬Tobamovirus的一種。顆粒體為短硬桿狀，長(zhǎng)度約300nm。該屬病毒的共同特性是性質(zhì)極其穩(wěn)定，在寄主細(xì)胞外耐熱性強(qiáng)，在高達(dá)95的溫度下，仍可存活相當(dāng)時(shí)日。本病毒主要由機(jī)械性傷口入侵植物體內(nèi)，在組織培育或溫室栽培管理過程中，一切能夠呵斥外表傷口的操作，包括切花梗、修剪，甚至植株葉片間的磨擦，都能夠成為病毒入侵感染的途徑。尚未證明齒舌蘭環(huán)斑病毒可被任何專注性的媒介昆蟲傳播。3黃瓜花葉病毒Cucumber Mosai