高效課堂同步課件：5-2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段（選修1）

1、課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課程標(biāo)準(zhǔn)嘗試PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。課標(biāo)解讀1.理解PCR技術(shù)的基本原理。2.知道PCR技術(shù)的基本操作過(guò)程。3.討論P(yáng)CR技術(shù)的應(yīng)用。 1生物體內(nèi)DNA分子復(fù)制的條件(1)四種 是合成子鏈的原料。(2) 提供了DNA復(fù)制的模板。(3) 打開(kāi)了DNA雙鏈。(4) 催化合成DNA子鏈。(5) 使DNA聚合酶能夠從 開(kāi)始連接脫氧核苷酸。PCR技術(shù)的原理及反應(yīng)過(guò)程 脫氧核苷酸DNA母鏈解旋酶DNA聚合酶引物引物的3端2PCR擴(kuò)增的原理及條件(1)概念PCR即 ，是一種 迅速 的技術(shù)。它能以極少量的 為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的 。(2)原理DNA的熱變性：在

2、 的溫度范圍內(nèi)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為 。當(dāng)溫度緩慢 后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新 。子鏈的合成：a.需要 ；b.合成方向總是從子鏈的 端向 端延伸。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增DNA片段DNADNA拷貝80100變性降低結(jié)合成雙鏈引物53(3)條件 模板。分別與模板DNA兩條模板鏈相結(jié)合的兩種 。A、T、G、C四種 。耐熱DNA聚合酶，一般用 。需要一定的 和能?chē)?yán)格控制 的溫控設(shè)備。DNA引物脫氧核苷酸耐高溫的TaqDNA聚合酶緩沖溶液溫度3PCR反應(yīng)過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷 次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、 和 三步。(1) ：當(dāng)溫度上升到 以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。(2

3、) ：溫度下降到 左右， 通過(guò) 與兩條單鏈DNA結(jié)合。(3) ：溫度上升到 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在 的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。三十多變性復(fù)性延伸變性90復(fù)性50兩種引物堿基互補(bǔ)配對(duì)延伸72DNA聚合酶思維激活1 DNA復(fù)制緣何必須有引物？提示DNA聚合酶不能從頭合成DNA，而只能以3延伸DNA鏈，故DNA合成時(shí)，必須加入引物(其3游離)以作為延長(zhǎng)DNA子鏈的“引子”。1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和細(xì)胞外PCR擴(kuò)增的比較(見(jiàn)下表)項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR擴(kuò)增不同點(diǎn)場(chǎng)所細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐熱的TaqDNA聚合酶是否有轉(zhuǎn)錄伴有轉(zhuǎn)錄、

4、產(chǎn)生引物無(wú)轉(zhuǎn)錄、需加入兩種引物特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多次緩沖液不需要需要人為控制設(shè)備無(wú)需要嚴(yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備相同點(diǎn)原料四種脫氧核苷酸復(fù)制原理嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則模板DNA為模板引物都需要與模板相結(jié)合的引物2.PCR過(guò)程(1)變性當(dāng)溫度上升到90 以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。(2)復(fù)性溫度下降到50 左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。(3)延伸溫度上升到72 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。特別提醒(1)72 左右時(shí)，TaqDNA聚合酶有最大活

5、性，可使DNA新鏈由5端向3端延伸。(2)DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使該段固定長(zhǎng)度的序列呈“指數(shù)式”擴(kuò)增?！眷柟?】 標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是()。A94 、55 、72 B72 、55 、94 C55 、94 、72 D80 、55 、72 解析當(dāng)溫度上升到90 (9096 )以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，稱(chēng)之為變性；當(dāng)溫度下降到50 (4060 )左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合；當(dāng)溫度上升到72 (7075 )時(shí)，溶液中的四種脫氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合

6、成新的DNA鏈，稱(chēng)為延伸。答案A1實(shí)驗(yàn)用具(1)PCR儀：該儀器能自動(dòng)調(diào)控 ，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。如果沒(méi)有PCR儀，可用3個(gè) 代替，操作時(shí)按程序在3個(gè) 中 PCR反應(yīng)的微量離心管。(2)微量離心管：總?cè)莘e為 ，實(shí)際上是進(jìn)行 的場(chǎng)所。(3)微量移液器：用于 。PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作及評(píng)價(jià) 溫度恒溫水浴鍋水浴鍋來(lái)回轉(zhuǎn)移0.5mL多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體2操作步驟準(zhǔn)備 混合 反應(yīng)。3操作提示(1)為避免 等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行 。(2)所用的 和 應(yīng)分裝成小份，并在 儲(chǔ)存。(3)在 中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須 。加入組分設(shè)置PCR的循環(huán)

7、程序外源DNA高壓滅菌緩沖液酶20微量離心管更換思維激活2 PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要旋轉(zhuǎn)酶嗎？提示PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但該解旋過(guò)程不是DNA解旋酶催化的結(jié)果，而是利用DNA熱變性的原理，在80100 溫度范圍內(nèi)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，以此達(dá)到解旋的目的。1PCR儀：PCR自動(dòng)化程度較高，參照下表設(shè)計(jì)程序即可。循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第1次94 ，10 min30次94 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一次94 ，1 min55 ，30 s72 ，1 min (將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10 s。目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部) 3實(shí)驗(yàn)中D

8、NA含量的測(cè)定DNA在260 nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)?？梢岳肈NA這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定，具體方法如下：稀釋?zhuān)?LPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對(duì)照調(diào)零：以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260 nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零測(cè)定：取DNA稀釋液100L至比色杯中，測(cè)定260 nm處的光吸收值計(jì)算：DNA含量(g)50(260 nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)特別提醒若沒(méi)有PCR儀，可進(jìn)行水浴擴(kuò)增DNA設(shè)置3個(gè)恒溫水浴鍋，溫度分別為94 、55 和72 ，在3個(gè)水浴鍋中依據(jù)PCR儀的處理時(shí)間來(lái)回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管即可?！眷柟?/p>

9、2】 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，其簡(jiǎn)要過(guò)程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是()。APCR技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù)B反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板CPCR技術(shù)中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴(kuò)增D應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測(cè)基因突變解析PCR技術(shù)是人工合成DNA的方法，原料是脫氧核苷酸而不是核糖核苷酸。答案C【例1】 (2011江蘇)請(qǐng)回答有關(guān)問(wèn)題。(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類(lèi)

10、似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。PCR技術(shù)的原理 從理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為_(kāi)。在第_輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。(2)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。第1組：_；第2組：_。(3)PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開(kāi)。思維導(dǎo)圖：歸納提升PCR技術(shù)特點(diǎn)：(1)PCR不需要解旋酶，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)需要解旋酶；(2)PCR需要耐熱的DNA聚合酶，而生物體內(nèi)DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；(3)PCR一般需經(jīng)三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的控制。【例2】 使用PCR儀具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為()。設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程